半夏泻心汤在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用

摘要

本发明涉及半夏泻心汤在制备治疗溃疡性结肠炎(UC)的药物中的应用。本发明探讨了古法和现代法提取的半夏泻心汤对UC大鼠的治疗效果及其相关机制，结果表明，古法和现代法提取物均可减轻UC的严重程度，包括降低DAI评分和肠重指数，改善结肠损伤，提高血清IL‑4、IL‑10水平以及降低血清IL‑1β和TNF‑α；在相近剂量下，古法提取物要比现代法提取物的效果更好。本发明证实了古代的中药复方半夏泻心汤是现代治疗UC的有效候选药物，有助于促进半夏泻心汤在UC临床治疗中的应用，也为UC的治疗提供了一种新的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及中医药领域，具体地说，涉及半夏泻心汤在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)，又称“慢性非特异性溃疡性结肠炎”，系一种病因未明的、以侵犯直肠和结肠黏膜与黏膜下层为主的炎症性肠病，临床以腹泻、腹痛及黏液脓血便等消化道症状为典型表现，长期炎症可出现多种并发症，其中以结直肠癌变后果最为严重，被认为是结肠癌的癌前病变之一[1]。目前UC的治疗主要包括药物治疗和手术治疗等[2]，临床上多采用氨基水杨酸类制剂以及糖皮质激素类药物进行治疗，如美沙拉嗪[3]，布地奈德[4]许多新型药物相继被研发并应用于治疗UC[5]，但绝大多数很难治愈该病。由于该病机制尚未明确，目前又仍没有根治UC的特效药，现已被WHO列为“世界难治性疾病”之一。

西药见效快，服用周期较短，但其副作用较多且不能治愈[6,7]。近年来中药越来越多的被证明具有抗炎，抗氧化和抗肿瘤等各种有益作用，而这些作用也被许多研究证明在对抗肠道疾病方面有着重要作用，且研究结果显示中药具有安全性高，副作用少的特点。有大量研究涉及中药对溃疡性结肠炎的治疗。

半夏泻心汤为中医经典名方，出自《伤寒论》，由半夏、黄芩、黄连、干姜、人参、炙甘草、大枣七味药组成，其组方主要在于“辛开苦降，补泻兼施，寒热并用”。研究显示，半夏泻心汤具有抗炎、抗氧化作用[8]。本研究将该方作为研究对象，观察半夏泻心汤对UC大鼠的疗效，并进一步探讨其作用机制。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供半夏泻心汤的一种新医疗用途。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

半夏泻心汤在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

作为本发明的一种优选实施方式，所述半夏泻心汤按照古代提取法制备。

作为其中的一个优选例，所述古代提取法的具体步骤为：按重量份配比取半夏50-70份、黄芩40-50份、干姜40-50份、人参40-50份、炙甘草40-50份、黄连10-20份，另取大枣，所述大枣其个数与半夏重量的比值为10-14枚:(50-70)g，加水1500-2500份，煎煮至原加水量的0.5-0.7倍，去除药渣，再煎煮至原加水量的0.25-0.35倍，浓缩，干燥。

更优选地，所述古代提取法的具体步骤为：按重量份配比取半夏60份、黄芩45份、干姜45份、人参45份、炙甘草45份、黄连15份，另取大枣，所述大枣其个数与半夏重量的比值为12枚:60g，加水2000份，煎煮至原加水量的0.6倍，去除药渣，再煎煮至原加水量的0.3倍，浓缩，干燥。

