一种产碱假单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种产碱假单胞菌菌株，命名为产碱假单胞菌Pas7，保藏日期为2020年11月9日，保藏编号：CGMCC NO.21151；本发明的产碱假单胞菌Pas7，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治番茄根腐病的生防菌剂，经过试验证明，本发明提供的生防菌剂在室温条件下对番茄根腐病的防效可以达到89.87％，田间对番茄根腐病的防效可达到85.93％；本发明提供的生防菌剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以不用或减少其他相应化学农药的用量，不仅节省农民开支，而且有利于蔬菜的出口。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种防治番茄枯萎病的水丛毛单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

番茄是世界范围内广泛种植的经济作物之一，以其品种多、适应范围广、产量高、营养丰富、食用品质好、用途广泛，而受到栽培者和消费者青睐，是广泛分布于世界不同地区的重要蔬菜作物。番茄含有丰富的维生素、碳水化合物、矿物质、有机酸及少量的蛋白质，不仅可以作为果蔬食用，还可以作为重要的加工原料，在消费领域中有广泛的用途。但是番茄的各种病害一直是番茄产量和经济效益的一个主要限制因素，番茄病害的新型防治策略的开发已成为番茄现代生产中的重要课题。

番茄根腐病，俗称“烂脖根死棵病”，是由鞭毛菌亚门卵菌纲霜霉目疫霉属真菌侵染所致，病原菌为番茄疫霉(Phytophthora capsici)和寄生疫霉(Phytophthoraparacitica)。番茄根腐病是世界许多国家保护地和露地番茄生产的重要病害之一，严重影响番茄的产量和品质。近年来，番茄疫霉根腐病已成为冬春大棚番茄的主要病害之一，可在番茄全生育期造成危害，发病严重时甚至导致绝收，严重制约着番茄生产的发展，必须找到一种行之有效的方法来预防和控制该病害的流行，减少损失。

当前生产中主要采用化学农药来防治番茄疫霉根腐病；这种方法虽见效快，但农药的大量使用、滥用，导致环境污染、生态破坏、食品污染及人畜中毒等事件频发，并引发严重的“3R”(Residue、Resisitance和Resurgence)问题。生物农药防治植物病害效果好、对人畜无毒、不污染环境、无残留、能保持农产品的优良品质、对害虫天敌和有益生物安全，有助于保持生态平衡，是解决番茄根腐病经济而有效的途径。

开发新的、更为高效和安全的微生物菌剂控制番茄根腐病的发生是实现农业安全可持续发展的需要，符合社会发展要求。

发明内容

本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足，提供一种可以防治番茄根腐病的细菌菌株，还提供了一种包含上述细菌菌株的生防菌剂，可以很好地应用于番茄根腐病的防治工作中。

为实现本发明的上述目的，采用了以下技术方案：

一种产碱假单胞菌菌株，命名为产碱假单胞菌Pas7，保藏日期为2020年11月9日，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号：CGMCC NO.21151。

本发明的产碱假单胞菌菌株为2019年在江苏宿迁市宿城区南蔡乡某农场病田土壤中分离得到；

分离方法：采用5点取样法将取田间土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室；将土样5g加入100mL无菌水中，于摇床150r/min振荡培养1h后取出静置5min，取5mL上清液加入到100mL TMSM液体培养基中，150r/min，30℃摇床培养24h以活化土壤中细菌；吸取1mL培养液以10倍梯度稀释，分别取梯度稀释液0.1mL均匀涂布于TMSM平板上，30℃培养箱中培养分离。根据平板上菌落大小及形态进行分离纯化。细菌种群密度以CFU/g表示，将纯化好的细菌进行编号，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。

按照平板拮抗活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以及产嗜铁素活性，采用赋值法，选择出综合得分较高的菌株，通过温室试验最终筛选出防治效最好的产碱假单胞菌Pas7。

生物学特性：革兰氏阴性菌，杆菌，直径0.5×2

含有所述产碱假单胞菌Pas7的生防菌剂也属于本申请要求保护的范围，制备方法为是将产碱假单胞菌Pas7经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到。

具体的制备方法优选包括以下步骤：将产碱假单胞菌Pas7在TMSM培养液中，25～30℃、150～200rpm振荡培养12～24h，获得种子液；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养液，于25～30℃、150～200rpm振荡培养，获得活菌总浓度为1×10

本发明还提供了一种上述产碱假单胞菌菌株或生防菌剂在防治番茄根腐病中的应用。

具体方法为：在使用前，将制得的生防菌剂稀释5-100倍，在番茄种植时浸种处理或/和在移栽时进行灌根处理。

本发明的有益效果如下：

(1)生防菌剂中含有抑制番茄根腐病病原菌生长的专一性菌株-产碱假单胞菌Pas7，其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本发明提供的生防菌剂在室温条件下对番茄根腐病的防效可以达到89.87％，田间对番茄根腐病的防效可达到88.13％，增产效果达到23.5％；

