用于基于生物量来调控功能基因表达的试剂盒及使用其的方法

摘要

本发明提供用于基于生物量来调控功能基因表达的试剂盒，其包括用于插入细胞的基因组中的感应基因和用于转入所述细胞的响应基因表达元件，其中所述感应基因含有介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因与所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白(例如转录激活蛋白)的编码基因的组合，所述响应基因表达元件含有受所述感应基因调控的启动子及由所述启动子启动转录表达的功能基因以及使用其的方法。本发明的试剂盒及使用其的方法可有效的避免传统诱导表达系统中诱导剂造成的不利影响；同时可有效地平衡底物资源在菌株生长和功能基因强化之间的分配。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体而言，涉及利用群体感应系统的核心基因的组合，将介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因与所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白(例如转录激活蛋白)的编码基因插入到细胞基因组中，然后将包含对应启动子和功能基因的响应基因表达元件转入细胞中，从而获得功能基因受细胞自身生物量调控表达的试剂盒及其使用方法。

背景技术

基因表达控制着生物体的表型和功能的多样性。而通过基因工程和合成生物学等方法来人工调节控制基因表达是优化微生物、动物和作物的关键和前沿技术手段。控制转录是基础的和常用的方法。

在文献Current Opinion in Biotechnology 2017，47，120-132中提及在微生物的分子工具和基因/基因组重编程过程中，诱导表达系统是常用的方法和工具。但诱导剂本身的价格比较昂贵，且部分会对菌株自身生长代谢造成影响。

在文献Metabolic Engineering 2010，12，(3)，291-297中提及组成型启动子控制的表达系统可认为无需添加诱导剂诱导表达，但是其功能基因的表达在菌株开始生长时就启动，并不受控制，破坏底物资源在菌株生长和基因表达间的平衡，不利于资源最优化利用。

在文献Nature 2004，428，(6985)，868-71中提及细菌之间存在着广泛的交流，且通过其交流可以调控细菌的死亡来控制群落数量。在文献Nature Biotechnology 2017，35，(3)，273-279中提及利用群体感应系统(Quorum-Sensing system)可以实现工程菌株的代谢流的动态调控，优化底物资源的分配。并表明群体感应系统可被基因工程方法用来编辑调控功能基因的表达，并对菌株自身无害。但该技术中信号分子的合成是通过诱导剂β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)来控制的，这不能实现基于自身生物量来只能调控，且诱导剂价格昂贵，阻碍其实际应用。

发明内容

本发明提供基于生物量调控基因表达的方法，该方法整合群体感应系统的组合基因于细胞中，然后将包含对应所述组合基因的启动子和功能基因的响应基因表达元件转入其中，从而获得功能基因受细胞自身生物量调控表达。

本发明巧妙的利用群体感应系统，将感应基因(包含介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因与所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白(例如转录激活蛋白)的编码基因)插入细胞的基因组中，使自诱导物质的信号分子的浓度与细胞生物量相耦合；并利用该感应基因控制的启动子控制所需功能基因。利用这个方法，使细胞在低生物量时，主要将底物和能量资源用于生物量的积累，而当生物量达到信号分子阈值时，可启动功能基因的表达，从而实现强化表达。该方法使功能基因的表达受到细胞自身生物量的调控，可有效避免功能基因的强化和生物自身生长之间资源竞争的问题，实现底物资源在生长与基因表达间优化配置，避免了添加诱导剂引起的不利影响。

本发明的实施例中证明了将LuxI的编码基因luxI和转录激活蛋白LuxR的编码基因luxR的组合插入到费氏弧菌的基因组，将P

用于基于生物量来调控功能基因表达的试剂盒，其包括用于插入细胞的基因组中的感应基因和用于转入所述细胞的响应基因表达元件，其中

所述感应基因包括介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因和所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白(例如转录激活蛋白)的编码基因的组合，

