修饰CMVgB蛋白及包含其的CMV疫苗

摘要

本发明的目的在于，提供一种修饰CMV gB蛋白及包含其的CMV疫苗，所述修饰CMV gB蛋白与野生型CMV gB相比，在免疫诱导时能够诱导对CMV gB蛋白显示出高中和活性的中和抗体的含有比例高的抗体组，能用于预防和/或治疗CMV感染症。本发明的修饰CMV gB蛋白是在头部区域包含修饰、且主体区域识别抗体的诱导能力得到改善的修饰CMV gB蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及修饰CMV gB蛋白及包含其的CMV疫苗。

背景技术

人类巨细胞病毒(CMV)感染症主要分为如下两种：在移植、AIDS、先天性免疫缺陷病等处于免疫抑制状态的患者中发病的CMV肺炎、肠炎、视网膜炎等器官损伤；以及孕妇初次感染时在胎儿中发病的先天性CMV感染症。其中，先天性CMV感染症是构成TORCH综合症之一的重要的先天性传播性疾病，使胎儿发生畸形或严重的临床症状。孕妇在初次感染CMV时，大约40％的人通过胎盘使胎儿发生先天性感染。另外，也有报道称死产中约15％是由先天性CMV感染所致。每年先天性感染的儿童人数在日本为3000人以上，在美国为约4万人，据称有症状者在日本有约1000人、在美国有约8000人，其中约90％有中枢神经系统疾病、听力损伤等后遗症。

日本的CMV抗体携带率高于欧美各国，日本成年人的80％～90％为CMV 抗体阳性，几乎所有人在婴幼儿期被感染。然而，作为最近的趋势，显示出年轻人的CMV抗体携带率从90％左右降低至60％左右，预防先天性CMV感染症的对策的必要性进一步增高(非专利文献1)。

最近的研究报道：一直以来被认为大多由妊娠过程中初次感染的母体产生的先天性CMV感染儿童，与在妊娠过程中发生了初次感染的孕妇相比，更多发生在慢性感染状态的孕妇中(非专利文献2)。

美国医学研究所(The Institute of Medicine)认为：在发达国家，先天性 CMV感染症作为先天性的中枢神经系统疾病的原因影响已超过唐氏综合症，若以影响到有后遗症的先天性感染儿童的人生的QOL降低和社会经济损失作为质量调整寿命年(QALYs：Quality-adjusted life years)进行计算，据分析 CMV疫苗属于医疗经济效应最高的一类(非专利文献3)。

引起感染症的病原体大致分为：通过传统型疫苗能够获得足够的效果的 I类病原体、以及通过传统型疫苗或病原体感染史无法获得足够的免疫防御的II类病原体，CMV属于后者(非专利文献4)。作为II类病原体难以克服的理由，已经指出了它们所具有的独特的免疫逃逸机制。人类已经开发出许多针对I类病原体有效的疫苗，并克服了由它们所引起的感染症的威胁。此外，未来的疫苗开发的重点正转移到II类病原体上。

为了解决CMV相关疾病，正在进行包括减毒活疫苗和亚单位疫苗在内的疫苗的开发。专利文献1～3中公开了与修饰型CMV包膜糖蛋白B(gB)相关的疫苗。

为了将先天性CMV感染症所造成的损害减小到最小限度，也进行了通过孕妇筛查来鉴定未感染孕妇、提高日常生活上的防护，但这还不够。进而还有对初次感染孕妇进行鉴定并通过向孕妇给予CMV抗体高效价免疫球蛋白而有效预防胎儿的感染、减轻重症化的报道，但目前关于有效性存在质疑 (非专利文献5)。

CMV的治疗使用了阿昔洛韦等抗病毒药。然而，这些抗病毒药无法完全清除病毒，而且若停止服用则病毒再次激活。作为低分子药，也有更昔洛韦(ganciclovir)在市场上销售，但其效果有限，也存在副作用的问题。因此，期望开发出防御CMV的感染本身的预防用疫苗、或减轻缓和再次发病的治疗用疫苗，但目前尚不存在有效的疫苗，其需求很高。

关于CMV疫苗开发，一直以来多家制药企业、学术界也尝试使用了减毒活疫苗、佐剂添加重组蛋白疫苗、DNA疫苗等的研究，但任意情况的T细胞免疫、B细胞免疫的应答均不充分，结果无法获得能够作为疫苗来实际使用的效果。

Astellas制药和Vical公司共同开发的目的在于预防器官移植患者和造血细胞移植患者中的CMV感染症及与其相伴的并发症的、二价DNA疫苗 ASP0113(gB gene+pp65gene/泊洛沙姆CRL1005)在以肾移植患者为对象的II 期试验中相对于安慰剂组未能确认出显著效果。另外，在以造血细胞移植患者为对象的III期试验中针对安慰剂组也未能确认出显著效果。另外，Sanofi Pasteur公司出于预防先天性CMV感染症的目的而尝试开发的重组蛋白疫苗 (gB/MF59)在以未感染成年女性为对象的感染防御试验(II期试验)中虽显示出约50％的有效性，但由于效果不充分而中止了开发(非专利文献6)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/092460号

专利文献2：国际公开第2012/049317号

专利文献3：国际公开第2015/089340号

非专利文献

非非专利文献1:Azuma H,Takanashi M,et al.,“Cytomegalovirusseropositivity in pregnant women in Japan during 1996-2009,”J Jpn Soc PerinNeon Med 46(2010)1273-1279

非专利文献2:Tanimura K et al.,“Universal screening with use ofImmunoglobulin G avidity for congenital cytomegalovirus infection.”ClinInfect Dis 65(2017)1652-1658,https://doi.org/10.1093/cid/cix621

非专利文献3:Kathleen R.Stratton et al.,“Vaccines for the 21stcentrury:a tool for decision making”The National Academies Presss,2000

非专利文献4:Tobin GJ et al.,“Deceptive imprinting and immunerefocusing in vaccine design.”,Vaccine 26(2008)6189-6199

非专利文献5:Revello MG et al.,“Randomized trial of hyperimmuneglobulin to prevent congenital cytomegalovirus.”,N Engl J Med 370(2014) 1316-1326

非专利文献6:Pass RF et al.,“Vaccine prevention of maternalcytomegalovirus infection.”N Engl J Med 360(2009)1191-1199

非专利文献7:Sonja Potzsch et al.,“B cell repertoire analysisidentifies new antigenic domains on glycoprotein B of human cytomegaloviruswhich are target of neutralizing antibodies.”PLoS Pathog,2011；7(8):e1002172

非专利文献8:Burke HG et al.,“Crystal structure of the humancytomegalovirus glycoprotein B.”PLoS Pathog 2015Oct 20,11(10):e1005227. doi:10.1371/journal.ppat.1005227

发明内容

发明要解决的问题

如上所述，目前不存在有效的CMV疫苗。因此，本发明的目的在于，提供一种修饰CMV gB蛋白及包含其的CMV疫苗，所述修饰CMV gB蛋白与野生型CMV gB相比，在免疫诱导时能够诱导对CMV感染显示出高中和活性的中和抗体的含有比例高的抗体，能用于预防和/或治疗CMV感染症。

用于解决问题的方案

关于作为CMV的主要抗原、且作为感染防御的靶抗原之一而已知的gB 蛋白，本发明人等尝试将其分为：诱导对CMV感染具有高中和活性的抗体的中和表位、及诱导中和活性低或无中和活性的非中和表位。然后，通过使非中和表位去免疫化(deimmunization)并在免疫学上使中和表位更突出，从而发现中和抗体诱导能力和感染防御能力得到增强的修饰CMV gB蛋白，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的各方案。

