一种在制剂生产过程中检测磷酸肌酸钠残留的方法

摘要

本发明公开一种生产过程中检测磷酸肌酸钠残留的方法：该方法是采用高效液相色谱法进行检测，包括下述步骤。步骤1：配置磷酸肌酸钠样品溶液，所述的磷酸肌酸钠样品溶液包括磷酸肌酸钠供试液和磷酸肌酸钠对照液；步骤2：将步骤1所得的样品溶液注入高效液相色谱仪，采用等度流动相进行洗脱，并记录色谱图。所述检测方法采用五氟苯基键合硅胶色谱柱或者氨基柱。本发明的检测方法操作简单快速，克服现有技术的缺陷，磷酸肌酸钠主峰保留时间较短，使用过程中色谱系统耐用稳定，磷酸肌酸钠残留可以有效检出，测定方法专属性强，检测结果准确可信，为连续批生产过程中磷酸肌酸钠的残留检测提供了一种简便合理的检测方法。

说明书

技术领域

发明涉及药物技术领域，具体涉及心肌保护剂磷酸肌酸钠检测方法，特别涉及一种在生产过程中检测磷酸肌酸钠残留的方法。

背景技术

磷酸肌酸（creatine phosphate）是心肌代谢中一种重要的供能物质，1928年从哺乳动物肌肉中分离得到。磷酸肌酸二钠(phosphocreatine disodium)，化学名称为N-[亚氨基(膦氨基)甲基]-N-甲基甘氨酸二钠盐，结构式如下式所示是其药用形式，具有心肌保护功能，且无副作用，可作为心内科，外科辅助治疗药。临床上可用于治疗横纹肌活性不足，作为心肌疾病的辅助治疗。1992 年，意大利欧辉制药厂首先将磷酸肌酸二钠盐开发新药上市，由于疗效确切，副作用小，磷酸肌酸二钠盐一上市就在欧美等发达国家的心脏手术，心肌梗塞等心肌疾病治疗中等到了广泛的应用，取得了良好的效果。 1995年我国开始进口注射用磷酸肌酸二钠盐。

磷酸肌酸钠在生产过程中会与其他产品进行共线生产，药品的残留量可能会影响自身产品以及其他共线生产产品的药品质量和药品安全性，因此在药品生产的环节，都应该按照药品GMP指南，进行残留量限度的计算，并寻找合适的方法进行检出。

目前有文献进行了有关物质检测方法的报道，但是鲜有文献进行残留检测方法的报道，目前文献报道的有关物质方法又不能满足残留检测快速大量的检测需求，因此本领域技术人员致力于开发一种有效的在生产过程中检测磷酸肌酸钠残留的方法。

发明内容

在磷酸肌酸钠的批生产过程中，对清洗的残留取样通常一批会有15个以上的取样点，所以液相监测进样次数多，通常需要一天连续24小时检测，在多批连续生产的过程中，需要连续多天持续检测，这要求检测条件稳定、色谱柱耐用，检测结果快速。

磷酸肌酸钠在普通的C18柱上很难保留或者主峰会与空白峰重合，所以在通常流动相中会加入离子对试剂，加强磷酸肌酸钠的保留，如《中国药典》2015年版中磷酸肌酸钠的检测方法，流动相为加入了离子对试剂四丁基氢氧化铵的纯水性流动性，该流动相中磷酸肌酸钠出峰时间在30min左右，不能实现快速检测。另有文献（中国药物与临床2005，5（11）,865-866）也使用四丁基氢氧化铵，出峰时间短（8.9min），但离子对试剂使用过程中对柱填料损伤较大，在这种条件下色谱柱的寿命只有几天，通常使用2天后会出现峰裂分和理论塔板数下降的情况。所以通常白天使用后就需要马上冲洗，对色谱柱进行一定的修复，难以实现2天以上连续进样。

另外有文献（CN101034086B）报道包含有正戊胺的流动相，该类条件理论塔板数较低，基线噪音大，使得检测限和定量限浓度过高，难以达到方法验证的要求。

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是：有效、快速、稳定、色谱条件耐用的检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种在生产过程中检测磷酸肌酸钠残留的方法，所述检测该方法采用高效液相色谱法进行，包括以下步骤：

