一种烟草拟茎点霉菌快速检测方法和应用

摘要

本发明提供一种烟草拟茎点霉菌快速检测方法及其应用，该烟草拟茎点霉菌快速检测方法包括以下步骤：基因组DNA的提取；特异性引物的设计；特异性引物的检测；特异性引物灵敏度检测；本发明的烟草拟茎点霉菌快速检测方法可以快速、特异、灵敏性的检测到烟草拟茎点属真菌的分子信息，仅仅通过对低到10pg的病原菌基因组DNA进行一个PCR反应就可以做到；弥补了以往单纯通过菌种分离培养，进行形态学分析确认所需要的时间过长的不足，又避免了由于症状的不易区分而导致病害防治的延误，同时可以通过痕量的病原菌存在就可以及时准确检测到病原菌，有利于病害防控和预警，同时为拟茎点霉菌的进一步研究提供科学依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种烟草拟茎点霉菌快速检测方法和应用。

背景技术

近年来，由于烟草栽培面积的扩大、连轮作以及品种单一等一系列的问题，导致烟草病害呈现多发或者愈加严重的趋势。烟草病害一直是制约烟草生产的重要因素，病菌种类复杂，引发镰刀菌枯萎病、黑胫病、根黑腐病以及由拟茎点菌属引起的拟茎点霉茎枯病等，危害严重。

传统的真菌鉴定方法一直以来主要以形态学为依据，通过培养后观察菌落形态特征，显微镜观察结构特征，是否产孢，生理生化特征等等。然而病原真菌种类之繁多，各种形态特征呈现并不一样或者不明显，而且还有可能随着环境因素的变化而不稳定的表现出不同的形态学特征。

拟茎点霉是半知菌亚门、腔孢纲、球壳孢目中的一个重要真菌属，有性态是间作壳属，是植物上重要的病原菌和内生真菌，该属真菌已描述900多种，可引起多种病害，呈世界性分布。其种类多、分布广、热带和亚热带地区种类尤其多。主要危害被子植物和裸子植物，有时还可侵染苔藓和蕨类植物，引起茎枯、溃烂、根腐，叶枯等多种症状。传统的形态学分类方法不便于区分症状相似的病害。姜淑霞等在山东泰安、临沂等地发现一种新病原菌，经过形态学鉴定和rDNA-ITS序列比对，将其定名为板栗拟茎点霉（P.castaneae-mollissimae）。纪兆林等结合形态鉴定、rDNA-ITS序列比较和致病性测定结果，确定了江苏和浙江桃枝枯病病原为桃拟茎点霉（P.amygdali），明确了新发现的严重危害桃树的病原种类。岳清华等首次在山东省发现一种蓝莓枯枝病害，通过rDNA-ITS序列同源比对分析确定该病原菌为乌饭树拟茎点霉（P.vaccinii），即越橘间座壳（D.vaccinii）的无性阶段。孙俊等对辽宁省葫芦岛市建昌县核桃枝枯病进行研究，将待测菌株rDNA-ITS序列进行同源性比较，确定病原菌为胡桃楸拟茎点霉（P.juglandina）。

苗圃在2013年首次报道了烟草拟茎点霉引起的烟草茎枯病为烟草新病害。近年来，拟茎点霉也成为了烟草上日益严重的真菌病害，烟草真菌病害多为混合发病，病害症状往往较为相似，难以简单通过病症判断为具体何种病原菌引起的烟草枯萎或腐坏，很有必要为烟草的拟茎点病菌建立一套快速灵敏的分子检测技术体系。本研究利用烟草拟茎点菌基因组rDNA-ITS区域设计特异检测引物，能够快速检测出烟草拟茎点属病菌，为病害的防治和病情预警提供有力工具。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种烟草拟茎点霉菌快速检测方法和应用。

本发明采用的技术方案为：

一种烟草拟茎点霉菌快速检测方法，包括以下步骤：

（1）基因组DNA的提取：对11种病菌基因组DNA进行提取；

（2）特异性引物的设计：利用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1和ITS4对上述11种病菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增并测序，共得到11条序列信息，通过DNAMAN 软件进行比对分析，选择在所有序列碱基差异较大的区域设计2对特异性上下游引物P2F/P3R和P3F/P3R；

（3）特异性引物的检测：将上述设计的引物P2F/P3R和P3F/P3R对上述11个病菌基因组DNA和阴性对照水（ddH

（4）特异性引物灵敏度检测：采用10倍浓度稀释法将烟草拟茎点病菌的基因组DNA模板依次稀释成系列浓度梯度模板，对所设计的引物进行PCR扩增以检验引物灵敏度。

所述的步骤（1）中的供试的11种病菌分别为：球腔菌属、茄病镰刀菌、层出镰刀菌、灰葡萄孢、拟茎点霉属、疫霉菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、交链孢、茎点霉属、刺盘孢菌。