所述响应基因表达元件含有受所述感应基因调控的启动子及由所述启动子启动转录表达的功能基因。

具体地，本发明提供以下技术方案。

1.用于基于生物量来调控功能基因表达的试剂盒，其包括用于插入细胞的基因组中的感应基因和用于转入所述细胞的响应基因表达元件，其中

所述感应基因包括介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因和所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白(例如转录激活蛋白)的编码基因的组合；

所述响应基因表达元件含有受所述感应基因调控的启动子及由所述启动子启动转录表达的功能基因。

2.项1所述的试剂盒，其中所述感应基因包括LuxI的编码基因luxI和转录激活蛋白LuxR的编码基因luxR的组合，和/或LuxS的编码基因luxS和LuxP的编码基因luxP的组合，和/或

其中所述感应基因通过一个或更多个感应基因表达盒插入到所述细胞的基因组中，和/或

其中受所述感应基因调控的启动子是P

LuxI在费氏弧菌(Vibrio Fischeri)中介导自诱导物质的信号分子AHL合成，LuxR是AHL的受体结合蛋白，LuxS在哈式弧菌(Vibrio harveyi)中介导自诱导物质的信号分子AI-2合成，LuxP是AI-2的受体结合蛋白。

所述感应基因还可以包括：来自斯式泛菌(Pantoea stewartii)的Esa系统的ESAI的编码基因esaI和转录调节因子EsaRI70V的编码基因esaRI70V的组合，其中ESAI介导自诱导物质的信号分子AHL合成，EsaRI70V是AHL的受体结合蛋白；和/或来自铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)的Las系统的LasI的编码基因lasI和转录调节因子LasR的编码基因lasR的组合，其中LasI介导自诱导物质的信号分子AHL合成，LasR是AHL的受体结合蛋白。

启动子P

3.如项1或2所述的试剂盒，其中控制所述感应基因表达盒的启动子是所述感应基因表达盒中包含的编码基因的自身原始启动子或外源组成型启动子，所述外源组成型启动子例如是P

4.如项1-3中任一项所述的试剂盒，其中所述功能基因包括同源基因或外源基因，或其组合的基因，进一步地例如还包括具有菌株自养代谢、异养代谢的功能或其组合的基因，具有菌株自养代谢的功能的基因例如NADH和FADH

5.如项1-3中任一项所述的试剂盒，其中所述功能基因包括具有次级代谢产物的合成生产、有机染料的脱色和/或生态环境中重金属的还原修复的功能的基因，例如有机染料甲基橙的脱色或六价铬的还原的基因。

6.如前述任一项所述的试剂盒，其中所述响应基因表达元件是线性的核酸片段、病毒载体、质粒，或者其组合，例如是PYYDT质粒。

7.如项1所述的试剂盒，其中所述将所述感应基因表达盒插入其基因组中是通过基因编辑的方法完成的，例如所述基因编辑的方法选自单碱基编辑(PBE)方法、CRISPR-Cas9方法、CRISPR-Cpf1方法、CRISPRi方法、锌指核酸酶方法、TALEN方法和同源重组方法中的一种或更多种，优选地，同源重组方法。

8.如项1所述的试剂盒，其中所述将所述响应基因表达元件转入所述细胞中是通过接合转移、化学转化法或电击转化法，例如接合转移，完成的。

如本文所用，接合转移是细菌之间通过直接或间接接触，交换质粒的过程。

9.细胞，所述细胞包含项1-8中任一项限定的感应基因和响应基因表达元件，其中所述感应基因插入在所述细胞的基因组中，所述响应基因表达元件转入在所述细胞中，其中所述基因组例如包括存在于细胞核中的染色体DNA，或存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体)中的细胞器DNA。

10.如项9所述的细胞，其中所述细胞包括原核生物的细胞或真核生物的细胞，其中原核生物包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或古生菌；真核生物包括真菌、动物细胞或植物细胞。

