技术领域
本发明属于药物制剂技术领域,具体涉及一种细胞穿膜肽修饰的药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
靶向递送系统一直是纳米药物研究的热点,传统的单一机制靶向系统在实际应用中往往靶向效率较低、疗效不理想。近年来,研究人员开始研究基于肿瘤微环境的多重靶向递送技术。肿瘤微环境是一个复杂的综合系统,主要由肿瘤细胞、脉管系统、成纤维细胞、免疫细胞及细胞外基质组成。肿瘤组织具有较高的细胞密度,血管分布不均匀。由于肿瘤组织的挤压导致其血流量低于正常组织,具有较高间质压,阻碍了药物跨过血管壁。此外,肿瘤细胞间质中胶原纤维含量较高,间质黏度的增大阻碍了纳米药物扩散,使药物难以递送至肿瘤深部发挥疗效。在实体瘤中,其细胞外的pH值(6.5~6.8)普遍低于正常组织和血液的pH值(7.2~7.4)。因此,目前很多研究利用肿瘤组织这一特殊的微环境构建pH敏感型药物递送系统。
细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides,CPPs)是一段具有细胞膜穿透作用的短肽,其序列中通常含有较多碱性氨基酸(如精氨酸和赖氨酸),因此,CPPs一般呈正电性,从而能够发挥对不同类别细胞的穿透作用,这一特点也决定了CPPs的穿膜作用不具有靶向性,难以实现药物的精准递送。
2004年,Roger Y.Tsien团队提出了可活化细胞穿膜肽(Activatable cell-penetrating peptides,ACPPs)概念(Tao Jiang,et al.PNAS,DOI:10.1073/pnas.0408191101)。经过近20年发展,ACPPs已发展成为对细胞穿膜肽(Cell-penetratingpeptides,CPPs)进行靶向性改造的重要手段,具体来讲,ACPPs是通过物理化学手段对CPPs的正电荷进行有效屏蔽,实现其在正常生理条件下的完全或部分失活,在靶组织或细胞内则利用特异性的酶切、酸水解、光激活等技术手段,使CPPs重新恢复活性。然而,ACPPs通常不具有可逆性,无法实现CPPs在“非激活态”和“激活态”之间的自由切换。
针对上述问题,Wei-Chiang Shen和Chunmeng Sun课题组设计了一种可活化细胞穿膜肽(Reversibly activatable cell-penetrating peptides,RACPPs)。该系统由3部分组成:①由组氨酸-谷氨酸重复序列组成的一段HE掩蔽肽,②由5个甘氨酸构成的一段柔性肽,和③一段CPPs,包括但不限于R6、Model Amphipathic Peptide(MAP)和ArginineDeiminase(ADI);能够响应其所处环境pH变化而发生构象变化,从而实现“非激活态”和“激活态”之间的自由切换(Jennica L.Zaro,Journal of Controlled Release,DOI:10.1016/j.jconrel.2012.01.039;Tzyy-Harn Yeh,Molecular Pharmaceutics,DOI:10.1021/acs.molpharmaceut.5b00706;Baoqiang Tang,Journal of Controlled Release,DOI:10.1016/j.jconrel.2018.04.016;Yinglan Yu,Journal of Colloid and InterfaceScience,DOI:10.1016/j.jcis.2020.10.103)。
然而,上述研究仅在一定程度上实现对CPPs阳离子特性的掩蔽作用,因此,设计一种具有更高掩蔽效果的药物递送系统有利于进一步降低CPPs介导的非特异性摄取,提高安全性。
发明内容
针对上述现有设计的不足,本发明的目的是提供一种细胞穿膜肽修饰的药物载体。
为了实现上述发明目的,本发明采用以下技术手段:
一种细胞穿膜肽修饰的药物载体,所述药物载体为可活化细胞穿膜肽修饰的短链两亲性嵌段共聚物和长链两亲性嵌段共聚物自组装形成的聚合物胶束;
所述可活化细胞穿膜肽为HE-CPP,其氨基酸序列为C(HE)
具体可以包括但不限于:RRRRRR、KKKKKK、RKRKRK、KRKRKR、RRRRRRDR、RRRRRRER、RRRRRRGDK。
本发明的一个实施例中,采用RRRRRRGDK作为CPP;对比例中,采用RRRRRR作为CPP。
进一步地,所述短链两亲性嵌段共聚物的亲水链为短链PEG,其分子量可选自400~18000,优选400~10000。
进一步地,所述长链两亲性嵌段共聚物的亲水链为长链mPEG,其分子量可选自2000~20000,优选2000~12000。
进一步地,所述可活化细胞穿膜肽与短链两亲性嵌段共聚物的亲水链通过巯基与马来酰亚胺相连接得到,且短链PEG与HE-CPP的链长之和应短于长链mPEG的链长,从而实现良好的双重掩蔽作用,即HE对CPP的电荷掩蔽作用和长链mPEG对CPP的物理掩蔽作用。
进一步地,所述短链两亲性嵌段共聚物和长链两亲性嵌段共聚物的疏水链可选自PLA、PLGA、PBLG、DSPE或PCL中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中,采用的短链两亲性嵌段共聚物为PEG
进一步地,在所述聚合物胶束中包载有抗肿瘤药物。
上述药物载体的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,将可逆活化穿膜肽HE-CPP与短链两亲性嵌段共聚物的亲水链相连接,得到修饰的短链两亲性嵌段共聚物;