步骤1：配置磷酸肌酸钠样品溶液，所述的磷酸肌酸钠样品溶液包括磷酸肌酸钠供试品溶液和磷酸肌酸钠对照品溶液；

步骤2：将步骤1所得的样品溶液注入高效液相色谱仪，采用流动相进行等度洗脱，并记录色谱图；

所述对照品溶液的的制备方法包括下述步骤：另取磷酸肌酸钠对照品适量，用稀释液溶解并稀释成每1mL含0.1-2μg的溶液作为对照品溶液；

所述高效液相色谱法的色谱柱为五氟苯基杂化柱（包括核壳柱）或氨基柱；

所述流动相为色谱有机溶剂与磷酸盐缓冲或碳酸盐缓冲体系的混合溶剂，所述有机溶剂的比例为70-85%。

进一步地所述高效液相色谱法的色谱柱为Kinetex F5 100A 4.6×150mm 2.6μm或岛津amide 4.6×250mm 5μm。

所述磷酸盐缓冲包括磷酸钾、磷酸钠、磷酸铵体系；所述磷酸盐缓冲体系的pH为5~8之间。

所述有机溶剂为色谱乙腈或色谱甲醇，所述色谱乙腈或色谱甲醇中包含所述色谱乙腈或色谱甲醇中包含0.1~1%乙醇；在没有乙醇的情况下，图谱峰形宽和理论塔板数较低。

所述乙醇在色谱甲醇或色谱乙腈的比例为0.1-1:100。

所述高效液相色谱法的检测波长为205~220nm。

所述高效液相色谱法的色谱柱柱温为35~45℃。

所述高效液相色谱法的流速为0.5~1.5mL/min 。

所述步骤2具体还包括如下子步骤：精密量取空白溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图，按主成分外标法计算杂质含量。

本发明的检测方法操作简单快速，克服现有技术的缺陷，磷酸肌酸钠主峰保留时间较短，使用过程中色谱系统耐用稳定，色谱柱寿命长，磷酸肌酸钠残留可以有效检出，测定方法专属性强，检测结果准确可信，为连续批生产过程中磷酸肌酸钠的残留检测提供了一种简便合理的检测方法。本发明方法适用于磷酸肌酸钠多批原料药或制剂生产过程中清洗残留量取样检测的测定。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1为本发明的一个较佳实施例的专属性试验空白图谱；

图2为本发明的一个较佳实施例的专属性试验对照液图谱；

图3为本发明的一个较佳实施例的定量限图谱；

图4为本发明的一个较佳实施例的检测限图谱；

图5为本发明的一个较佳实施例的精密度试验供试液图谱；

图6为本发明的一个较佳实施例的准确度试验50%限度供试液图谱；

图7为本发明的一个较佳实施例的准确度试验100%限度供试液图谱；

图8为本发明的一个较佳实施例的准确度试验150%限度供试液图谱。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1

检测条件及仪器条件

仪器条件LC-2030C高效液相色谱仪（四元泵、脱气单元、UV检测器、柱温箱、自动进样器、系统监测器、LCsolution）（日本岛津公司）；供试品（重庆圣华曦药业股份有限公司），乙腈、乙醇（merck色谱纯），其它试剂分析纯，水为鲜制超纯水。

按照高效液相色谱法（中国药典2015年版通则0512）测定，使用InertSustainAmide为色谱柱，以乙腈-0.2%乙醇溶液为流动相A；0.02mol/L碳酸氢铵（PH7.0）为流动相B，A的比例为75% 进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0mL，柱温为35℃，检测波长为210nm，灵敏度：1.0AUFS。

专属性

样品溶液配制

空白溶剂：取空白棉签两支，用纯化水润湿后拧干（纯化水为清洗后的设备用水），加入流动相10ml，超声3min，滤膜过滤。

对照溶液贮备液（0.5mg/mL）：取磷酸肌酸钠对照品约50mg（按水合物计约65mg）于100mL量瓶中，用流动相溶解，定容至刻度，摇匀。

对照溶液（0.0012mg/mL）：精密量取对照贮备液1.0mL于50mL量瓶中，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液6mL于50mL量瓶中，定容至刻度，摇匀。

测定方法

分别进样空白和对照溶液，考察方法的专属性，确认本验证方法空白溶液对磷酸肌酸钠的测定不存在干扰；空白溶液对主峰无干扰。专属性试验结果证明：磷酸肌酸钠保留时间为6.362min，空白溶液对主峰检测无干扰。实验结果如附图1和附图2所示。

定量限检测限

定量限：通过进样低浓度的磷酸肌酸钠对照溶液，再根据峰高调整下一次的进样浓度。当信噪比为10时，该浓度即为其定量限浓度，定量限溶液重复进样6针，计算并报告峰面积的RSD。如图3所示，最终确定S/N约为11时候0.0439μg/ml为定量限，面积RSD为1.7%。