11.用于基于生物量来调控功能基因表达的方法，其使用项1-8中任意一项所述的试剂盒或项9或10所述的细胞进行。

12.如项11所述的方法，所述基于生物量的调控是指将含有介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因与所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白(例如转录激活蛋白)的编码基因的感应基因插入到细胞的基因组中，利用受所述感应基因调控的启动子及其启动转录表达的功能基因构成的响应基因表达元件，将所述响应基因表达元件转入含有感应基因的细胞中，使得所述功能基因的表达受细胞自身生物量的调控。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子生物学、细胞和组织培养、微生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。

如本文所用的，“群体感应”是指微生物群体在其生长过程中，由于群体密度的增加，导致其生理和生化特性的变化，显示出少量菌体或单个菌体所不具备的特征。这个变化的原因在于：当环境中微生物种群密度达到阈值，自诱导物质的信号分子的浓度也达到一定的水平，通过包括受体蛋白在内相关蛋白的信号传递，诱导或抑制信号最终传递到胞内，影响特定基因的表达，调控微生物群体的生理特征，如生物发光、抗生素合成、生物膜形成等。

如本文所用的，“群体感应系统”包括群体感应功能的感应系统的基因和功能基因表达功能的响应系统的基因。

如本文所用的，“基于生物量的调控”是指利用群体感应系统的核心基因，将包括介导自诱导物质的信号分子合成的蛋白的编码基因与所述自诱导物质的信号分子结合的转录调节蛋白(例如转录激活蛋白)的编码基因的感应基因表达盒插入到细胞的基因组；然后利用受上述感应基因表达盒调控的启动子及其启动转录表达的功能基因构成响应表达元件，将响应表达元件转入含有感应基因表达盒的细胞中，使得功能基因的表达受细胞自身生物量的调控。

如本文所用的，“自诱导物质的信号分子”是指可诱导自身或相关分子激活的生物分子。有时特指革兰氏阴性菌产生的一种能自由扩散的小信号分子(即信息素)。在细菌对环境、生理和代谢条件产生响应时起重要作用。如细菌依据信息素的细胞外浓度而调节其群体的密度。

所述生物量耦合是通过将上述群体感应系统通过基因编辑的方法插入到细胞中实现的。

本发明的功能基因包括同源基因或外源基因，或其组合。其“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。在一个具体实施方式中为来自于外来物种的绿色荧光蛋白基因(GFP)。

附图说明

图1：大肠杆菌QS01体系中GFP随细菌培养时间的表达。其中图1(A)为大肠杆菌QS01体系及对照菌株随细菌培养时间的细菌含量的OD600值，图1(B)为大肠杆菌QS01体系及对照菌株随细菌培养时间发出的荧光值。

图2：大肠杆菌QS02体系中GFP随细菌培养时间的表达。其中图2(A)为大肠杆菌QS02体系及对照菌株随细菌培养时间的细菌含量的光密度600值，图2(B)为大肠杆菌QS02体系及对照菌株随细菌培养时间发出的荧光值。

图3：希瓦氏菌工程菌中GFP随细菌培养时间的表达。其中图3(A)为希瓦氏菌QS01，QS02体系及对照菌株随细菌培养时间的细菌含量的光密度600值，图3(B)为希瓦氏菌QS01，QS02体系及对照菌株随细菌培养时间发出的荧光值。

图4：希瓦氏菌QS01，QS02随细菌培养时间的GFP检测的流式细胞图。

图5：希瓦氏菌胞外电子传递速率的测定。其中图(A)显示通过WO3纳米棒探针法测定胞外电子传递速率，图片为96孔板上显色反应后的扫描图片，从左到右的孔依次为：非生物对照，WT/PYYDT，WT-QS04/PYYDT-Mtr，WT-QS04/PYYDT-CymA，WT-QS04/PYYDT-Flavin，WT-QS04/PYYDT-UshA，一列中从上而下的4个孔为平行实验；图(B)显示利用IPP软件计算出图(A)的扫描图片的平均密度的柱状图；图(C)显示通过微生物电解池(MEC)直接测定细菌向电极传递电子的速率。