所述的步骤（3）中的PCR扩增条件为：反应总体积20μL，其组分为：2×PCR mixture10μL，模板DNA 1μL，引物各1μL ，ddH

所述的步骤（3）中的PCR扩增的反应程序：94℃热变性5min；进入循环，94℃变性45s，60℃退火40s，72℃延伸45s，40个循环；最后延伸72℃10min。

所述的步骤（4）中的DNA模板的稀释采用灭菌超纯水（ddH

一种如上所述的烟草拟茎点霉菌快速检测方法的应用，用于快速检测烟草拟茎点霉菌，当PCR体系中含有10pg模板时，特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R都能扩增出清晰目的条带，引物灵敏度较高。

本发明的有益效果是：本发明的烟草拟茎点霉菌快速检测方法可以快速、特异、灵敏性的检测到烟草拟茎点属真菌的分子信息，仅仅通过对低到10pg的病原菌基因组DNA进行一个PCR反应就可以做到；弥补了以往单纯通过菌种分离培养，进行形态学分析确认所需要的时间过长的不足，又避免了由于症状的不易区分而导致病害防治的延误，同时可以通过痕量的病原菌存在就可以及时准确检测到病原菌，有利于病害防控和预警，同时为拟茎点霉菌的进一步研究提供科学依据。

附图说明

图1为本发明的病原菌rDNA-ITS序列比对及特异性引物P2F/P3R位点。

图2为本发明的病原菌rDNA-ITS序列比对及特异性引物P3F/P3R位点。

图3为本发明的引物P2F/P3R特异性结果，图中M: DL2000 DNA Marker; 1. Ac;2. Fs; 3. Fp; 4. Bc; 5. Pn; 6. Ph;7. Fo; 8. Fv; 9.Aa; 10. Sp; 11. Ccn; CK:ddH

图4为本发明的引物P3F/P3R特异性结果，图中M: DL2000 DNA Marker; 1. Ph ;2.Ac; 3. Fs; 4. Fp; 5. Bc; 6. Pn; 7.Fo; 8.Fv; 9.Aa; 10.Sp; 11.Ccn; CK: ddH

图5为本发明的P2F/P3R引物灵敏度结果，图中M: DL2000 DNA Marker; 1. 100ng/μL; 2. 10ng/μL; 3. 1ng/μL; 4. 100 pg /μL; 5. 10pg /μL; 6. 1pg /μL; 7. 100fg /μL; 8. 10 fg /μL; CK: ddH

图6为本发明的P3F/P3R引物灵敏度结果，图中M: DL2000 DNA Marker; 1. 100ng/μL; 2. 10ng/μL; 3. 1ng/μL; 4. 100 pg /μL; 5. 10pg /μL; 6. 1pg /μL; 7. 100fg /μL; 8. 10 fg /μL; CK: ddH

具体实施方式

如图1-6所示，一种烟草拟茎点霉菌快速检测方法，包括以下步骤：

（1）基因组DNA的提取：对11种病菌基因组DNA进行提取；

（2）特异性引物的设计：利用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1和ITS4对上述11种病菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增并测序，共得到11条序列信息，通过DNAMAN 软件进行比对分析，选择在所有序列碱基差异较大的区域设计2对特异性上下游引物P2F/P3R和P3F/P3R；

（3）特异性引物的检测：将上述设计的引物P2F/P3R和P3F/P3R对上述11个病菌基因组DNA和阴性对照水（ddH

（4）特异性引物灵敏度检测：采用10倍浓度稀释法将烟草拟茎点病菌的基因组DNA模板依次稀释成系列浓度梯度模板，对所设计的引物进行PCR扩增以检验引物灵敏度。

所述的步骤（1）中的供试的11种病菌分别为：球腔菌属、茄病镰刀菌、层出镰刀菌、灰葡萄孢、拟茎点霉属、疫霉菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、交链孢、茎点霉属、刺盘孢菌。

所述的步骤（3）中的PCR扩增条件为：反应总体积20μL，其组分为：2×PCR mixture10μL，模板DNA 1μL，引物各1μL ，ddH

所述的步骤（3）中的PCR扩增的反应程序：94℃热变性5min；进入循环，94℃变性45s，60℃退火40s，72℃延伸45s，40个循环；最后延伸72℃10min。