检测限：通过进样低浓度的磷酸肌酸钠对照品溶液，再根据峰高调整下一次的进样浓度。当信噪比（S/N）为3时，该浓度为其检测限，检测限溶液重复进样6针，计算并报告峰面积的RSD。如图4所示，最终确定S/N约为3.5时的浓度0.0143μg/ml为检测限。面积RSD为3.3%。定量限检测限试验结果：

线性

选择定量限、表面残留物限度浓度的30%、50%、80%、100%、120%、150%进行验证，每个浓度重复进行3次，以验证方法能够符合要求。

线性储备液（0.12mg/mL）：取磷酸肌酸钠对照品约24mg（按水合物计约31mg）于200mL量瓶中，用流动相溶解，定容至刻度，摇匀。

定量限溶液：根据定量限测定项下，确定溶液的浓度。

线性溶液：

30%线性溶液：取线性贮备液0.3mL置100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀；

50%线性溶液：取线性贮备液0.5mL置100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀；

80%线性溶液：取线性贮备液0.8mL置100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀；

100%线性溶液：取线性贮备液1.0mL置100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀；

120%线性溶液：取线性贮备液1.2mL置100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀；

150%线性溶液：取线性贮备液1.5mL置100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀。

线性试验结果如下：

线性试验结果回归线的相关系数r为0.9998，Y轴截距与100％响应值之比为3.0%，表明线性关系良好，方法可靠。

准确度

通过模拟实际的清洗条件，用经验证的检验方法检测淋洗液中磷酸肌酸钠的浓度。可选择50%、100%、150%三个浓度，每个浓度重复进行3次，验证取样方法的回收率及重复性，以验证淋洗液的取样方法能够符合要求。

50%浓度：取磷酸肌酸钠对照品约25mg（按水合物计约32.5mg），精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取1ml置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，再取6ml置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，得每1ml中约含磷酸肌酸钠约0.6ug的溶液；平行配制3份。

100%浓度：取磷酸肌酸钠对照品约50mg（按水合物计约65mg），精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取1ml置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，再取6ml置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，得每1ml中约含磷酸肌酸钠约1.2ug的溶液；平行配制3份。

150%浓度：取磷酸肌酸钠对照品约75mg（按水合物计约97.5mg），精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取1ml置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，再取6ml置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，得每1ml中约含磷酸肌酸钠约1.8ug的溶液；平行配制3份。

待系统稳定后，进样空白溶液、供试品溶液，分别计算回收率。不同浓度所采集的色谱图详见附图6、附图7和附图8所示。准确度试验结果如下：

50%水平的回收率为104.8%，100%水平的回收率为99.85%，150%水平的回收率为102.13%，平均回收率为102.27%。按照2010年版药品生产GMP指南，准确度回收率平均值应不低于75%，RSD不超过10%，目前的方法平均回收率和RSD符合要求。

精密度

供试品溶液：取注射用磷酸肌酸钠50mg（按水合物计约65mg），精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取1ml置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，再取6ml置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，同法配制6份。

精密度供试液谱图如附图5所示。精密度试验结果如下：

方法精密度实验结果可知重复配制6份供试品溶液，每份溶液进样1次，6次测定磷酸肌酸钠含量结果RSD为0.95%，检测方法精密度良好。

溶液稳定性

通过分析分别于室温和10℃放置不同时间的供试品溶液，论证磷酸肌酸钠溶液的稳定性。以下时间点需被考察：0h、2h、4h、6h、8h、12h，如果发现溶液不稳定，需缩短时间间隔。溶液外观应澄清；与0h时对照溶液主峰面积的最大偏差为≤5%，即视为溶液稳定。溶液稳定性试验结果如下：

有以上表格数据可知，供试品溶液在室温或者10℃放置12h内均稳定，供试品检测可以在样品配置好12h内使用。

经过以上专属性、线性、准确度、检测限定量限、精密度、溶液稳定性等项目的验证，证明该方法可以达到GMP要求的药物清洗残留检测方法的要求。

实施例2 连续生产3批过程中残留检测值

取样点编号为C1-C16。第一批残留检测试验结果：

*ND表示未检出，下同。

第二批残留检测试验结果如下：

第三批残留检测试验结果：

连续生产三批过程中磷酸肌酸钠残留取样检测结果，色谱条件持续检测3天，系统稳定，色谱柱状态稳定，实际在连续工作30天的情况下，色谱柱的理论塔板数稳定，没有出现离子对条件下容易产生的双峰、峰变宽、理论塔板数下降的情况。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。