图6：MO的降解曲线。其中(A)为不同工程菌株随时间的MO的降解曲线；(B)为MO降解曲线的动力学拟合图。

图7：不同菌株胞外电子传递能力及有机染料MO降解测定结果。其中图(A)显示通过WO3纳米棒探针法测定胞外电子传递速率，图片为96孔板上显色反应后的扫描图片，从左到右的孔依次为：非生物对照、野生型对照WT/PYYDT、WT-QS04/PCN-AS和WT-QS04/PL-AS，一列中从上而下的4个孔为平行实验。图(B)显示利用IPP软件计算出图A扫描图片的平均密度的柱状图；图(C)显示通过微生物电解池(MEC)直接测定细菌向电极传递电子的速率；图(D)显示不同工程菌株的MO的降解曲线；图E显示MO降解曲线的动力学拟合图。

图8：Cr(VI)的还原曲线及一级动力学常数。其中图(A)为Cr(VI)的还原曲线，图(B)为Cr(VI)的一级动力学常数。

图9：Cr(VI)的还原产物的理化表征。图(A)显示WT-QS04/PL-AS工程菌株反应后的SEM图片，菌株表面有细小颗粒；图(B)显示WT-QS04/PL-AS工程菌株反应后的TEM图片，清晰看到菌株表面黏附有颗粒沉淀(用箭头指示)；图(C)显示WT-QS04/PL-AS工程菌株反应后的SEM-EDS图谱，表明沉淀物是含Cr元素的化合物；图(D)显示沉淀物的XPS图谱，表明Cr主要是以三价形式存在。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明实施例中所有基因均购自ANDGENE公司。

实施例1

从费氏弧菌(菌株保藏号NCIMB1278)的基因组中克隆luxI和luxR编码基因(SEQID NO：1(NCBI序号AAP22376.1)，SEQ ID NO：2(NCBI序号AY292984.1)，两者均包含各自的启动子和终止子)，将两者通过同源重组的方法插入大肠杆菌(ATCC 10798标准菌株)的基因组中，构建具有含有luxI和luxR编码基因的感应系统的大肠杆菌；同时在质粒P

实施例2

按照实施例1的方法构建含感应系统的大肠杆菌和响应系统，不同之不同之处仅在于，在构建感应系统的时候，将luxI的启动子替换为组成型启动子PL(SEQ ID NO：4)，并同样地，将通过化学转化法转入至上述含感应系统的大肠杆菌中，从而获得GFP表达受大肠杆菌生物量调控的体系，将该体系命名为QS02。细菌增殖和表达情况如图2所示。由图2(A)可知，QS01，QS02的生长曲线与对照菌株几乎一致；由图2(B)可知在QS02中GFP随着生物量的积累而逐渐表达，在不含感应系统的对照菌株中没有检测到GFP的表达。

结合图1和图2，可知在QS01，QS02中GFP随着生物量的积累而逐渐表达，并且不同感应系统会在不同的生物量时诱导起始表达如QS01体系在生物量达到OD

实施例3

从费氏弧菌的基因组中克隆luxI和luxR编码基因(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，将两者通过同源重组的方法插入希瓦氏菌株(shewanellaoneidensis MR-1)(统一编号ATCC-700550)的基因组中；或在上述步骤的基础上将luxI的启动子替换为组成型启动子PL(SEQID NO：4)，从而构建具有含有luxI和luxR编码基因的感应系统的希瓦氏菌；同时在质粒P