[1]一种修饰CMV gB蛋白，其中，野生型巨细胞病毒的包膜糖蛋白B、即CMV gB蛋白的头部区域被修饰，且主体区域识别抗体的诱导能力得到改善。

[2]根据[1]的修饰CMV gB蛋白，其中，头部区域中的修饰包括：通过导入糖链而进行的修饰。

[3]根据[1]或[2]的修饰CMV gB蛋白，其中，头部区域中的修饰包括：通过导入2个以上糖链而进行的修饰。

[4]根据[1]～[3]中任一项的修饰CMV gB蛋白，其中，头部区域中的修饰包括：通过向选自由序列号1中记载的氨基酸序列中的位置77、544、588和 609的对应位置的氨基酸残基组成的组中的至少2个氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

[5]根据[1]～[4]中任一项的修饰CMV gB蛋白，其中，头部区域中的修饰包括：通过向选自由序列号1中记载的氨基酸序列中的位置77、544、588和 609的对应位置的氨基酸残基组成的组中的至少3个氨基酸残导入糖链而进行的修饰。

[6]根据[1]～[5]中任一项的修饰CMV gB蛋白，其中，头部区域中的修饰包括：通过向序列号1中记载的氨基酸序列中的位置77、544和588的对应位置的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

[7]根据[1]～[6]中任一项的修饰CMV gB蛋白，其中，头部区域中的修饰包括：通过向序列号1中记载的氨基酸序列中的位置77、544、588和609的对应位置的氨基酸残基导入糖链而进行的修饰。

[8]根据[7]的修饰CMV gB蛋白，其通过如下方式而导入糖链，所述方式为：

序列号1中记载的氨基酸序列中的位置77的对应位置的氨基酸残基置换为天冬酰胺残基和位置79的对应位置的氨基酸残基置换为苏氨酸残基；

序列号1中记载的氨基酸序列中的位置544的对应位置的氨基酸残基置换为天冬酰胺残基和位置546的对应位置的氨基酸残基置换为苏氨酸残基；

序列号1中记载的氨基酸序列中的位置588的对应位置的氨基酸残基置换为天冬酰胺残基和位置589的对应位置的氨基酸残基置换为甘氨酸残基；

序列号1中记载的氨基酸序列中的位置609的对应位置的氨基酸残基置换为天冬酰胺残基、位置610的对应位置的氨基酸残基置换为苏氨酸残基和位置611的对应位置的氨基酸残基置换为苏氨酸残基。

[9]根据[1]的修饰CMV gB蛋白，其中，头部区域中的修饰包括头部区域的至少一部分的缺失。

[10]根据[9]的修饰CMV gB蛋白，其中，头部区域中的修饰为头部区域的全部区域的缺失。

[11]根据[1]的修饰CMV gB蛋白，其中，CMV gB蛋白的头部区域中的修饰包括序列号1中记载的氨基酸序列中的位置432和434的对应位置的氨基酸残基的置换，进而，上述修饰CMV gB蛋白包括主体区域中的修饰，该主体区域中的修饰包括序列号1中记载的氨基酸序列中的位置132、133、和216 的对应位置的氨基酸残基的置换。

[12]根据[11]的修饰CMV gB蛋白，其中，主体区域中的修饰还包括序列号1中记载的氨基酸序列中的位置215的对应位置的氨基酸残基的置换。

[13]根据[11]或[12]的修饰CMV gB蛋白，其中，主体区域中的修饰包括序列号1中记载的氨基酸序列中的位置131至133、及位置216至218的对应位置的氨基酸残基的缺失。

[14]一种CMV疫苗，其包含[1]～[13]中任一项的修饰CMV gB蛋白。

发明的效果

在通过本发明的修饰CMV gB蛋白或包含其的疫苗进行免疫诱导的情况下，与通过野生型CMV gB进行免疫诱导的情况相比，可以期待对CMV感染症较高的预防和/或治疗效果。

附图说明

图1是示出实施例6中的从头部区域至主体区域的免疫再聚焦(日语：免疫リフォーカシング)的结果(VC31)的图。

图2是实施例6中的从头部区域至主体区域的免疫再聚焦的结果(VC33) 的图。

图3是示出实施例6中的从头部区域至主体区域的免疫再聚焦的结果 (VC37)的图。

图4是示出实施例6中的从头部区域至主体区域的免疫再聚焦的结果(VC39)的图。

图5是示出实施例6中的从头部区域至主体区域的免疫再聚焦的结果 (VC40)的图。

图6是示出实施例6中的从头部区域至主体区域的免疫再聚焦的结果 (D1D2)的图。

图7是示出实施例6中的从头部区域至主体区域的免疫再聚焦的结果 ((D1D2)×2)的图。

图8是示出实施例7中的各修饰CMV gB蛋白免疫血清的成纤维细胞系中和试验的结果的图。

图9是示出实施例7中的各修饰CMV gB蛋白免疫血清的成纤维细胞系中和试验的结果的图。

图10是示出实施例7中的各修饰CMV gB蛋白免疫血清的上皮细胞系中和试验的结果的图。

图11是示出实施例7中的各修饰CMV gB蛋白免疫血清的上皮细胞系中和试验的结果的图。

具体实施方式

以下，对用于实施本发明的方式进行详细地说明。其中，本发明不限定于以下的实施方式。

本发明的巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)的修饰蛋白是野生型CMV gB蛋白的头部区域被修饰、且识别gB蛋白的主体区域的抗体的诱导能力得到改善的修饰CMVgB蛋白。

“野生型CMV gB”是指源自任意的CMV株的gB蛋白，例如可列举出具有序列号1中记载的氨基酸序列的源自CMV AD169株的gB蛋白(GenBank的注册号：GenBank ACCESSIONNo.：X17403.1、序列号1)。为了容易理解，除另行声明外，本说明书中的关于氨基酸残基位置的编号是以与源自AD169株且除前导序列以外的序列号1的gB蛋白的氨基酸序列的关系的方式来记载的。在此情况下，基于序列比对，将gB蛋白中的氨基酸残基的位置记为序列号1 中记载的氨基酸序列中相应的位置、即“对应位置”。

“修饰CMV gB蛋白”(也称为“gB变体”或“变体”。)是指在野生型CMV gB 中置换、缺损(缺失)或添加了至少一个氨基酸残基或连续的氨基酸残基区域的蛋白质，也包括通过氨基酸残基的置换或缺失而导入糖链的蛋白质等、进行了野生型中不存在的蛋白质修饰的蛋白质。

已经解析了CMV gB蛋白的立体结构(非专利文献8)，例如，已知在源自 AD169株的gB中具有如下结构域：具有序列号1中的第109-319位的氨基酸残基的结构域I；具有第97-108位的氨基酸残基和第320-414位的氨基酸残基的结构域II；具有第71-87位的氨基酸残基、第453-525位的氨基酸残基和第 614-643位的氨基酸残基的结构域III；具有第65-70位的氨基酸残基和第 526-613位的氨基酸残基的结构域IV；以及具有第644-675位的氨基酸残基的结构域V。

非专利文献7已报道了CMV gB的结构域结构。CMV gB蛋白中，包含结构域IV的区域称为头部区域，例如在源自AD169株的CMV gB蛋白中是由第 1-87位和第415-649位的氨基酸残基组成的区域。将主要包含结构域I和结构域II的其余的胞外域区域称为主体区域，例如在源自AD169株的CMV gB蛋白中是由第88-414位的氨基酸残基和第650-682位的氨基酸残基组成的区域。其它CMV gB蛋白的头部区域和主体区域可以通过对应于源自AD169株的CMV gB蛋白的对应位置的氨基酸残基来确定。