(2)本发明的产碱假单胞菌Pas7，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治番茄根腐病的生防菌剂；

(3)本发明提供的生防菌剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以不用或减少其他相应化学农药的用量，不仅节省农民开支，而且有利于蔬菜的出口；

(4)经过试验证明，本发明提供的生防菌剂，具有抗病、增产作用，进而大幅度促进农民增收。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例1：产碱假单胞菌Pas7的分离纯化与鉴定

本发明所涉及的防治番茄根腐病的产碱假单胞菌Pas7，为2019年在江苏宿迁市宿城区南蔡乡某农场病田土壤中分离得到；

分离方法：采用5点取样法将取田间土壤后分别装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室；将土样5g加入100mL无菌水中，于摇床150r/min振荡培养1h后取出静置5min，取5mL上清液加入到100mL TMSM液体培养基中，150r/min，30℃摇床培养24h以活化土壤中细菌；吸取1mL培养液以10倍梯度稀释，分别取梯度稀释液0.1mL均匀涂布于TMSM平板上，30℃培养箱中培养分离。根据平板上菌落大小及形态进行分离纯化。细菌种群密度以CFU/g表示，将纯化好的细菌进行编号，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。

按照平板拮抗活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以及产嗜铁素活性，采用赋值法，选择出综合得分较高的菌株，通过温室试验最终筛选出防治效最好的产碱假单胞菌Pas7。

生物学特性：革兰氏阴性菌，杆菌，直径0.5×2

参照《细菌鉴定手册》，根据生物学特性鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)，于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC NO.21151。

实施例2：生防菌剂的制备

用分离得到的产碱假单胞菌Pas7制备生防菌剂，具体包括以下步骤：将产碱假单胞菌Pas7在TMSM培养液中，28℃、180rpm振荡培养20h，获得种子液，种子液中活菌总浓度约为10

TMSM培养液：在1000mL MSM中加入1g L-酪氨酸，调节pH至7.0，并于1×10

发酵培养液：蔗糖2g/L、玉米粉15g/L、黄豆粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、酵母膏0.4g/L、氯化钙1g/L、氯化铁0.005g/L、调节pH值为6。

实施例3：平板对峙试验检测生防菌剂对番茄疫霉的防效

将实施例2制得的生防菌剂稀释5倍得到活菌总浓度为2×10

菌丝生长平均抑制率＝[(对照组菌落直径均值-处理组菌落直径均值)/(对照组菌落直径均值-接种菌饼直径)]×100％。

表1生防菌剂对番茄根腐病菌菌丝生长的抑制效果

结果表明，由产碱假单胞菌Pas7制备的生防菌剂对番茄根腐病菌菌丝生长的抑制效果达94.95％。

实施例4：温室盆栽试验检测生防菌剂对番茄根腐病的防效

处理组：移栽之前，用生防菌剂(活菌中浓度为10

对照组：不用生防菌剂处理，直接接种等量番茄根腐病菌游动孢子悬液。

处理组和对照组均为24株，重复三次；在温度25～28℃，相对湿度50％，光照12h/12h条件培养4周后，每株取根及随机10片叶片进行调查，按照0级(无病)、1级(病斑占叶、根的1/4以下，出现水渍状褐色斑点，没有出现腐烂状况)、2级(病斑占叶、根的1/4～1/2以下，主根开始腐烂，茎基部出现缢缩，但有新生的侧根，地上部无明显症状)、3级(病斑占叶、根的1/2～3/4以下，主根大部分腐烂，同时茎基部缢缩，侧根不再新生，地上部叶片枯萎)、4级(病斑占叶、根的3/4以上，根茎部位缢缩成线状，植株几乎死亡)的分级标准记载，计算病情指数和防效；表2示出了温室中生防菌剂对番茄根腐病的生防效果数据。

病情指数＝∑(病级株数×该病级数)/(总植株数×最高病级数)

防效＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％

表2温室中生防菌剂对番茄根腐病的生防效果

调查结果显示，温室盆栽实验中，由产碱假单胞菌Pas7制备的生防菌剂对番茄根腐病的防效达到89.87％。

实施例5：田间试验检测生防菌剂对番茄根腐病的防效和增产效果

本试验设在日光温室内，种植面积660m

处理组：定植前，将实施例2制得的生防菌剂稀释100倍(稀释后浓度为10

对处理组和对照组以棋盘取样方式各取5点，每点取10株；在盛果期测定平均株高、整株叶片面积、整株鲜重；调查并计算病株率；每株取根及随机10片叶片进行调查，计算病情指数和防效，比较两区抗病性；统计处理组和对照组的产量及效益，表3示出了生防菌剂对番茄根腐病防效和增产效果。

表3生防菌剂对番茄根腐病防效和增产效果

由表3可以看出，生防菌剂处理使番茄产量增加了23.5％，对番茄根腐病的防效达到了88.13％，增产效果和对番茄根腐病的防治效果均较为明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。