实施例4

按照实施例3中制备QS02的方法构建本实施例的含有感应系统和响应系统的希瓦氏工程菌，区别仅在于将GFP基因替换为与希瓦氏胞外电子传递途径相关的核黄素合成基因簇RibBADEC(SEQ ID NO：5)，或MtrCAB-OmcA基因簇(SEQ ID NO：6)，或CymA(SEQ ID NO：7)，或FAD水解基因UshA(SEQ ID NO：8)。最后获得的对应工程菌株分别命名为WT-QS04/PYYDT-Flavin，WT-QS04/PYYDT-Mtr，WT-QS04/PYYDT-UshA，WT-QS04/PYYDT-CymA，用不含感应系统仅含空白质粒P

图5所示的结果均能表明胞外电子传递速率受希瓦氏菌生物量调控而增强，所以本实施例构建的各种体系在无需添加诱导剂的情况下实现了功能基因的强化作用。

实施例5

将实施例4中得到的工程菌株，进一步用来进行有机染料甲基橙(MO)的脱色降解实验，条件为温度30℃，起始MO浓度50mg/L，起始菌液光密度

图6所示的结果均表明本实施例的体系能通过生物量积累调控胞外电子传递速率，从而能有效的应用于有机染料脱色处理。拟合曲线的结果显示：WT/PYYDT，WT-QS04/PYYDT-Flavin，WT-QS04/PYYDT-Mtr，WT-QS04/PYYDT-UshA，WT-QS04/PYYDT-CymA对甲基橙的还原去除速率分别为0.114h

实施例6

按照实施例3中制备QS02的方法构建本实施例的含有感应系统和响应系统的希瓦氏工程菌，区别仅在于将GFP基因替换为核黄素合成基因簇RibBADEC(SEQ ID NO：5)，MtrCAB-OmcA基因簇(SEQ ID NO：6)和基因CymA(SEQ ID NO：7)。最后获得的工程菌株命名为WT-QS04/PL-AS，用不含感应系统，不含感应系统仅含空白质粒PYYDT的野生型菌株作为对照(WT/PYYDT)，另外制备WT-QS04/PL-AS的过程中，在响应系统中将群体感应启动子P

WO3纳米探针的显色实验的结果表明，工程菌株WT-QS04/PL-AS的颜色密度较对照组明显增加，这表明胞外电子的传递能力得到了增加，且比传统组成型的WT-QS04/PCN-AS更高(图7(A)和(B))。

微生物电解池(MEC)的结果可见，WT-QS04/PL-AS，WT/PYYDT，WT-QS04/PCN-AS最大电流的输出分别为783毫安/平方米、261毫安/平方米、676毫安/平方米，即，表明工程菌株WT-QS04/PL-AS的峰电流密度较野生型对照组(WT/PYYDT)提高4.8倍，而传统组成型的WT-QS04/PCN-AS只有本实施例WT-QS04/PL-AS的工程菌株的79％(图7(C))。

甲基橙(MO)的还原去除实验进一步表明，利用本发明WT-QS04/PL-AS体系构建的工程菌株WT-QS04/PL-AS的还原速率(为2.065h

图7所示的结果均表明胞外电子传递速率受希瓦氏菌生物量调控而增强，本实施例的体系WT-QS04/PL-AS可以有效的通过菌株自身生物量的积累实现细菌电子跨膜途径的整体强化，从而进一步提高MO的降解速率。

实施例7

将实施例6中的菌株(WT-QS04/PL-AS，WT/PYYDT，WT-QS04/PCN-AS)，进一步用来进行重金属Cr(VI)的还原降解，条件为温度30℃，起始重铬酸钾浓度20mg/L(以Cr计)，起始菌液光密度OD

图8的结果表明本实施例的WT-QS04/PL-AS体系也能有效地提高Cr(VI)的还原速率，且效果比野生型的提高5.5倍，比组成型的提高近一倍。

结果表明，Cr(VI)的还原产物确为Cr(III)，即其是通过得到电子被还原去除的，这进一步表明本实施例的体系能有效地提高胞外电子传递速率，增加还原电势，从而提高将Cr(VI)还原为Cr(III)的速率，而Cr(III)主要以沉淀物的形式存在，从而实现水体重金属污染的去除。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。