作为本发明另一种优选实施方式，所述药物用于：

a)降低DAI评分；

b)降低肠重指数；

c)改善结肠损伤和炎症程度；

d)提高血清IL-4、IL-10水平；和/或

e)降低血清IL-1β和TNF-α水平。

本发明优点在于：

本发明探讨了半夏泻心汤对溃疡性结肠炎(UC)大鼠的治疗效果及其相关机制。具体将54只SD大鼠随机分为9组：正常组，模型组，阳性对照组，古代提取法低剂量组(BXD-AED-L)、中剂量组(BXD-AED-M)、高剂量组(BXD-AED-H)，现代提取法低剂量组(BXD-MED-L)、中剂量组(BXD-MED-M)、高剂量组(BXD-MED-H)，每组各6只，除正常组外，其余各组均采用直肠注入含TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸)的乙醇溶液70mg/kg的方法建立溃疡性结肠炎模型。造模后第二天，正常组和模型组自由饮食饮水，其余各组予以相应剂量的药物，连续7天。在整个实验周期内，每天检查并记录各组大鼠体重变化、粪便性状、便血情况，参照评分标准进行DAI评分，给药7天后检测大鼠的肠重指数、结肠组织外观损伤、组织病理损伤、ELISA法检测血清中白介素IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子TNF-α的浓度。结果显示，体内实验中，DAI、大鼠的肠重指数、结肠组织外观损伤、组织病理损伤以及血清中IL-4、IL-1β、TNF-α浓度水平的结果显示，BXD-AED组和BXD-MED组均可减轻UC的严重程度，且在相近剂量下，BXD-AED组要比BXD-MED组效果更好。本发明表明古方半夏泻心汤是现代治疗UC的有效候选药物，有助于促进半夏泻心汤在临床UC治疗中的使用，也为UC的治疗提供了一种新的药物。

附图说明

图1.BXD对UC大鼠DAI、结肠体重指数、结肠宏观炎症评分及血清细胞因子的影响。(A)疾病活动指数；(B)肠重指数；(C)结肠宏观炎症评分；(D)血清IL-4浓度；(E)血清IL-10浓度；(F)血清IL-1β浓度；(G)血清TNF-α浓度；(H)血清IL-6浓度。a.正常组；b.模型组；c.SASP组；d.BXD-AED-L组；e.BXD-AED-M组；f.BXD-AED-H组；g.BXD-MED-L组；h.BXD-MED-M组；i.BXD-MED-H组。

图2.半夏泻心汤对TNBS诱导的UC大鼠结肠外观及结肠组织病理变化的影响。(A)结肠外观；(B)结肠组织的病理变化(×100)。a.正常组；b.模型组；c.SASP组；d.BXD-AED-L组；e.BXD-AED-M组；f.BXD-AED-H组；g.BXD-MED-L组；h.BXD-MED-M组；i.BXD-MED-H组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1.材料与方法

1.1实验动物

清洁级SD雄性大鼠54只，体重175-225g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司，本研究通过上海中医药大学实验动物中心伦理委员会批准，批准编号为191213010。

1.2实验药物

半夏泻心汤现代提取法的组成：所有饮片均购自上海虹桥中药饮片有限公司，半夏15g(批号181024)、干姜9g(批号190102)、黄芩9g(批号190215)、炙甘草9g(批号181221)、人参9g(批号190403)、黄连3g(批号190114)、大枣4枚(批号181229)，以上饮片均由上海中医药大学中药学院张红梅博士鉴定。

半夏泻心汤提取物的制备：取处方中7味药，第一次加12倍量水回流提取1小时，第二次加10倍量水回流提取0.5小时，合并两次提取液，滤过，滤液60℃减压浓缩干燥，粉碎过3号筛即得。

半夏泻心汤古代提取法的组成：半夏60g、黄芩45g、干姜45g、人参45g、炙甘草45g、黄连15g、大枣12枚，所有饮片来源及批次均同上。

半夏泻心汤提取物的制备：取方中各药，加水2000mL，煎煮至1200mL，去除药渣后，浓缩至600mL，60℃减压浓缩干燥，粉碎过3号筛即得。

1.3主要试剂

Salicylazosulfapyridine(SASP，大连美仑生物技术有限公司，A0322A)，TNBS和戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich有限公司)，液体石蜡(国药集团化学试剂有限公司，批号20190830)，乙醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20190729)，联苯胺(上海誉恩生物科技有限公司，R004986)，过氧化氢(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20190423)，4％多聚甲醛通用型组织固定液(69061800，biosharp公司)，ELISA试剂盒(上海冠泰生物科技有限公司)。

1.4实验方法

1.4.1造模方法：

在12小时光照/黑暗循环下，房间温度为23±1℃，湿度为20％。在整个研究期间允许动物随意饮水。在实验之前，允许所有大鼠适应环境一周。

TNBS造模[9]：除正常组外，其余各组大鼠在造模前禁食24h，按30mg/kg的剂量腹腔注射2％戊巴比妥钠(0.15mL/100g)麻醉后，进行以下处理造模：用连接聚乙烯管的注射器按70mg/kg的剂量抽取5％的TNBS溶液(0.14mL/100g)与50％的乙醇按1∶1的比例混匀，聚乙烯管头端涂少许石蜡油，并插至大鼠结肠内距肛门口约8cm处，缓慢注入混合液。注入完毕后用燕尾夹夹住大鼠肛门，将大鼠头朝下悬挂15分钟，再平躺15分钟后，取下燕尾夹，至自然清醒后自由饮食。