在CMV gB蛋白的晶体结构中，已知头部区域具有比主体区域更高的抗原呈递性，即头部区域比主体区域诱导更多的抗体。然而，结构域IV中存在的表位更多地诱导无中和活性或中和活性低的抗体。报道了其结果gB蛋白的结构域IV作为CMV的免疫逃逸机制发挥作用(非专利文献7、8)。

本发明人等进行了实际研究，结果即使在血液中的抗体中，针对头部区域的抗体比例也高于针对主体区域的抗体比例。然而另一方面，根据本发明人等的研究，野生型CMVgB的头部区域更多地诱导无中和活性或中和活性低的非中和抗体而并非诱导中和活性高的中和抗体。因此，结论是：与诱导中和抗体的中和表位相比，在头部区域存在更大量的诱导非中和抗体的非中和表位。非中和抗体虽与病毒结合，但无法抑制病毒的感染能力。因此，能够诱导中和抗体的产生对于疫苗抗原的设计是非常重要的。

对于本发明的修饰CMV gB蛋白，通过对被认为存在大量非中和表位的 gB蛋白的头部区域进行修饰，从而使中和抗体的诱导能力比头部区域更高的作为主体区域的结构域I和结构域II突出。其结果，能够改善主体区域识别抗体的诱导能力、使作为主体区域的结构域I和结构域II中存在的表位所诱导的抗体量增加，本发明的修饰CMV gB蛋白能够比野生型CMV gB蛋白诱导更多的中和抗体。

“主体区域识别抗体的诱导能力”或“主体区域识别抗体的诱导活性”是指诱导识别主体区域中存在的表位的抗体的产生的能力或活性。“中和抗体诱导能力”或“中和抗体诱导活性”是指能够诱导针对抗原蛋白质的中和抗体的能力，可以通过将抗原蛋白质接种于被检动物中而得到的免疫血清中的中和抗体效价(neutralizing antibody titer)进行评价。“中和抗体”是指能使病毒颗粒的感染性消失的抗体，例如可以通过使被检病毒的蚀斑数量减少50％所需的抗体的浓度(NT50)来评价该抗体的中和活性的高低。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，通过在头部区域加入进行糖链导入(糖链修饰)的修饰，从而可以改善识别gB蛋白的主体区域的抗体的诱导能力。进而，作为头部区域的糖链修饰，可以在2个位置进行糖链修饰。更优选在头部区域的3个位置进行糖链修饰。进一步优选可以在头部区域的4个位置进行糖链修饰，也可以在5个位置以上进行糖链修饰。

对于修饰CMV gB蛋白，可以进行下述修饰：在选自序列号1中记载的氨基酸序列的位置77、544、588和609的对应位置的氨基酸残基中的至少2个位置、或至少3个位置加入糖链修饰。优选为在序列号1中记载的氨基酸序列中的位置77、544和588的对应位置的氨基酸残基上加入糖链导入修饰的修饰、或在序列号1中记载的氨基酸序列中的位置77、544、588和609的对应位置的氨基酸残基上加入糖链导入修饰的修饰。此处，在氨基酸残基上加入糖链导入修饰的情况包括将导入糖链的目标位点的氨基酸残基以能导入糖链的方式突变为适合的其它氨基酸残基。

糖链修饰方法为通常的方法即可，没有特别限定，例如，导入N型糖链时，以野生型gB蛋白的cDNA作为模板，以使导入N型糖链的目标位点的3个连续的氨基酸序列为N-X-S/T(X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)的方式设计引物，通过PCR导入突变。用于导入糖链的突变例如可列举出序列号1中记载的氨基酸序列中的以下突变：(D77N、I79T)、(E544N、P546T)、(L588N、 P589G)、和(K609N、R610T、M611T)。将目标修饰gB蛋白的核酸序列、进而必要时连接了6×His等标签的核酸序列克隆至适合的载体上，进行表达，从而能够得到修饰CMV gB蛋白。然后，利用通常的方法将N型糖链添加至 gB变体的目标位点的天冬酰胺。

糖链导入例如优选通过下述方式进行。通过这些位置上的糖链导入而使头部区域中的表位被修饰(去免疫化)，能够得到使主体区域中的表位突出的修饰CMV gB蛋白。可认为这样的修饰CMV gB蛋白与野生型CMV gB相比能够更多地诱导中和活性高的中和抗体。

·序列号1中记载的氨基酸序列中的位置77的对应位置的氨基酸残基置换为天冬酰胺残基和位置79的对应位置的氨基酸残基置换为苏氨酸残基、和 /或

·序列号1中记载的氨基酸序列中的位置544的对应位置的氨基酸残基置换为天冬酰胺残基和位置546的对应位置的氨基酸残基置换为苏氨酸残基、和/或

·序列号1中记载的氨基酸序列中的位置588的对应位置的氨基酸残基置换为天冬酰胺残基和位置589的对应位置的氨基酸残基置换为甘氨酸残基、和/或

·序列号1中记载的氨基酸序列中的位置609的对应位置的氨基酸残基置换为天冬酰胺残基、位置610的对应位置的氨基酸残基置换为苏氨酸残基和位置611的对应位置的氨基酸残基置换为苏氨酸残基。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，通过加入使头部区域的至少一部分缺失的修饰而可以改善识别gB蛋白的主体区域的抗体的诱导能力。也可以使头部区域的全部区域缺失。通过使头部区域的至少一部分缺失，从而能够得到使头部区域中的表位去免疫化、使主体区域中的表位突出的修饰CMV gB蛋白。可认为这样的修饰CMV gB蛋白与野生型CMV gB相比能够更多地诱导中和活性高的中和抗体。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，作为主体区域中的修饰，可以包括相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的第132位的异亮氨酸残基(I132)的氨基酸残基的置换。优选列举出第132位的异亮氨酸置换为组氨酸。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，作为主体区域中的修饰，可以包括相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的第133位的酪氨酸残基(Y133)的氨基酸残基的置换。优选列举出第133位的酪氨酸置换为精氨酸。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，作为主体区域中的修饰，可以包括相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的第216位的色氨酸残基(W216)的氨基酸残基的置换。优选列举出第216位的色氨酸置换为丙氨酸。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，作为头部区域中的修饰，可以包括相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的第432位的精氨酸残基(R432)的氨基酸残基的置换。优选列举出第432位的精氨酸置换为苏氨酸。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，作为头部区域中的修饰，可以包括相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的第434位的精氨酸残基(R434)的氨基酸残基的置换。优选列举出第434位的精氨酸置换为谷氨酰胺。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，可以包括选自由相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的I132、Y133、W216、R432和R434的氨基酸残基组成的组中的至少一个氨基酸残基的置换。优选可以包含相当于头部区域中的R432和 R434这2个位置的氨基酸残基的置换。进一步优选可以包含相当于I132、Y133、 W216、R432和R434这5个位置的氨基酸残基中的全部的置换。此处，氨基酸残基的置换可以置换为其它任意的氨基酸残基，可认为通过该置换而得到的修饰CMV gB蛋白与野生型CMV gB相比能够更多地诱导中和活性高的中和抗体。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，作为主体区域中的修饰，可以包括相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的第215位的苏氨酸残基(T215)的氨基酸残基的置换。优选列举出第215位的苏氨酸置换为谷氨酸。除了T215之外，可以进一步包括相当于I132、Y133、W216、R432和R434的氨基酸残基这5个位置的置换。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，可以包括通过位于相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的位置131至133的位置(对应位置)的氨基酸Y-I-Y所定义的融合环1(FL1)结构域、或通过位于相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的位置216至218的位置的氨基酸W-L-Y所定义的融合环2(FL2)结构域的氨基酸残基的修饰。

此处对氨基酸残基的修饰也可以是氨基酸残基的缺失、置换或添加、或糖链导入。另外，也可以修饰FL1的氨基酸残基、不修饰FL2的氨基酸残基。另外，也可以修饰FL2的氨基酸残基、不修饰FL1的氨基酸残基。优选列举出修饰FL1和FL2两者的氨基酸残基。

