用于非洲猪瘟病毒基因鉴别检验的实时荧光PCR扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒

摘要

本发明涉及非洲猪瘟病毒基因型鉴别检验的实时荧光PCR扩增引物组，其包括非洲猪瘟病毒基因I型实时荧光PCR扩增引物对和探针，以及非洲猪瘟病毒基因II型实时荧光PCR扩增引物对和探针。本发明还包括包含该非洲猪瘟病毒基因型实时荧光PCR扩增引物组的试剂盒。本发明的试剂盒能同时鉴别检验非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因Ⅱ型，特异性强、灵敏度高，且对不同地域来源的野毒株均能有效检测。

说明书

技术领域

本发明属于病毒的检测领域，具体涉及用于鉴别检验非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型、II型的实时荧光PCR扩增引物对、探针引物，以及包含该实时荧光PCR扩增引物对、探针引物的试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，其基因组长约170kb～193kb。ASF具有高发病率、高死亡率等特点，一旦发生，经济损失巨大；目前缺乏有效疫苗和特异性治疗手段，使ASF成为目前危害养猪业的最严重疫病之一。目前对ASF的控制只能依赖实验室的快速诊断、对发病动物的捕杀，以及采取有效的检疫措施和严格的卫生措施。

ASFV抗原分型并不是非常典型，迄今只有一种血清型，但根据基因组特征，可以将其分为22个不同的基因型，其中，基因Ⅰ型和基因II 型在世界上流行范围较广。目前，ASF在我国首次爆发，国内多个地区流行，疫情持续扩大。ASFV在我国缺乏有效疫苗和快速病原鉴别检测技术，是疫病精确监测和控制存在的重要问题。因此，利用新型病原学检测技术，建立快速鉴别检测方法用于ASF病原快速鉴定是有效、精准防控疫情的技术关键。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗鉴别检验的实时荧光PCR扩增引物、探针、试剂盒。

本发明的一个方面在于提供一种非洲猪瘟病毒基因型鉴别检验的实时荧光PCR扩增引物组，其中，所述非洲猪瘟病毒基因型实时荧光 PCR扩增引物组包括非洲猪瘟病毒基因I型实时荧光PCR扩增引物对和探针，以及非洲猪瘟病毒基因II型实时荧光PCR扩增引物对和探针；所述非洲猪瘟病毒基因I型实时荧光PCR扩增引物对的上游引物如 SEQ.ID.No.1所示，所述非洲猪瘟病毒基因I型下游引物如SEQ.ID.No.2 所示，所述非洲猪瘟病毒基因I型探针如SEQ.ID.No.3所示；以及所述非洲猪瘟病毒基因II型实时荧光PCR扩增引物对的上游引物如 SEQ.ID.No.4所示，所述非洲猪瘟病毒基因II型下游引物如SEQ.ID.No.2 所示，所述非洲猪瘟病毒基因II型探针如SEQ.ID.No.5所示。本发明的所述非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增引物对和探针能特异性检测非洲猪瘟病毒，灵敏度高。

本发明首次公开了用于鉴别检验非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因II型的PCR引物对、探针，能同时鉴别检验非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因II 型，特异性强、灵敏度高，且对不同地域来源的野毒株均能有效检测。

本发明还提供一种一种非洲猪瘟病毒基因型鉴别检验的实时荧光 PCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括所述的非洲猪瘟病毒基因型实时荧光PCR扩增引物组。

本发明的针对非洲猪瘟病毒基因分型的鉴别检验的试剂盒，能有效区分基因Ⅰ型和基因II型，提供了疫病精确监测和精准防控疫情的关键技术。由于本发明实时荧光PCR扩增引物对和探针具有特异性强、敏感性高的特点，包含本发明引物对的试剂盒灵敏、便捷、特异性强、敏感性高、可靠性好，只需一次检测便能判定样本是否含有非洲猪瘟病毒，以及是含有基因Ⅰ型或基因II型，可以同时进行大批量的样本分析，为非洲猪瘟疫情的监测、防控提供有力的技术支持，有很好的应用前景。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述非洲猪瘟病毒基因I型探针引物、非洲猪瘟病毒基因II型探针引物标记的荧光素分别选自：FAM(羧基荧光素)、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5，所述非洲猪瘟病毒基因I型探针引物、非洲猪瘟病毒基因II型探针引物标记的荧光素都不相同。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括：TaqDNA聚合酶，5×反应缓冲液，dNTPs，ddH

本发明因充分运用了PCR技术的高效扩增性、核苷酸杂交技术的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对同一个样本进行一次检测操作即可完成非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因II型的鉴别检测，可以确定样本是基因Ⅰ型感染或是基因II型感染。具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、降低检测成本、提高检测效率的优点。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括酶混合液和 PCR反应液，所述酶混合液由Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油和Tween-20组成，Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油和Tween-20含量分别为0.5U/μl、25mM、0.05mM、0.05mM、40％V/V、0.2％V/V；所述PCR反应液由所述非洲猪瘟病毒基因I型扩增引物对和探针引物、所述非洲猪瘟病毒基因II型扩增引物对和探针引物、反应缓冲液、dNTPs和ddH