步骤2,将长链两亲性嵌段共聚物和可活化细胞穿膜肽修饰的短链两亲性嵌段共聚物经自组装,即可得到所述药物载体。
在本发明的一个实施例中,采用脂溶性抗肿瘤药物紫杉醇为模型药物,先将长链两亲性嵌段共聚物和可逆细胞穿膜肽修饰的短链两亲性嵌段共聚物溶于有机溶剂,然后加入模型药物紫杉醇,通过旋蒸去除有机试剂,再用PBS缓冲液(pH 7.4)水化后,经透析,得到包载脂溶性药物的聚合物胶束。优选地,所述有机溶剂为氯仿。
上述药物载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
有益效果:本发明采用可活化细胞穿膜肽修饰的短链两亲性嵌段共聚物CPP-HE-PEG
附图说明
图1为本发明中细胞穿膜肽的结构图。
图2为本发明中药物载体的示意图。
图3为实施例1中mPEG
图4为实施例1中HE-CPP的红外谱图。
图5为实施例1中Mal-PEG
图6为实施例1中CPP-HE-PEG
图7为对比例1中mPEG
图8为药物载体PTX/PM(5k)-HE-CPP、PTX/PM(2k)-HE-CPP、PTX/PM(2k)-CPP和PTX/PM(2k)的粒径结果。
图9为药物载体PTX/PM(5k)-HE-CPP的电镜图。
图10为药物载体PTX/PM(5k)-HE-CPP、PTX/PM(2k)-HE-CPP、PTX/PM(2k)-CPP和PTX/PM(2k)在pH 7.4和6.5条件下的Zeta电位结果。
图11为实施例2中在不同pH环境下MCF-7细胞对药物载体的摄取量结果。
图12为实施例3中在不同pH环境下4T1细胞对药物载体的摄取量结果。
图13为测试例3中不同pH环境下4T1细胞对药物载体的摄取量结果。
图14为测试例4中不同pH环境下4T1细胞对药物载体的胞内转运结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
在本发明的以下实施例中,采用的短链两亲性嵌段共聚物为PEG
实施例1
1、mPEG
通过核磁对产物结构进行检测,结果如图3所示。所得的mPEG
2、CPP-HE-PEG
3、聚合物胶束的制备:将CPP-HE-PEG
对比例1
本实施例与实施例1的区别在于:长链两亲性嵌段共聚物中mPEG-PLA中mPEG为mPEG
1、mPEG
2、采用与实施例1相同的方法制备CPP-HE-PEG
3、聚合物胶束的制备:
PM(2k)-HE-CPP使用的载体为mPEG
PM(2k)-CPP使用的载体为mPEG
PM(2k)使用的载体为mPEG
胶束的制备方法与实施例1中相同。
测试例1
考察不同pH值对实施例1和对比例1中各聚合物胶束粒径和多分散系数的影响。分别取PTX/PM(5k)-HE-CPP、PTX/PM(2k)-HE-CPP、PTX/PM(2k)-CPP和PTX/PM(2k)的溶液适量,通过氢氧化钠和盐酸溶液将溶液pH分别调至7.4和6.5,用Malvern激光粒度仪测定两种pH下实施例1和对比例1中各制剂中胶束的粒径和多分散系数(Polydispersity index,PDI)。如表1和图8所示,有HE电荷掩蔽序列的聚合物胶束在pH 6.5环境下粒径显著增大,无HE电荷掩蔽序列的聚合物胶束在pH 6.5和pH 7.4环境下的粒径没有显著性差异,且各制剂组中胶束的粒径随修饰的多肽序列的增长呈现增大的趋势,粒径分布较为均一。长链PEG包埋的制剂组PTX/PM(5k)-HE-CPP的粒径略大于对比例1中各对照组的粒径。
表1
用TEM透射电镜观察制剂组PTX/PM(5k)-HE-CPP形成的胶束的形貌,如图9所示。图A为pH 7.4环境下PTX/PM(5k)-HE-CPP胶束的形貌,图B为pH 6.5环境下PTX/PM(5k)-HE-CPP胶束的形貌。
测试例2
考察不同pH值对实施例1和对比例1中各聚合物胶束Zeta电位的影响。分别取PM(5k)-HE-CPP、PM(2k)-HE-CPP、PM(2k)-CPP和PM(2k)的缓冲盐溶液适量,通过氢氧化钠和盐酸溶液将溶液pH分别调至7.4和6.5,用Malvern Zeta Plus电位粒径分析仪测定Zeta电位。结果见图10,普通聚合物胶束PM(2k)在不同pH环境中表面均带负电荷;修饰有非电荷掩蔽多肽的聚合物胶束PM(2k)-CPP在不同pH环境中表面均带正电荷;修饰有可逆活化细胞穿膜肽的聚合物胶束PM(5k)-HE-CPP和PM(2k)-HE-CPP在生理环境下由于HE序列的电荷掩蔽作用使粒子表面带上负电荷,在肿瘤微酸性环境下,由于组氨酸的质子化,HE电荷掩蔽序列的负电荷减弱,干扰HE序列和CPP静电结合的稳定性,导致折叠结构展开,HE序列与CPP分离,使CPP恢复激活状态。
实施例2
以荧光物质香豆素6(C
实施例3
以荧光物质香豆素6(C
测试例3
以荧光物质香豆素6(C
测试例4
考察实施例1中PM(5k)-HE-CPP和对比例1中PM(2k)-HE-CPP、PM(2k)-CPP和PM(2k)在细胞内转运情况。取对数生长期的4T1细胞以2.5×10
机译: 具有胱抑素c活性的多肽,表达3-des-oh-胱抑素c的dna序列或其修饰,制备3- des-羟基cystatin c的修饰方法,质粒和微生物3-des-oh-胱抑素c或其修饰物的制备方法及其在制备治疗制剂中的应用
机译: 清除剂受体-A靶向药物载体及其制备方法和应用
机译: 用氟化合物改性阳离子聚合物的应用和制备方法作为药物载体