作为FL1和FL2的氨基酸残基的修饰的一例，也可以使相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的位置131至133的氨基酸残基全部缺失。另外，也可以使相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的位置216至218的氨基酸残基全部缺失。进一步优选可以使相当于序列号1中记载的氨基酸序列中的位置128至 138的氨基酸残基缺失。

作为修饰CMV gB蛋白的一例，缺失了FL1的修饰CMV gB蛋白可以进一步在序列号1中记载的氨基酸序列中的所缺失的氨基酸残基的位置上插入连接体。优选可以使序列号1中记载的氨基酸序列中的位置128至138缺失并在该缺失的位置、即所缺失的氨基酸残基的前后的氨基酸残基之间插入连接体。进一步优选可以插入甘氨酸连接体作为连接体。

本发明的修饰CMV gB蛋白可以通过基因工程方法而制作。制作方法没有特别限定，例如可以通过将野生型gB蛋白的cDNA作为模板、设计用于导入目标突变的引物并通过PCR得到导入了突变的核酸，与表达启动子功能性连接，根据情况也连接标签，将其导入适合的表达载体中并表达，由此能够得到。另外，在基于糖链导入的变体的情况下，可以如上述那样得到。

所制作的修饰CMV gB蛋白可以根据需要进行纯化。纯化方法没有特别限定，可列举出基于亲和色谱柱等的纯化。

本发明的CMV疫苗包含本发明的修饰CMV gB蛋白。

本实施方式的CMV疫苗的剂型例如也可以是液态、粉末状(冷冻干燥粉末、干燥粉末)、胶囊状、片剂、冷冻状态。

本实施方式的CMV疫苗可以包含对于药物而言可接受的载体。作为上述载体，可以没有限制地使用在疫苗制造中通常使用的载体，具体而言，可列举出盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、等渗水性缓冲液和它们的组合。疫苗可以进一步适宜配混乳化剂、保存剂(例如，硫柳汞)、等渗剂、pH调节剂、灭活剂(例如，福尔马林)等。

为了进一步提高本实施方式的CMV疫苗的免疫原性，也可以进一步包括佐剂。作为佐剂，例如可列举出包含铝佐剂或角鲨烯的水包油型乳浊佐剂 (AS03、MF59等)、CpG和3-O-脱酰化-4’-单磷酰基脂A(MPL)等Toll样受体的配体、皂苷系佐剂、聚γ-谷氨酸等聚合物系佐剂、壳聚糖和菊糖多糖类。

本实施方式的CMV疫苗可以通过将本发明的修饰CMV gB蛋白与根据需要的载体、佐剂等混合而得到。佐剂也可以是在使用时进行混合者。

本实施方式的CMV疫苗的给药路径例如可以是经皮给药、舌下给药、点眼给药、皮内给药、肌肉给药、经口给药、经肠给药、经鼻给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药、自口吸入至肺的吸入给药。

本实施方式的CMV疫苗的给药方法例如可以是通过注射器、经皮贴片、微针、可移植的缓释性装置、带有微针的注射器、无针装置、喷雾进行给药的方法。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行更具体地说明。其中，本发明不限定于以下的实施例。

实施例1CMV gB蛋白及其变体的制备

将源自AD169株的CMV gB的胞外域(ectodomain)(序列号1中的位置 1-682的氨基酸残基、本说明书中根据情况称为“gB1-682”))克隆至在国际公开第03/004647号中公开的pCAGGS1-dhff-neo。设计成在gB的C末端添加有 His标签、Strep tagII或FLAG标签。以此为基础制作了表1所示的变体和表2 所示的变体。

[表1]

表1

表1所示的“gB1-682-fm”是在gB1-682中进行了R434A和R435A的氨基酸残基的置换的变体，“gB1-682-fm3Mv9”是参考非专利文献8在gB1-682中进行了I132H、Y133R、T215E、W216A、R432T和R434Q的氨基酸残基的置换的变体。

[表2]

表2

表2所示的变体(1)“gB1-682-fm3M”是在gB1-682中进行了I132H、Y133R、 W216A、R432T、R434Q的氨基酸残基的置换的变体，变体(2)“gB-D1”是 gB1-682中的位置1-108和320-682缺失、且进行了I132A、Y133A和W216A的氨基酸残基的置换的变体，变体(3)“gB-D2”是用IAGSG的5个氨基酸残基连接了使gB1-682中的位置1-87和109-682缺失的缺失体与使gB1-682中的位置 1-319和415-682缺失的缺失体的变体，变体(4)“gB-Δd1”是用IAGSG的5个氨基酸残基连接了使gB1-682中的位置109-682缺失的缺失体与使gB1-682中的位置1-319和650-682缺失的缺失体的变体。

各变体的表达使用Freestyle293或Expi293表达系统(Life Technologies公司)。将表达质粒转染至细胞中，在4～6天内回收了培养上清液。对于包含添加了His标签的gB变体的培养上清液，进行使用了Ni-NTA Agarose(QIAGEN 公司Cat.30230)的纯化，获得纯化gB变体。对于包含添加了Strep TagII的gB 变体的培养上清液，为了去除培养基中包含的生物素，用UF膜(Ultracel YM-3/Millipore公司Cat.4303或Centriprep-10K/Millipore公司Cat.4305)置换为PBS缓冲液及进行浓缩。对浓缩的培养上清液进行使用了StrepTactin柱的纯化，获得纯化gB变体。对于包含添加了FLAG标签的gB变体的培养上清液，进行使用了抗-FLAG M2 Agarose Affinity gel(SIGMA-ALDRICH公司 Cat.A2220)的纯化，获得纯化gB变体。

实施例2抗gB抗体的制作

通过对使用人VH和VL的cDNA由人B细胞(例如淋巴结、脾脏)来源的 mRNA制备的包含10

具体而言，将gB抗原固相化在96孔培养板上，与包含scFv分子的噬菌体展示文库反应，清洗后用碱性溶液进行洗脱。使用大肠杆菌TG1株和M13KO7 辅助噬菌体拯救包含scFv分子的噬菌体。将该循环重复2～3次，浓缩并分离了gB抗原特异性噬菌体克隆。

在筛选时进行减法的情况，利用以下的方法进行。将gB抗原固相化在96 孔培养板上，与包含scFv分子的噬菌体展示文库反应时，使下述的1-3-13、 6-2-8、8-2-2的scFv-hFc共存。清洗工序之后的工序利用与上述筛选同样的方法进行。

筛选的结果，获得了65种克隆。获得的克隆名为“J9”、“J19”、“J25”、“J47”、“J58”、“J61”、“J82”、“J92”、“K12”、“K17”、“K29”、“K42”、“K61”、“K74”、“K90”、“K91”、“M33”、“N66”、“N79”、“N80”、“N93”、“P12”、“P30”、“P40”、“P86”、“Q5”、“Q12”、“Q25”、“Q38”、“Q41”、“Q44”、“Q62”、“Q92”、“R18”、“R23”、“R40”、“R47”、“R57”、“R87”、“S68”、“S80”、“1-3-13”、“2-3-4”、“2-3-42”、“2-3-77”、“3-3-15”、“3-3-88”、“6-2-5”、“6-2-8”、“6-2-18”、“6-2-98”、“6-2-146”、“6-3-106”、“7-2-25”、“7-2-36”、“7-2-58”、“7-2-64”、“7-2-66”、“7-3-38”、“7-3-45”、“8-2-2”、“8-2-12”、“8-2-16”、“8-2-72”和“8-2-82”。

