一种基于酪胺-β-羟化酶催化产章鱼胺的方法

摘要

本发明公开了一种基于酪胺‑β‑羟化酶催化产章鱼胺的方法，该方法具体包括以下步骤：生成表达酪胺‑β‑羟化酶的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a‑TBH；培养基因工程菌BL21(DE3)/pET28a‑TBH和诱导表达TBH；收集上述菌体，用缓冲液重悬菌体后，匀浆破碎，离心消除杂质，得TBH的粗酶液；以酪胺为底物，加入抗坏血酸、富马酸、铜离子为辅因子，加入TBH粗酶液反应得产物章鱼胺(在有氧条件下进行)。本发明方法是首次系统的做出从酪胺到章鱼胺的酶催化生产工艺，催化效率高达20mg/L，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，成功打通了这条路径，为以后的章鱼胺生产研究奠定了良好的基础。

说明书

技术领域

本发明属于章鱼胺的制备技术领域，具体涉及一种基于酪胺-β-羟化酶催化产章鱼胺的方法。

背景技术

章鱼胺是无脊椎动物神经系统中普遍存在的多种微量生物胺之一。虽然首先被发现存在于软体动物章鱼的唾液腺中，不过章鱼胺生理学意义的研究却首先开展在脊椎动物和节肢动物体内。在脊椎动物神经系统中，章鱼胺被认为是“痕量生物胺”或是“虚假的”神经递质。虽然有迹象表明章鱼胺是调节去甲肾上腺素突触传导的神经递质，但是至今在哺乳动物的中枢神经系统中没有发现特异性的章鱼胺受体。章鱼胺的分布及含量变化对于昆虫和一些软体动物、螨类等的生长、取食、代谢等多种生理和生物效应具有重要的作用。

它是一种防治肥胖症和Ⅱ型糖尿病的β3-肾上腺素受体激动剂，对激活胰岛素释放敏感性而发挥作用；具有调节人体新陈代谢、保持血糖平衡、抑制食欲、提高注意力等特殊的药理作用和生理功能，是在防治肥胖症和Ⅱ型糖尿病方面具有良好前景。另外，章鱼胺的存在及含量的变化对各种昆虫的生长和行为具有显著的生物效应。

目前生产辛弗林的方法主要有物理提取法以及化学法。物理提取法以枳实、枳壳等酸橙植物为原料，以其提取液中得到。此法从中提取得到的纯度不高，一般为50％以下，来源较少，单一的提取方法限制了辛弗林的大量获取，所以并不能很好地进行工业化生产。化学法主要以苯酚为起始原料，通过烷基化、水解、氨化及还原等一系列反应得到辛弗林。此法生产成本较高，有较强的副反应，产品分离纯度较高，底物苯酚有毒，会对环境造成较大的污染。目前市面上并没有生物法催化产辛弗林，因此构建一个生物法催化产辛弗林是非常有必要性的，具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于酪胺-β-羟化酶催化产章鱼胺的方法，该方法反应条件温和，易控制，成本低廉，产率高，避免使用对环境或者人体有毒有害的有机试剂，解决化工方法产生的污染问题，环境友好度良。

一种基于酪胺-β-羟化酶催化产章鱼胺的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建表达TBH的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH

根据已报导的异色瓢虫来源酪胺-β-羟化酶(TBH)的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-TBH，将构建好的重组质粒pET28a-TBH用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到酪胺-β-羟化酶表达菌种BL21(DE3)/pET28a-TBH；

步骤2，培养TBH的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH

挑取表达TBH的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.4以上，再加入0.5mM的IPTG，20℃培养10-12小时，离心收集表达酪胺-β-羟化酶的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH；

步骤3，收集表达酪胺-β-羟化酶的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH，用pH2-9的缓冲液重悬后，使用匀浆破碎仪，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得TBH粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度；