1.4.2分组与给药：

将54只SD大鼠随机分9组(n＝6/group)：正常组，模型组，阳性对照组(SASP柳氮磺吡啶肠溶片，500mg/kg)，古代提取法低剂量组(BXD-AED-L)、中剂量组(BXD-AED-M)、高剂量组(BXD-AED-H)，现代提取法低剂量组(BXD-MED-L)、中剂量组(BXD-MED-M)、高剂量组(BXD-MED-H)，见表1。造模后第二天，正常组和模型组自由饮食饮水；其余各治疗组予以相对应剂量药物，连续7天。在研究期间，每天检查大鼠的体重，粪便性状和直肠出血。

表1.分组与给药

1.5检测指标

1.5.1疾病活动指数(DAI)

在整个实验周期内，每天检查并记录各组大鼠体重变化、粪便性状、便血情况，参照评分标准进行评分，评分标准见表2[10]。每日将各指标评分相加，作为疾病活动指数(DAI)，分数最高为10。

表2.疾病活动指数(DAI)评分标准

注：DAI＝(体重下降分数+粪便性状+隐血分数)/3；使用联苯胺法检测粪便隐血；以造模当日体重为基础体重。

联苯胺法：用竹签挑少量粪便于载玻片上，滴加2滴联苯胺冰醋酸液于粪便上，再滴加2滴3％过氧化氢。在2min内观察颜色反应，显蓝色为阳性。根据其颜色深浅判断阳性的强弱，在2min后仍不显色为阴性。

1.5.2肠重指数

末次给药后，各组大鼠禁食24h，麻醉，腹主动脉取血，取出整个结肠段，沿肠道纵轴剪开，用生理盐水冲洗干净，用游标卡尺测量结肠的长度，并精密称重。重量与长度的比值作为肠重指数(g/cm)，用来判断因炎症引起的结肠水肿或缩短程度，是评价结肠炎严重程度的重要指标。

1.5.3结肠外观组织损伤评分

取生理盐水冲洗干净的结肠段组织，进行外观炎症评价，评分标准见表3[2]。

表3.结肠外观组织损伤评分标准

1.5.4组织病理损伤评分

剪取约0.5cm结肠组织，用4％福尔马林溶液固定，石蜡包埋制片，切片脱蜡后进行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色。在显微镜下观察溃疡、炎性细胞浸润等变化，参照相关标准进行病理组织学评分，评分标准见表4[11]。

表4.组织病理学评分标准

1.5.5 ELISA法检测血清中IL-4，IL-10，IL-1β，TNF-α，IL-6水平

腹主动脉取血，静置2h，离心(5000r/min，10min)，取上层血清，放置-80℃保存待测，严格按照ELISA试剂盒说明测定血清中IL-4，IL-10，IL-1β，TNF-α及IL-6的含量。

2.统计学处理

实验数据以Mean±SD表示，采用SPSS 25.0(IBM，New York，NY，USA)软件进行数据处理及分析，多组样本均数的两两比较采用One-Way ANOVA方差分析，组间均数两两比较采用最小显著性差异法(LSD)进行，以P<0.05为有显著性差异。

3.结果

3.1 DAI和肠重指数

与正常组比较，模型组在进行TNBS造模后DAI评分和肠重指数均明显升高(P<0.01或P<0.05)，该结果表明TNBS诱导造模成功。与模型组比较，各治疗组大鼠DAI评分均明显降低(P<0.01)；而与模型组相比，BXD-AED-L/M组和BXD-MED-L组(P<0.01)肠重指数明显降低，表明大鼠结肠充血水肿情况有所缓解，阳性对照组、古代提取法高剂量组以及现代提取法高、中剂量组较模型组均无明显变化(P>0.05)。BXD，特别是古法提取物，在低、中剂量下对UC具有良好的保护作用。结果见图1A和1B。