将分离的scFv基因的可变区与源自人IgG1的Fc基因(CH2-CH3)连接，克隆至参考国际公开第2015/115331号而制作的pCAGGS1-dhfr-neo载体，构建了scFv-hFc表达质粒。表达中使用FreeStyle293或Expi293表达系统(Life Technologies公司)。将表达质粒转染至细胞中，在4～6天内回收了培养上清液。使用Ab-Rapid PuRe 10(ProteNova公司Cat.P-012-10)或Ab-Rapid PuRe Ex(ProteNova公司Cat.P-015-10)将培养上清液纯化，得到scFv-hFc。

<人IgG的制作方法>

接着，将分离的scFv基因的VH区与源自人IgG1的H链恒定区基因 (CH1-CH2-CH3)连接，克隆至参考国际公开第2015/115331号而制作的 pKMA010-hCg1载体，构建了H链表达质粒。另外，将VL区域与人CL基因连接，克隆至参考国际公开第2015/115331号而制作的pKMA009-hCL载体，构建了L链表达质粒。表达中使用FreeStyle293或Expi293表达系统(Life Technologies公司)。将表达质粒转染至细胞中，在4～6天内回收了培养上清液。使用Hi-Trap ProteinA HP Column(GE Healthcare公司Cat.17040303)将培养上清液纯化，得到人IgG。

在2×YTCG培养基(37℃)中培养具有克隆有分离的scFv基因的噬菌粒载体的大肠杆菌TG1株，以moi＝20使M13K07辅助噬菌体感染后，在2×YTCK 培养基(25℃)中过夜进行噬菌体的表达。对得到的scFv噬菌体进行基于20％-PEG-2.5M NaCl的浓缩。

实施例3gB抗体的反应性解析和分组

<基于与各变体的结合活性的scFv噬菌体的分组>

使用实施例1的表2所示的变体对实施例2中得到的scFv噬菌体的结合活性通过ELISA进行评价。用PBS(SIGMA)将各变体稀释至1μg/mL，在 MaxiScorp plate(Nunc)中加入100μL，在4℃下过夜或在室温下孵育1～2小时，由此使各变体固相化。

固相化后用PBS清洗培养板，将获得的scFv噬菌体100μL加入培养板的孔中，在室温下孵育1小时。然后用PBS-0.05％Tween20(PBST)清洗后，将检测抗体抗-M13/HRP(GEHealthcare公司Cat.27-9421-01)100μL加入培养板的孔中，在室温下孵育1小时。然后用PBST清洗，通过将100μL TMB(SIGMA 公司Cat.T-4444)加入培养板的孔中使其显色。30分钟后，用1N硫酸使反应停止，利用酶标仪(Molecular Devices,LLC.)测定了显色值(O.D.450nm/650nm)。

通过获得的65个克隆的抗体与实施例1中制作的变体的反应性的差异而确定了各抗体的识别区域。作为变体，使用实施例1的表2所示的变体 (1)gB1-682-fm3M、变体(2)gB-D1、变体(3)gB-D2、变体(4)gB-Δd1。

通过与各变体的反应性将获得的65个克隆的抗体分类，将与变体(2)或(3) 具有反应性者、以及与变体(1)具有反应性且与变体(4)不具有反应性者分类为主体区域识别抗体；将与变体(1)具有反应性而并非是上述主体区域识别抗体者分类为头部区域识别抗体。

其结果，可以将65个克隆分为主体区域识别抗体21个克隆及头部区域识别抗体44个克隆。由该结果可知：获得的65个克隆的抗体的表位集中在头部区域。

<基于scFv噬菌体与scFv-Fc的竞争ELISA的分组>

通过实施例2中得到的scFv噬菌体与scFv-Fc之间的竞争ELISA而进行了 65个克隆的抗体的分类。将表1所示的变体gB1-682 fm3Mv9用PBS(SIGMA) 稀释至1μg/mL，在MaxiSorp Plate(Nunc)中加入100μL，在4℃下孵育过夜从而使变体固相化。固相化后用PBS清洗培养板，将获得的scFv-Fc 50μL加入培养板的孔中，在室温下孵育1小时。然后用PBST清洗，将检测抗体抗 -M13/HRP(GE Healthcare公司Cat/27-9421-01)100μL加入培养板的孔中，在室温下孵育1小时。然后用PBST清洗后，将100μL TMB(SIGMA Cat.T-4444) 加入培养板的孔中由此使其显色。30分钟后，用1N硫酸使反应停止，利用酶标仪(MolecularDevices，LLC.)测定了显色值(O.D.450nm/650nm)。

如表3所示，基于各抗体的反应性的趋势，将主体区域细分为7组，将头部区域细分为13组。

[表3]

表3 主体区域识别抗体和头部区域识别抗体的分组

实施例4各抗体的中和试验

[细胞和病毒的制备]

<成纤维细胞系的细胞和病毒的制备>

成纤维细胞系的病毒的培养、中和试验、及中和抗体诱导能力解析使用从ATCC购入的MRC-5细胞(CCL.171)。细胞培养用培养基通过在MEM培养基中添加2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、及非必需氨基酸(甘氨酸、L- 丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸各10mM) 而制备。在增殖、维持和解析培养板制作时使用含10％FBS的培养基，在中和抗体诱导能力评价时使用含2％FBS的培养基，均在37℃、5％的CO

成纤维细胞系的中和试验、及中和抗体诱导能力解析中使用的病毒使用从ATCC购入的人疱疹病毒(Human herpesvirus)5(CMV)AD169株(VR-538)。以moi＝0.1～1将病毒接种至整片MRC-5细胞中后，在含2％FBS的培养基中培养4～11天，进行3次冷冻融解后，在室温下进行10分钟2150g的离心，将该上清液作为使用成纤维细胞的中和抗体效价解析用的病毒库。

<上皮细胞系的细胞和病毒的制备>

上皮细胞系的病毒的培养、中和试验、及中和抗体诱导能力解析中使用从ATCC购入的APRE-19细胞(CRL2302)。人上皮细胞ARPE-19使用含 10％FBS的F12/DMEM培养基(Fisher Scientific)以1：5进行传代培养。

对于上皮细胞系的中和试验、及中和抗体诱导能力解析中使用的病毒，使APRE-19细胞感染AD169株(VR-538)，使感染细胞与非感染细胞以1：4至1： 10的比例进行长期传代，由此建立了能在APRE-19细胞中增殖的AD169rev 株。用含10％FBS的培养基将呈现出50％CPE的CMV AD169rev株感染细胞调整至0.1moi，将其接种至约80％整片ARPE-19细胞中。接种后培养1周，回收培养液，在室温下进行10分钟1800g的离心，将其上清液作为用上皮细胞的中和抗体效价解析用的病毒库(5-10×10

[中和试验]

<各抗体的成纤维细胞系中的中和试验>

使用了成纤维细胞的中和抗体效价解析使用斑点数减少活性(Focus-Reductionactivity)来进行。解析中，使用将在经CellBIND加工的黑壁96孔板(Corning 3340)或sellcarrier-96超胶原蛋白涂层板(PerkinElmer 6055700)中以2×10