步骤4，选取酪胺作为底物，添加辅因子抗坏血酸、富马酸、过氧化氢酶，再添加缓冲溶液，调节反应体系的pH至2-9，最后加入TBH粗酶液0.5-20g/l，20-60℃反应0.5-24h，得到产物章鱼胺。

作为改进的是，步骤2中所述产酶条件为：加入IPTG的量为0.5mM、诱导温度为20℃。

作为改进的是，步骤4中所述的催化条件为：温度50℃、pH＝5。

作为改进的是，步骤4中所述辅因子中抗坏血酸、富马酸、铜离子的浓度均为0.1mM-10M。过氧化氢酶的浓度均为0-1g/l。

进一步改进的是，步骤4中所述抗坏血酸、富马酸浓度均为0.5mM、铜离子的浓度为2mM、过氧化氢酶的浓度为12.5ug/ml。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种基于酪胺-β-羟化酶催化产章鱼胺的方法，具有如下优势：该方法是首次系统的做出从酪胺到章鱼胺的酶催化生产工艺，催化效率高达20mg/l，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和。

附图说明

图1为本发明催化产物的液相色谱图，其中，1-章鱼胺，2-酪胺。

具体实施方案

实施例1

一种基于酪胺-β-羟化酶催化产章鱼胺的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建表达TBH的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH

根据已报导的异色瓢虫来源酪胺-β-羟化酶(TBH)的氨基酸序列进行密码子优化后，全基因合成优化后的序列，

(如SEQ NO.1所示：

ATGCTGAAAATCCCGCTGCAACTGAGCAGCCAGGATGGTATTTGGCCGGCGCGTTTTGCGCGTCGTCTGCACCACCACCACCAACTGGCGTACCACCACCACAAGCAGGAGCAGCAACAACAGCAGCAACAACAACAACAACAGCAAGCGAAGCAGAAACAAAAGCAGAACGGTGTGCAGCAAGGCCGTAGCCCGACCTTTATGCCGGTTATGCTGCTGCTGCTGATGGCGACCCTGCTGACCCGTCCGCTGAGCGCGTTCAGCAACCGTCTGAGCGATACCAAACTGCACGAGATCTACCTGGACGATAAAGAAATTAAGCTGAGCTGGATGGTGGACTGGTATAAGCAGGAAGTGCTGTTTCACCTGCAAAACGCGTTCAACGAACAGCACCGTTGGTTCTACCTGGGTTTTAGCAAACGTGGTGGCCTGGCGGACGCGGATATCTGCTTCTTTGAGAACCAAAACGGTTTCTTTAACGCGGTGACCGATACCTATACCAGCCCGGATGGCCAGTGGGTGCGTCGTGATTATCAGCAAGACTGCGAGGTTTTTAAAATGGATGAATTCACCCTGGCGTTTCGTCGTAAGTTCGACACCTGCGATCCGCTGGACCTGCGTCTGCACGAAGGTACCATGTATGTGGTTTGGGCGCGTGGCGAGACCGAACTGGCGCTGGAGGACCACCAATTTGCGCTGCCGAACGTGACCGCGCCGCACGAAGCGGGCGTTAAAATGCTGCAGCTGCTGCGTGCGGATAAGATTCTGATCCCGGAGACCGAACTGGACCACATGGAGATCACCCTGCAAGAAGCGCCGATTCCGAGCCAGGAGACCACCTACTGGTGCCACGTGCAACGTCTGGAAGGTAACCTGCGTCGTCGTCACCACATCGTTCAGTTTGAGCCGCTGATCCGTACCCCGGGCATTGTGCACCACATGGAAGTTTTCCACTGCGAGGCGGGTGAACACGAGGAAATCCCGCTGTATAACGGTGACTGCGAGCAGCTGCCGCCGCGTGCGAAAATTTGCAGCAAGGTGATGGTTCTGTGGGCGATGGGTGCGGGTACCTTCACCTACCCGCCGGAAGCGGGTCTGCCGATTGGTGGCCCGGGCTTTAACCCGTATGTGCGTCTGGAAGTGCACTTCAACAACCCGGAAAAACAAAGCGGTCTGGTGGATAACAGCGGCTTTCGTATCAAAATGAGCAAGACCCTGCGTCAGTACGATGCGGCGGTTATGGAGCTGGGTCTGGAATATACCGACAAGATGGCGATTCCGCCGGGTCAAACCGCGTTTCCGCTGAGCGGTTACTGCGTTGCGGACTGCACCCGTGCGGCGCTGCCGGCGACCGGTATCATTATCTTTGGCAGCCAGCTGCACACCCACCTGCGTGGTGTGCGTGTTCTGACCCGTCACTTCCGTGGCGAGCAAGAACTGCGTGAGGTTAACCGTGACGATTACTATAGCAACCACTTTCAGGAAATGCGTACCCTGCACTACAAGCCGCGTGTGCTGCCGGGTGATGCGCTGGTTACCACCTGCTACTATAACACCAAAGACGATAAGACCGCGGCGCTGGGTGGCTTTAGCATCAGCGACGAGATGTGCGTGAACTATATTCACTACTATCCGGCGACCAAACTGGAAGTGTGCAAGAGCAGCGTTAGCGAGGAAACCCTGGAGAACTACTTCATCTATATGAAGCGTACCGAACACCAGCACGGTGTTCACCTGAACGGCGCGCGTAGCAGCAACTACCGTAGCATCGAGTGGACCCAACCGCGTATTGATCAGCTGTACACCATGTATATGCAAGAACCGCTGAGCATGCAGTGCAACCGTAGCGACGGTACCCGTTTCGAAGGCCGTAGCAGCTGGGAAGGTGTGGCGGCGACCCCGGTTCAGATTCGTATCCCGATTCACCGTAAGCTGTGCCCGAACTACAACCCGCTGTGGCTGAAACCGCTGGAGAAGGGTGACTGCGATCTGCTGGGCGAATGCATCTATTAA)，再用引物将基因亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-TBH，将构建好的重组质粒pET28a-TBH用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到酪胺-β-羟化酶表达菌种BL21(DE3)/pET28a-TBH；