本发明通过建立多组分微量组合工艺技术，将试剂盒原有多种化学试剂成分组配成2类：合并酶反应试剂，优化各组分比例；合并PCR 反应液，优化各组分比例；本工艺技术意外发现酶活性增强，提高了试剂盒灵敏度。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述阳性对照为含有非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型B602L基因片段的重组质粒、以及含有非洲猪瘟病毒基因II型B602L基因片段的重组质粒，所述阴性对照为蒸馏水。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括非洲猪瘟病毒DNA提取试剂。

非洲猪瘟病毒DNA提取试剂可以是本领域公知的DNA病毒基因组提取试剂。

本发明试剂盒不仅特异性强、敏感性高，且能针对多种样本进行检测，不仅能应用于血清样本，还能应用于肝脏、淋巴结、流产胎儿、脾脏、肺、肾脏多种组织。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒使用的PCR反应体系为 50μl，由酶混合液5μl、PCR反应液40μl和待测DNA模板5μl组成。

本发明还提供一种非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增反应程序： 95℃30sec；40个循环，每个循环为95℃5sec，60℃30sec；每个循环的第二步(60℃60sec)收集荧光信号。本发明还涉及一种利用上述引物对和探针同时检测非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因II型的多重实时荧光 PCR方法，包括：

针对非洲猪瘟病毒基因分型涉及的能鉴别基因Ⅰ型和基因II型的特异性引物和探针序列；用荧光素标记的鉴别基因Ⅰ型的探针，通过不同检测通道检测的另一种荧光素标记的鉴别基因II型的探针；其中的探针用任意一种荧光素标记，且两种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、 ROX或CY5；将用于检测非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因II型的引物和探针序列，或用于鉴别非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因II型的引物和探针序列，置于同一反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。

多重实验即在一个反应管中通过扩增多个靶标进行定量实验，在一个反应管中，任何一个靶标的扩增都能影响其他靶标的扩增，所以要进行周密的实验设计和反应条件的优化，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。多重荧光PCR实验普遍存在的问题是扩增样本中浓度明显差异的所有靶标，在同一反应管中扩增时，如果出现一种基因扩增效率高于另一种基因时，其中一种基因的扩增可能受到抑制，最终导致样本中两种基因的扩增效率不一致。本发明通过引物和探针的设计，反应条件的优化，使样本中两种基因的扩增效率一致，与每个单重反应的灵敏度是一致的。

本发明还涉及试剂盒在同时检测非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因II型的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，且不同探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自FAM(羧基荧光素)、VIC、 HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

荧光素介绍：

FAM：羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，广泛存在于荧光标记试剂盒，也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em＝492/518nm(pH＝9.0)，具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。

VIC：绿色荧光蛋白，Greenfluorescent protein，GFP，是源于海洋生物多管水母属(Aequoria Victoria)的一种发光蛋白。

HEX：六氯荧光素，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em＝535/556nm。

JOE：羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素， Carboxy-4′,5′-dichloro-2′，JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。

TAMRA：全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的。

ROX：5-和6-羧基-X-罗丹明，校正染料。

Cy3或Cy5，Modification，是新的荧光分子，具有较好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率。它们的激发光谱和发射光谱峰值分别为 548/562nm与646/664nm。Cy3和Cy5的分子结构和分子量都非常相似，但两者之间的光谱却分得很开，因此，Cy3和Cy5常被用于很多双色实验中，如被广泛应用于基因芯片和蛋白质芯片领域。

NED：2’-氯-5’-氟-7’，8’-苯-1,4-二氯-6-羧基荧光素。

以上荧光素检测时所对应的检测通道是本发明在实验过程中所用 FTC-3000仪器所对应的检测通道，本领域技术人员在重复本发明的过程中，所用仪器不同有可能荧光素所对应的通道不同，同时两种或多种荧光素在使用第一种仪器时所对应的检测通道是不同的，在使用第二种仪器时所对应的检测通道有可能是相同的。本发明的宗旨是，无论使用哪种仪器来重复本发明，只要在使用同一种仪器时，用于标记非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和基因II型的探针的荧光素在不同的检测通道就可以实现本发明。

实时荧光PCR检测是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1非洲猪瘟病毒实时荧光的引物与探针

本发明使用的两对引物，两条探针见序列表1。

表1用于非洲猪瘟病毒实时荧光的引物和探针

非洲猪瘟病毒PCR方法的反应体系见表2，反应条件见表3。

表2非洲猪瘟病毒多重实时荧光PCR方法的反应体系

表3非洲猪瘟病毒多重实时荧光PCR方法的反应条件

实施例2非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的优化

1、非洲猪瘟病毒实时荧光PCR方法的反应体系

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR方法的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。