3.2结肠损伤的宏观评估

正常组大鼠的结肠皱襞纹理清晰，黏膜光滑，未见溃疡、糜烂、充血、水肿。相比之下，模型组大多数大鼠的结肠与周围组织严重粘连，难以剥离，距肛门8cm左右可见节段性环周溃疡，肠壁明显增厚、溃疡表面有棕褐色假膜样坏死物附着。如图1C所示，与模型组比较，各治疗组结肠宏观炎症评分明显较低(P<0.01或P<0.05)，BXD-AED组和BXD-MED组的溃疡、充血、水肿等炎症症状，较模型组均呈不同程度地明显缓解，提示两种提取方法所得的BXD均对UC大鼠结肠损伤有明显的恢复作用。结肠组织外观情况，结果如图2A所示。

3.3半夏泻心汤治疗对病理组织学的影响

正常组大鼠结肠黏膜完整，腺体排列整齐无炎性细胞浸润及溃疡。模型组结肠黏膜及腺体大多缺损、脱落，腺体排列错乱，且有炎性细胞浸润。BXD-AED-L/M组可见腺体有不同程度的缺损，且排列不齐，还有少量炎症细胞浸润，较模型组稍有改善。BXD-MED-L/M/H组可见轻微腺体脱落及炎性细胞浸润，腺体排列较整齐；BXD-AED-H组和SASP组结肠黏膜基本恢复完整，腺体排列较整齐，无明显炎性细胞浸润，与模型组比较有明显改善。结果见图2B。

3.4半夏泻心汤治疗对血清中IL-4、IL-10、IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影响

为进一步探究半夏泻心汤对大鼠溃疡性结肠炎的抗炎作用机制，本研究通过ELISA法测定各组大鼠血清中与结肠炎相关的细胞因子IL-4、IL-10、IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度水平，结果显示：在TNBS的作用下，模型组血清中抗炎因子IL-4的水平显著降低，而与模型组比较，各治疗组血清中IL-4的浓度均明显增高(P<0.05，P<0.01)，表明半夏泻心汤对IL-4表达的提高具有促进作用；SASP组、BXD-AED-M/H组的抗炎因子IL-10浓度较模型组有显著提高(P<0.05，P<0.01)，其他各治疗组的IL-10水平虽有所提高，但与模型组之间并无显著性差异；在TNBS的诱导下，模型组的促炎因子IL-1β水平显著升高，与模型组相比，药物治疗后，SASP组、BXD-AED组以及BXD-MED-L/H组血清中的IL-1β水平均显著降低(P<0.01)，表明半夏泻心汤对IL-1β具有抑制作用；较模型组，SASP组、BXD-AED组和BXD-MED-M/H组的促炎因子TNF-α水平均有明显下降，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；而模型组与半夏泻心汤各治疗组血清中的IL-6浓度无显著区别。结果见图1D-H。

4.讨论

BXD还被用于治疗各种胃肠道疾病，包括慢性萎缩性胃炎[12]、消化性溃疡[13]、腹泻[14]和结肠癌[15]，疗效显著。最近的研究[16,17]证实BXD含有多种，如黄芩苷、黄芩素、小檗碱等对UC有生物活性的天然成分。因此，本研究探讨了BXD对UC模型的体内作用。

然而，古代文献中所记载的有关BXD的制备方法与现代临床应用及工业生产不同。因此，探讨不同提取方法下的提取物之间可能存在的差异具有重要意义。

《伤寒论》记载的制备方法中提到，方中七味药，用2000mL水煎煮，得到1200mL药液，去掉药渣后继续浓缩至600mL。这种方法与目前制药领域中通常使用回流的常规做法略有不同。传统中药著作中记载的特殊煎煮方法，包括去滓再煎法，在其他古代中药复方中也有应用，如小柴胡汤、甘草泻心汤等。不同条件下提取的提取物在药理作用上是否存在差异，也是中医经典复方现代发展和应用中的一个关键问题。此外，古代和现代的重量测量方法存在着明显的差异。例如，1两在汉代大约相当于15g(现代重量单位)，而在目前研究中药处方时也解释为3g[18]，在现在中国的日常生活中1两相当于50g。在探索中药经典方法研究过程中制备方法和计量问题的影响基础上，本研究以BXD-AED和BXD-MED为研究对象，比较了其抗UC作用。