将各单克隆抗体系列稀释而调整为规定的浓度，与约100～1000PFU的 CMV AD169株混合，然后在37℃下反应1小时。将反应液以30μL/孔接种在解析培养板的细胞中，然后在室温下进行30分钟400g的离心而将病毒吸附至细胞上。去除反应液，用不含FBS的培养基清洗1次后，用含2％FBS的培养基培养16～20小时。培养后，在室温下对细胞进行20分钟基于50％丙酮/PBS 的灭活和固定。然后，在室温下用0.1％的Triton-X100处理10分钟，清洗后使抗CMV IE1-IE2单克隆抗体(CH160：Abcam ab53495、Santacruz sc-69748)1μg/mL在37℃下反应1小时。清洗后使山羊抗-兔子IgG H&L(Alexa Fluor(注册商标)488)(Abcamab150077)1μg/mL在37℃下反应1小时，进一步清洗后使-Cellstain(注册商标)-Hoechst33342溶液(dojindo 346-07951)1μg/mL在室温下反应10分钟，在清洗的培养板中以100μL/孔添加含0.5％BSA的PBS，用ImageXpress micro(Molecular Devices)获取各孔的图像，使用解析软件 MetaXpress(Molecular Devices)对CMV IE1-IE2单克隆抗体反应细胞数和总细胞数进行计数，计算出总细胞数中的CMV IE1-IE2单克隆抗体反应细胞数的比例。以仅添加了病毒时的CMV IE1-IE2单克隆抗体反应细胞数的比例为基准，由各免疫血清所致的细胞数的比例的抑制率判定了中和活性。

<各gB抗体的上皮细胞系中的中和试验>

使用了上皮细胞的各抗体的中和抗体效价解析使用斑点数减少活性 (Focus-Reduction activity)来进行。解析中使用将在24孔培养板(Corning 3526) 中以7×10

[表4]

表4主体区域识别抗体针对MRC5细胞和ARPE细胞的中和活性

N.T.：未试验

[表5]

表5头部区域识别抗体针对MRC5细胞和ARPE细胞的中和活性

N.T.：未试验

对于MRC-5(成纤维细胞)感染系统、ARPE(上皮细胞)感染系统中的病毒中和活性，以1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的3种浓度进行解析，将在50％蚀斑减少浓度(IC50)下观察的病毒中和活性强度为1μg/mL以下的强中和抗体评价为“+++”，将为1～10μg/mL的中等程度的中和抗体评价为“++”，将为 10～100μg/mL的较弱的中和抗体评价为“+”，将在100μg/mL下为低于50％的蚀斑减少率但稍显示出中和倾向的抗体评价为“±”，将完全未显示出中和活性的非中和抗体评价为“-”。需要说明的是，“NT”是指未进行试验。

MRC-5感染系统中，主体区域识别抗体21个克隆中，在50％蚀斑数量减少浓度(IC50)下观察的病毒中和活性强度为1μg/mL以下的较强的中和抗体 (+++)为14个克隆，为1～10μg/mL的中等程度的中和抗体(++)为1个克隆，为 10～100μg/mL的较弱的中和抗体(+)为3个克隆，在100μg/mL下完全未显示出中和活性的非中和抗体(-)为3个克隆。

另一方面，头部区域识别抗体44个克隆中，没有较强的中和抗体(+++)，中等程度的中和抗体(++)为2个克隆，较弱的中和抗体(+)为4个克隆，另外在 100μg/mL下为低于50％的蚀斑数量减少率但显示出中和倾向的抗体(±)为6个克隆，完全未显示出中和活性的非中和抗体(-)为32个克隆。

关于在ARPE感染系统中所研究的28个克隆的病毒中和活性(50％斑点数减少浓度)的结果，大致上在MRC-5感染系统中显示出中和活性的克隆在 ARPE感染系统中也观察到显示出中和活性的倾向，但存在一部分仅在其中一个系统中显示出中和活性的抗体、在两个系统中显示出中和活性但活性强度有显著差异的抗体等。

由以上确认了：识别头部区域的抗体大部分为非中和抗体，识别作为主体区域的结构域I和II的抗体大多数为较强的中和抗体。

实施例5变体与各gB抗体的反应性解析

<变体的制作>

本发明人等认为诱导中和抗体的中和表位是有益的表位、诱导非中和抗体的非中和表位为有害/无益的表位。因此，为了使头部区域中存在的非中和表位去免疫化，大致制定了2个方案，并设计了修饰gB抗原。

第1个方案是，通过添加N型糖链来修饰gB。N型糖链与O型糖链不同，被赋予至作为共有序列的NXT或NXS的序列。通常难以形成针对糖肽的抗体，由于糖链的庞大性而在其周边也难以形成抗体(The Journal of Immunology, 1997,159 279-289.)。CMV gB的头部区域被认为是对于与受体的结合而言重要的区域，但它位于距离病毒膜表面最远的位置且暴露于表面，因此抗体容易结合。实际上，在人血清中，包含大量识别作为头部区域的一部分的结构域IV的抗体(非专利文献7)。因此，我们决定将N型糖链导入头部区域中结构域IV和结构域III的非中和表位。

另一方面，作为主体区域的一部分的结构域I位于gB的底部，是对于与宿主细胞的融合而言重要的区域，但在仅表达胞外域时，原本与病毒膜表面接触的区域可能会暴露于表面。为了避免这种情况，进行了使该暴露区域(融合环部分)缺失的修饰。

第2个方案是使一部分头部区域缺失。制作了该方案的变体。将制作的变体和其表达量示于表6。作为制作方法，与实施例1的变体的制作方法同样地，将源自CMV的AD169株的gB的胞外域(1-682aa)克隆至公开于国际公开第 03/004647号的pCAGGS1-dhfr-neo。设计成在gB的C末端添加了His标签。

表达中使用FreeStyle293或Expi293表达系统(Life Technologies公司)。将表达质粒转染至细胞中，在4～6天内回收了培养上清液。对于包含修饰CMV gB的培养上清液，进行使用了Ni-NTA Agarose(QIAGEN公司Cat.30230)的纯化，获得纯化修饰CMV gB。将每1mL培养上清液的蛋白收量作为表达量汇总于6。通过ELISA评价了纯化修饰CMV gB的结合活性。

制作的修饰CMV gB中，VC5、VC6、VC11、VC15这4种变体与未导入突变的变体相比表达量降低、分解物或聚集物增加。可认为这是由于：通过导入一个糖链而变得无法确保原本的gB立体结构(三聚体)而表达量减少，进而在表达/制备时被蛋白酶降解。因此，未对VC5、VC6、VC11、VC15进行 ELISA评价。

[表6]

表6制作的变体及其表达量

<变体与抗体的竞争ELISA>

将各纯化变体用PBS(SIGMA)稀释至1μg/mL，在MaxiSorp plate(Nunc)中加入50μL，在4℃下孵育过夜由此使纯化变体固相化。固相化后用PBS清洗培养板，将实施例4中评价的抗体加入培养板的孔中100μL并在室温下进行孵育。1小时后用PBST清洗，将检测抗体抗人IgG Fc/HRP(ROCKLAND公司 Cat.709-1317)100μL加入培养板的孔中，在室温下进行孵育。1小时后用PBST 清洗，将TMB(SIGMA公司Cat.T-4444)加入培养板的孔中100μL由此使其显色。30分钟后，用1N硫酸使反应停止，利用酶标仪(Molecular Devices，LLC.) 测定了显色值(O.D.450nm/650nm)。将测定的结果示于表7和表8。

[表7]

表7主体区域识别抗体的反应性

[表8]

实施了制作的变体VC7、VC9、VC10、VC12、VC13、VC14、VC16的反应性解析。使用gB1-682-fm3M v9作为对照。其结果，VC7通过导入K609N、 R610T、M611T的突变而与作为头部区域识别抗体的K29、S80、J92、K74、 1-3-13、R18、R47、J82的反应性消失，同样地VC9通过导入K543N的突变而与J47的反应性消失，VC10通过导入E544N、P546T的突变而与J47、J82、J61、K61、J58的反应性消失。

变体VC11与VC12的修饰氨基酸位点相同。然而，考虑到通过添加糖链而引起的空间位阻和结构的变形，对于VC11导入G579N、H581T的突变、对于VC12导入G579N、H581S的突变，结果VC11观察到表达量的降低和聚集物的增加，但VC12保持了三聚体结构，与J47、Q92、K17、J82、N66、N93 的抗体的反应性消失。