商品化5U/μl Taq酶在50μl反应体系中一般添加2μl，终浓度为 0.2U/μl，本实施例在进一步降低Taq酶终浓度的条件下，通过建立多组分微量组合工艺技术，将试剂盒原有多种化学试剂成分组配成2类，制备特定的酶混合液和PCR反应液，来实现试剂盒检测条件的进一步优化，大大提高了敏感性和特异性。经过优化，非洲猪瘟病毒实时荧光 PCR方法的反应体系见表4。酶混合液在50μl反应体系中一般添加5μl，终浓度为0.05U/μl。

表4优化后的非洲猪瘟病毒实时荧光PCR反应体系

2、结果判定

(1)结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。

(2)质控标准

阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；

阳性对照的Ct值应≤30，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。

(3)结果描述及判定

阴性样品无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示阴性样本中无非洲猪瘟病毒。

阳性样本Ct值≤30，且出现特异性扩增曲线，表示阳性样本中有非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型、基因II型。

有效原则：样本Ct值在30＜Ct＜37之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct＜37时样品为阳性，否则为阴性。

(4)样品检测试验及结果

试验对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV) 进行扩增，结果只有非洲猪瘟病毒得到特异性的荧光扩增曲线。

实施例3PCR检测试剂盒敏感性和特异性比较试验

以实施例1所示非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型、基因II型实时荧光PCR扩增引物对、探针组合，按照实施例1条件优化前组分组装非洲猪瘟病毒双重实时荧光PCR试剂盒1，实施例2条件优化后组分组装非洲猪瘟病毒双重实时荧光PCR试剂盒2。比较两个试剂盒的敏感性和特异性。

将非洲猪瘟病毒DNA模板连续10倍稀释后，试剂盒1和试剂盒2 分别按照优化前、优化后条件进行PCR敏感性试验。

结果显示，试剂盒1敏感度最低可达12拷贝，试剂盒2敏感性最低可达5拷贝。表明，本发明筛选的引物具有很高的敏感性，条件优化后进一步提高了试剂盒的敏感性。

使用试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件对猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪副流感病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒及非洲猪瘟病毒阴性猪肺脏、淋巴结、扁桃体进行特异性试验，结果显示，非洲猪瘟病毒检测结果为阴性。实验结果证实，本发明的试剂盒具有相当高的特异性。

实施例4疑似非洲猪瘟病毒感染猪样品的检测

取采自不同地区临床发病猪场的疑似病猪的组织样品，包括猪肝脏 8份、肺脏10份、肾脏6份、淋巴结10份、脾脏6份、流产胎儿7份，使用试剂盒1和试剂盒2分别按照优化前、优化后条件进行非洲猪瘟病毒野毒检测。检测结果见表5。

表5临床疑似非洲猪瘟病毒感染猪样品的检测

结果表明，在47份病料中，试剂盒1检出4份非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型阳性病料，检出率为8.5％；试剂盒2同样能检出试剂盒1所检出的非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型阳性病料，二者符合率达100％；试剂盒2检出6 份非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型阳性病料，检出率为12.8％，比试剂盒1的检出率高4.3％；试剂盒1检出20份非洲猪瘟病毒基因II型阳性病料，检出率为42.6％；试剂盒2同样能检出试剂盒1所检出的非洲猪瘟病毒基因 II型阳性病料，二者符合率达100％；试剂盒2检出29份非洲猪瘟病毒基因II型阳性病料，检出率为61.7％，比试剂盒1的检出率高19.1％；试剂盒2检出阳性而试剂盒1未检出的病料病毒含量均较少，DNA模板量为6～10拷贝；试剂盒1和试剂盒2检出的非洲猪瘟阳性病料均为野毒感染。条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1，能检测出病毒含量较低的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。

实施例5试剂盒的临床应用

抽样采取不同地区未发生临床症状猪场的血清样品41份，使用试剂盒1按照优化前条件进行非洲猪瘟野毒检测，同时，使用试剂盒2按照优化后条件进行非洲猪瘟野毒检测复核。检测结果见表6。

表6试剂盒临床应用非洲猪瘟检测结果

结果表明，在41份血清中，试剂盒1检出3份非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型阳性病料，检出率为7.3％；试剂盒2同样能检出试剂盒1所检出的非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型阳性病料，二者符合率达100％；试剂盒2检出5 份非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型阳性病料，检出率为12.2％，比试剂盒1的检出率高4.9％；试剂盒1检出11份非洲猪瘟病毒基因II型阳性病料，检出率为26.8％；试剂盒2同样能检出试剂盒1所检出的非洲猪瘟病毒基因 II型阳性病料，二者符合率达100％；试剂盒2检出19份非洲猪瘟病毒基因II型阳性病料，检出率为46.3％，比试剂盒1的检出率高19.5％。条件优化后的试剂盒2检测敏感性明显高于试剂盒1，能检测出病毒含量较低的样品，而同样对于阴性样品均不能检测出。且本发明试剂盒对不同地域来源的疑似感染样本均能准确检测。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳普泰生物技术有限公司

<120> 用于非洲猪瘟病毒基因鉴别检验的实时荧光PCR扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒

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