UC是一种非特异性肠病，临床症状包括腹泻、腹痛、粘脓性血便和体重减轻[8]，常见的UC模型包括恶唑啉酮、右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的小鼠和TNBS诱导的大鼠急性模型或慢性模型[19]。在TNBS结肠炎模型中，乙醇必不可少，可用于提供进入肠道上皮细胞的通道，继而削弱屏障功能并允许TNBS穿透肠壁，进一步导致结肠蛋白或微生物群衍生蛋白的半抗原化和TNP特异性CD4

在本研究的体内药理学实验中，采用5％TNBS-乙醇建立UC大鼠模型，以SASP作为阳性对照。BXD-AED组和BXD-MED组分别分为低、中、高3个剂量组。结果显示，BXD各组均能有效降低UC大鼠DAI评分(P<0.05)，表明BXD无论是AED还是MED均能改善UC大鼠的体重减轻、腹泻、便血情况。肠重指数和宏观炎症评分也证明了BXD-AED组较BXD-MED组有一定优势，尤其是BXD-AED-L组(相当于生药量12.6g/kg)的结肠水肿程度较轻。而BXD-MED-H组在接近剂量(相当于生药量11.36g/kg)时，各指标均有明显差异。这些趋势表明，制备方法可能比剂量计量问题更为重要。

UC作为一种炎症性肠病，与炎症密切相关[20]。在炎症发生的过程中，会释放一系列的细胞因子参与炎症反应。因此，本研究还采用ELISA检测血清中与炎症相关的细胞因子水平，以探索BXD可能的抗炎机制。概括起来即，BXD治疗组抗炎因子(IL-4、IL-10)水平升高，促炎因子(IL-1β、TNF-α)水平降低。这些血清细胞因子的检测结果显示，BXD-AED-L组(图1D-H中的d)的细胞因子水平优于BXD-MED-H组(图1D-H中的i)，这也进一步证明了去滓再煎法的重要性。此外，BXD-AED组和BXD-MED组抗UC作用的差异间接提示可能与汤剂中活性成分含量的差异有关。

IL-4是一种抗炎细胞因子，可抑制Th17细胞的分化。Huang等人的研究结果表明，抑制Th17分化有助于治疗DSS诱导的小鼠结肠炎，而上调IL-4也可预防UC[21]。在本研究中，经TNBS诱导后，模型组IL-4水平显著低于正常组，各治疗组IL-4水平均显著高于模型组(P<0.05或0.01)。此结果表明，BXD具有明显的抗炎作用。

IL-1β是一种炎症因子，代表着高炎症水平。Castro-Dopico等人最近证实了IL-1β在活跃的UC期间发生上调[22]。在活动性疾病中，IL-1β位于固有层的免疫细胞浸润中，这与在非炎性条件下几乎排他的上皮细胞层的表达形成对比[23]。在UC的过程中，活化的巨噬细胞将产生过量的细胞因子，其中就包括IL-1β。本研究中，与正常组相比，TNBS造模后UC大鼠血清中IL-1β水平显著升高。BXD给药后，大部分治疗组明显抑制了这一趋势。

Ghorbaninejad等人也证实了TNF-α与UC密切相关，并在UC的炎性反应诱导中起重要作用[24]。此外，他们发现TNF家族成员活性的增加可能导致肠上皮细胞的凋亡。上皮细胞凋亡增加可破坏肠黏膜，最终引起炎症。Che等人的研究表明，天然化学物质可显著抑制TNF-α的分泌，并减少UC相关的炎症和细胞凋亡[25]。与此同时，Wang等人最近研究了治疗UC的效果，他们的研究证实TNF-α被有效抑制[20]。在本研究中，模型组的TNF-α表达水平显著高于正常组，而大多数BXD治疗组的TNF-α表达水平则明显降低。BXD-AED-M/H和BXD-MED-M/H组的TNF-α水平甚至低于正常组。该结果有力地表明了BXD对UC大鼠血清中TNF-α表达的抑制作用。

5.结论

这项研究评估了不同提取方法制备的BXD对TNBS诱导的大鼠的影响。结果表明，AED和MED方法均可减轻UC的严重程度，如DAI评分，肠重指数，结肠损伤的肉眼和组织学评估以及血清IL-4，IL-10，IL-1β，TNF-α和IL-6的结果所示。在相近剂量下，BXD-AED组要比BXD-MED组的效果更好。综合以上研究结果表明，古代的中药复方BXD是现代治疗UC的有效候选药物。

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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。