变体VC13与VC14的修饰氨基酸位点相同。然而，出于通过将容易赋予角度的P589变为自由度高的Gly来维持结构的目的，对于VC13导入L588N、 P589A的突变、对于VC14导入L588N、P589G的突变。其结果，表达量和性状方面几乎无差异，且与K17、J82、N66、J61、J58、N93的抗体的反应性均消失。

考虑到由糖链添加位点所致的结构变化，而对于变体VC15与VC16将糖链导入附近的氨基酸并进行了比较。对于VC15导入V604N、Y606T的突变，对于VC16导入D605N、L607T的突变，结果观察到VC15中表达量的降低和聚集物的增加。VC16保持了三聚体结构，与K17、J82、N66抗体的反应性消失。

变体VC22通过Q74N的突变而与K29、S80抗体的反应性消失，VC23通过导入D77N、I79T的突变而与J9、K29、S80、J19的反应性消失。

变体VC33通过导入VC10的突变(E544N、P546T)和VC14的突变(L588N、 P589G)而与J47、K17、J82、N66、J61、K61、J58、N93抗体的反应性消失。该情况与VC10和VC14的导入各一个糖链时被掩蔽的抗体一致，表明即使导入多个糖链，也能在维持结构的基础上实现通过糖链来掩蔽表位。

变体VC24通过导入VC7的突变(K609N、R610T、M611T)和VC10的突变 (E544N、P546T)和VC14的突变(L588N、P589G)而与K29、S80、J92、K74、 1-3-13、R18、R47、J47、K17、J82、N66、J61、K61、J58、N93抗体的反应性消失。

变体VC31通过导入VC7的突变(K609N、R610T、M611T)和VC10的突变 (E544N、P546T)和VC14的突变(L588N、P589G)和VC23的突变(D77N、I79T) 而与J9、K29、S80、J92、K74、1-3-13、R18、R47、J47、P40、Q92、K17、 J82、N66、J61、K61、J58、N93抗体的反应性消失。VC31的情况下，在VC7、 VC10、VC14、VC23的导入各一个糖链时所掩蔽的抗体中J19抗体的反应性降低的程度变弱。另外，各自单独的情况下反应性未降低的P40、Q92的反应性降低，认为这是由于，所导入的糖链数增加，因此由微小的结构变化导致了表位的暴露、由糖链的庞大性而导致表位进一步消失。

变体VC39以使融合环1、2缺失的gB1-682-fm3M Del21为基础，通过导入VC10的突变(E544N、P546T)和VC14的突变(L588N、P589G)而与J47、K17、 J82、N66、J61、K61、J58、N93抗体的反应性消失。该情况与VC10和VC14 的导入各一个糖链的情况一致。另外，与通过以gB1-682-fm3M v9为基础导入了VC10的突变和VC14的2个突变的VC31使反应性降低的抗体一致。由该结果可知：即使使融合环部分缺失、进而导入多个糖链，也能够在维持结构的同时通过糖链来掩蔽表位。

变体VC40通过以gB1-682-fm3M Del21为基础导入VC10的突变(E544N、 P546T)和VC14的突变(L588N、P589G)和VC23的突变(D77N、I79T)而与J9、 K29、S80、J47、Q92、K17、J82、N66、J61、K61、J58、N93抗体的反应性消失。与VC10、VC14、VC23的导入糖链各一个的情况相比，抗体的反应性几乎一致，但VC23的糖链单独的情况下反应性消失的J19的反应性在VC40 中得到保持。另外，VC10、VC14、VC23中保持了反应性的Q92的反应性在 VC40中消失。该情况也与VC31同样，认为这是由于，所导入的糖链数增加，因此由微小的结构变化而导致表位暴露、由糖链的庞大性而导致表位进一步消失。

变体VC37通过以gB1-682-fm3M Del21为基础导入VC7的突变(K609N、 R610T、M611T)和VC10的突变(E544N、P546T)和VC14的突变(L588N、P589G) 和VC23的突变(D77N、I79T)而与J9、K29、S80、J92、K74、1-3-13、R18、 R47、J47、P40、Q92、K17、J82、N66、J61、K61、J58、N93抗体的反应性消失。这也与通过以gB1-682-fm3M v9为基础导入了VC7、VC10、VC14、VC23的突变的VC31使反应性降低的抗体一致。

对于变体D1D2，在考虑立体结构的同时去除包含结构域IV的头部区域的一部分，用GGGSGSGGG连接体使gB97至468与gB631至682结合，进而导入融合环部分的Y131A、I132A、Y133A、W216A的氨基酸修饰和弗林蛋白酶切位点的R432T、R434Q的氨基酸修饰而制作。不仅结合作为主体区域的结构域I、结构域II，而且残留成为三聚体的中心的结构域V，进而对融合环部分的氨基酸进行修饰，由此在维持三聚体结构的同时保持了与gB1-682同等的表达量。另外，实施了与已获得抗体的反应性解析ELISA，结果维持与主体区域识别抗体8种的反应性，且与头部区域识别抗体的反应性消失。

变体(D1D2)×2通过用GGGGSGGGGS的连接体连接二个D1D2而制作， (D1’D2)×2通过使(D1D2)×2的融合环1、2缺失而制作。实施了(D1D2)×2和 (D1’D2)×2与已获得抗体的反应性解析ELISA，结果维持与主体区域识别抗体8种的反应性，且头部区域识别抗体的反应性完全消失。

实施例6变体抗原的豚鼠免疫原性试验和免疫再聚焦的解析

通过ELISA进行了实施例5中制作的变体VC31、VC33、VC37、VC39、 VC40、D1D2和(D1D2)×2的头部区域和主体区域的抗体诱导能力的评价。

<免疫血清的制作>

以实施例5中制作的变体gB1-682-fm3M v9、VC31、VC33、VC37、VC39、 VC40、D1D2和(D1D2)×2作为抗原免疫豚鼠。作为对照，将gB1-682-fm3M v9 作为野生型gB抗原的替代抗原。以成为0.2、1、5μg/只的方式用生理盐水(大冢制药)调整各抗原，使用作为佐剂的10v/v％的Alum(Invivogen)和50μg/只的CpG ODN1826(Invivogen)。将调整的抗原液每隔2周对Hartley豚鼠(雌性3只/ 组)进行肌肉接种(100μL/后肢双脚)，接种3次，在最终免疫后2周，在异氟醚吸入麻醉下通过心脏采血进行了全血采血。将得到的血液在含有凝固促进剂的分离管中进行血清分离。使用该血清，评价了针对gB1-682-fm3M v9的结合抗体效价诱导活性(抗-gB ELISA)。

<通过ELISA的结合抗体效价诱导活性测定>

将gB1-682-fm3M v9或D1D2抗原用PBS(SIGMA)稀释至1μg/mL，在 MaxiSorp plate(Nunc)中加入50μL，在4℃下孵育过夜，由此使抗原固相化。固相化后用PBS清洗培养板，用PBS将获得的gB抗原免疫血清系列稀释，在培养板的孔中加入100μL并在室温下进行孵育。1小时后用PBST清洗，将检测抗体抗-human IgG Fc/HRP(ROCKLAND公司Cat.709-1317)100μL加入培养板的孔中，在室温下进行孵育。1小时后用PBST清洗，将TMB(SIGMA公司Cat.T-4444)加入培养板的孔中100μL由此使其显色。30分钟后，用1N硫酸使反应停止，利用酶标仪(Molecular Devices,LLC.)测定了显色值 (O.D.450nm/650nm)。

对于变体抗原VC31、VC33、VC37、VC39、VC40、D1D2和(D1D2)×2 的免疫血清，分别通过使gB1-682-fm3M v9和结构域IV缺失的D1D2固相化的 ELISA来解析了是否诱导了免疫再聚焦。