引物序列分别为：

TBH-F：5’-CGCGGATCCATGCTGAAAATCCCGCTG-3’

TBH-R：5’-CCCAAGCTTTTAATAGATGCATTCGCCCAG-3’；

步骤2，培养TBH的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH

挑取表达TBH的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.4以上，再加入0.5mM的IPTG，20℃培养10-12小时，离心收集表达酪胺-β-羟化酶的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH。

步骤3，收集步骤2中的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-TBH，用pH2-9的缓冲液重悬后，使用匀浆破碎仪，破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得TBH粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度，常规检测所得蛋白终浓度为10-30g/L。

步骤4，选取酪胺及抗坏血酸作为底物，添加辅因子铜离子、富马酸、过氧化氢酶，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至5，最后加入TBH粗酶液0.5-20g/l，20-50℃敞口反应0.1-24h(即保证在有氧状态下反应)，得到产物章鱼胺。

实施例2

催化产章鱼胺，具体操作步骤为：取反应体系为5ml，取初始浓度为0.5g/l的酪胺为底物，加入0.5mM的抗坏血酸、0.5mM的富马酸、2mM的铜离子，12.5μg/ml的过氧化氢酶，用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节体系pH为5，再加入20g/l的粗酶浓度，50℃震荡反应。

反应结束后，利用高效液相色谱法：XSelect HSS T3型色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相A为23.5g氯化钠、1ml冰乙酸，用超纯水稀释到1L，流动相B为纯乙腈溶液，柱温30℃，紫外检测波长280nm，流速0.5ml/min。采取以下梯度洗脱法：

上述实施例中，LB培养基的配方：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，5g/l氯化钠。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。