所述的步骤（4）中的DNA模板的稀释采用灭菌超纯水（ddH

一种如上所述的烟草拟茎点霉菌快速检测方法的应用，用于快速检测烟草拟茎点霉菌，当PCR体系中含有10pg模板时，特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R都能扩增出清晰目的条带，引物灵敏度较高。

实施例

1.1 供试菌株

2016-2018年在河南省烟草主产区采集的烟草常见的真菌病菌，在实验室通过分离鉴定出烟草上的11种病菌（表1）。本研究中所用的烟草常见病菌均来自于河南省农业科学院烟草研究所实验室惠赠。

1.2 基因组DNA的提取

利用真菌基因组提取方法（CTAB法）对供试11种病菌基因组DNA进行提取，提取的DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用超微量分光光度计（NanoDrop 2000）测量提取DNA的OD

PCR扩增条件的优化

最适退火温度的筛选：将2对引物分别对供试的11个病原菌DNA和阴性对照进行温度梯度PCR检测，在55℃，60℃，65℃退火温度条件下分别进行扩增。结果显示：在60℃退火温度条件下，通用引物ITS1和ITS4对11种病菌的和阴性对照的扩增结果显示目的条带单一且扩增效率高；特异引物P2F/P3R和P3F/P3R在60℃退火温度条件下只将烟草拟茎点病菌作为模板的DNA分别扩增出一条420bp和一条381bp的特异性单一条带，其它10个对照菌和灭菌超纯水阴性对照均未扩增出来条带。因此，将60℃选为最适退火温度。

1.3 特异性引物的设计

利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS1和ITS4对病原菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增并测序，共得到11条序列信息，通过DNAMAN 软件进行比对分析，选择在所有序列碱基差异较大的区域设计了2对特异性上下游引物P2F/P3R和P3F/P3R（表2）。用PrimerPremier 5.0软件进行检测。

在60℃退火条件下，经过PCR扩增，克隆，测序共计获得11条DNA序列，将测序序列进行比对分析，设计特异性扩增引物，如图1为病原菌rDNA-ITS序列比对及特异性引物P2F/P3R位点，图2为病原菌rDNA-ITS序列比对及特异性引物P3F/P3R位点。

1.4 引物特异性检测

将上述设计的引物对供试11个病菌基因组DNA和阴性对照水（ddH

如图3所示，利用设计的特异性引物对P2F/P3R对11种烟草常见病原菌DNA进行PCR扩增检测，有且仅有拟茎点霉菌的DNA能够扩增得到一条420bp的清晰条带；如图4所示，引物对P3F/P3R对11种烟草常见病原菌DNA进行PCR扩增检测，有且仅有拟茎点霉菌的DNA能够扩增得到一条381bp的清晰条带。

1.5 特异性引物灵敏度检验

采用10倍浓度稀释法将烟草拟茎点病菌的基因组DNA模板依次稀释成系列浓度梯度模板。用灭菌超纯水（ddH

以系列浓度的烟草拟茎点霉属的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果如图5和图6所示，当PCR体系中含有10pg模板时，特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R就能扩增出清晰目的条带，引物灵敏度较高。

分子生物学技术的发展以及测序技术的日趋成熟，利用DNA序列分析对病原真菌进行检测鉴定成为最有效的手段方法。rDNA-ITS序列区段包含了较多的遗传信息，ITS序列在进化速率上相对比较保守，而内转录间隔区则进化速率较快，在真核生物中表现出极大的序列多态性，可提供丰富的信息位点和变异位点，因此能够获得相对足够的信息反映菌种之间的亲缘进化关系。

本研究利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS1和ITS4对病原菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增测序，得到一系列病原真菌基因组信息。通过序列比对分析发现，发现烟草常见的11种病原真菌基因组该区段序列相似度极高，特异性引物设计难度较大。本研究通过多次实验验证，最终设计出能够特异性检测拟茎点霉菌的高灵敏性的引物，建立了烟草拟茎点霉菌的高效检测方法。

该方法可以快速、特异、灵敏性的检测到烟草拟茎点属真菌的分子信息，仅仅通过对低到10pg的病原菌基因组DNA进行一个PCR反应就可以做到。弥补了以往单纯通过菌种分离培养，进行形态学分析确认所需要的时间过长的不足，又避免了由于症状的不易区分而导致病害防治的延误，同时可以通过痕量的病原菌存在就可以及时准确检测到病原菌，有利于病害防控和预警，同时为拟茎点霉菌的进一步研究提供科学依据。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 一种烟草拟茎点霉菌快速检测方法和应用

<130> 20210402

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<170> PatentIn version 3.3

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