将结果示于图1～7，图1～7中的(a)示出将gB1-682-fm3M v9固相化的 ELISA的结果，(b)示出将D1D2固相化的ELISA的结果。确认了：与 gB1-682-fm3M v9的免疫血清相比，VC31、VC33、VC37、VC39、VC40、 D1D2和(D1D2)×2的免疫血清均显示出同等或相对低的针对gB1-682-fm3M v9的结合抗体活性，而针对D1D2的结合抗体活性升高，针对主体区域的抗体组(抗体组比率)升高。

可认为本结果是如下结果：通过针对作为CMV gB抗原的头部区域的一部分的结构域III或结构域IV导入N型糖链或通过包含结构域IV的头部区域的缺失突变而实现非中和表位(有害/无益的表位)的去免疫化，从而能够更有效/高效地针对残留于作为重要区域的主体区域上的中和表位(有益的表位) 诱导免疫应答。换言之，可认为通过免疫再聚焦策略而将针对CMV gB抗原上的诱饵区域的偏向免疫应答(免疫偏向)校正(免疫校正)为理想的形式。

实施例7使用了变体抗原的豚鼠抗血清的中和试验

除了实施例6中制作的VC31、VC37、VC40和(D1D2)×2的免疫血清之外，使用(D1’D2)×2的免疫血清，评价了成纤维细胞系和上皮细胞系中的中和抗体诱导活性(蚀斑数量减少率)。

使用了成纤维细胞的中和抗体效价解析使用斑点数减少活性 (Focus-Reductionactivity)来进行。解析中，使用将在经CellBIND加工的黑壁 96孔板(Corning 3340)或细胞载体-96超胶原蛋白涂层板(PerkinElmer 6055700)以2×10

将成纤维细胞系中和试验的结果示于图8和9。图8和9的图中绘制了n＝3 的平均值，并附带了±SE误差条。确认了：与gB1-682-fm3M v9相比，VC31、 VC37、VC40、(D1D2)×2和(D1’D2)×2的免疫血清诱导了更高的中和抗体活性。

使用了上皮细胞的中和抗体效价解析使用斑点数减少活性 (Focus-Reductionactivity)来进行。解析中使用将在细胞载体-96超胶原蛋白涂层板(PerkinElmer6055700)中以2×10

将上皮细胞系中和试验的结果示于图10和11。图10和11的图中绘制了 n＝3的平均值，并附带了±SE误差条。确认了：与gB1-682-fm3M v9相比，VC31、 VC37、VC40、(D1D2)×2和(D1’D2)×2的免疫血清诱导了更高的中和抗体活性。

可认为以上的结是如下结果：通过针对作为CMV gB抗原的头部区域的结构域III或结构域IV导入N型糖链或通过作为头部区域的一部分的结构域 IV的缺失突变而实现非中和表位(有害/无益的表位)的去免疫化，从而能够更有效/高效地针对残留于作为重要区域的主体区域上的中和表位(有益的表位) 诱导免疫应答。换言之，可认为通过免疫再聚焦策略而将针对CMV gB抗原上的诱饵区域的偏向免疫应答(免疫偏向)校正(免疫校正)为理想的形式。

产业上的可利用性

本发明的修饰CMV gB蛋白能够用于制作对CMV感染症的预防和治疗有效的疫苗。

序列表

<110> KM生物医薬股份公司（KM Biologics Co., Ltd.）

<120> 修饰CMV gB蛋白及包含其的CMV疫苗

<130> FP19-0912-00

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 882

<212> PRT

<213> 人巨细胞病毒(human cytomegalovirus)

<400> 1

Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr Ser Ser Thr His Asn Gly Ser His

1 5 10 15

Thr Ser Arg Thr Thr Ser Ala Gln Thr Arg Ser Val Tyr Ser Gln His

20 25 30

Val Thr Ser Ser Glu Ala Val Ser His Arg Ala Asn Glu Thr Ile Tyr

35 40 45

Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys

50 55 60

Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met Ala Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg

65 70 75 80

Phe Glu Arg Asn Ile Ile Cys Thr Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp

85 90 95

Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His

100 105 110

Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln Lys Val Leu Thr Phe Arg Arg Ser

115 120 125

Tyr Ala Tyr Ile Tyr Thr Thr Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr

130 135 140

Val Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile His His Ile Asn Lys Phe Ala Gln

145 150 155 160

Cys Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val Ile Gly Gly Thr Val Phe Val Ala

165 170 175

Tyr His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Thr Met Gln Leu Ile Pro Asp

180 185 190

Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln

195 200 205

Trp His Ser Arg Gly Ser Thr Trp Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu

210 215 220

Asn Cys Met Leu Thr Ile Thr Thr Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His

225 230 235 240

Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp Val Val Tyr Ile Ser Pro Phe Tyr

245 250 255

Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser Tyr Phe Gly Glu Asn Ala Asp Lys

260 265 270

Phe Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr Ile Val Ser Asp Phe Gly Arg Pro

275 280 285

Asn Ala Ala Pro Glu Thr His Arg Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala

290 295 300

Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile Gln Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys

305 310 315 320

Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser Glu Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala

325 330 335

Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser Ala Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu

340 345 350

Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn Met Ser Asp Ser Ala Leu Asp Cys Val

355 360 365

Arg Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu Gln Gln Ile Phe Asn Thr Ser Tyr

370 375 380

Asn Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Ser

385 390 395 400

Gly Gly Leu Val Val Phe Trp Gln Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val

405 410 415

Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg Ser Ser Leu Asn Ile Thr His Arg

420 425 430

Thr Arg Arg Ser Thr Ser Asp Asn Asn Thr Thr His Leu Ser Ser Met

435 440 445

Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp

450 455 460

Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala

465 470 475 480

Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser

485 490 495

Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile

500 505 510

Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr

515 520 525

Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu

530 535 540

Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser Arg Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala

545 550 555 560

Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile

565 570 575

Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys

580 585 590

Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe

595 600 605

Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser Ser Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile

610 615 620

Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu

625 630 635 640

Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu

645 650 655

Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val

660 665 670

Glu Asp Lys Val Val Asp Pro Leu Pro Pro Tyr Leu Lys Gly Leu Asp

675 680 685

Asp Leu Met Ser Gly Leu Gly Ala Ala Gly Lys Ala Val Gly Val Ala

690 695 700

Ile Gly Ala Val Gly Gly Ala Val Ala Ser Val Val Glu Gly Val Ala

705 710 715 720

Thr Phe Leu Lys Asn Pro Phe Gly Ala Phe Thr Ile Ile Leu Val Ala

725 730 735

Ile Ala Val Val Ile Ile Thr Tyr Leu Ile Tyr Thr Arg Gln Arg Arg

740 745 750

Leu Cys Thr Gln Pro Leu Gln Asn Leu Phe Pro Tyr Leu Val Ser Ala

755 760 765

Asp Gly Thr Thr Val Thr Ser Gly Ser Thr Lys Asp Thr Ser Leu Gln

770 775 780

Ala Pro Pro Ser Tyr Glu Glu Ser Val Tyr Asn Ser Gly Arg Lys Gly

785 790 795 800

Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ala Pro Pro Tyr Thr

805 810 815

Asn Glu Gln Ala Tyr Gln Met Leu Leu Ala Leu Ala Arg Leu Asp Ala

820 825 830

Glu Gln Arg Ala Gln Gln Asn Gly Thr Asp Ser Leu Asp Gly Gln Thr

835 840 845

Gly Thr Gln Asp Lys Gly Gln Lys Pro Asn Leu Leu Asp Arg Leu Arg

850 855 860

His Arg Lys Asn Gly Tyr Arg His Leu Lys Asp Ser Asp Glu Glu Glu

865 870 875 880

Asn Val