一种SM03单抗的活性检测方法及其在SM03单抗质量监控中的应用

摘要

本发明公开了一种SM03单抗的活性检测方法及其在SM03单抗质量监控中的应用。所述方法包括如下步骤：包括如下步骤：将SM03单抗固定在酶标板上，孵育；然后加入含抗IgM抗体的B淋巴瘤细胞悬液，孵育；再通过检测孵育后B淋巴瘤细胞的存活率评价SM03单抗活性。通过实验证明：本发明的SM03单抗活性检测方法稳定且灵敏度高，适用于对SM03单抗的质量控制，可用于评估SM03单抗产品在体内疗效是否达到预期。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SM03单抗的活性检测方法及其在SM03单抗质量监控中的应用。

背景技术

人CD22是在成熟IgD+IgM+B细胞上表达的一种糖蛋白，是一种防止免疫系统过 激反应或自身免疫疾病的调节分子。它的胞外结构由七个免疫球蛋白样的结构域组成， 细胞内结构由三个免疫受体酪氨酸抑制结构域组成。CD22分子可以压抑B细胞受体 (B cellreceptor，BCR)信号，避免B细胞被抗原过度激活导致免疫调控失衡。已有 实验证据表明，CD22基因敲除小鼠体内的B细胞处于过度激活状态，在I型胶原诱 导下，关节炎症状的表现也比野生型小鼠更严重。CD22基因敲除所导致的BCR信号 过强还会导致边缘区B细胞(Marginal Zone B cells)发育异常，而该B细胞群体的发 育严重依赖于弱BCR信号强度。

目前，CD22如何从分子生物学层面来抑制BCR活性还未被清楚揭示。 Epratuzumab是目前机制研究较为充分的抗CD22单抗之一。Epratuzumab可能通过胞 啃作用、破坏B细胞和内皮细胞的相互接触或调节CD22下游信号通路来实现抑制B 细胞免疫的目的。然而上述发现涉及到的有关研究方法，因为其步骤繁杂可重复性差， 均不适合抗CD22抗体在日常生产中的质量控制。迄今为止还未有抗CD22单抗产品 被成功商业化，因此还未有可用于抗CD22单抗活性质量控制的检测方法的相关报导。

SM03是由鼠源抗体RFB4衍生的一种抗CD22嵌合抗体，并已在非何氏淋巴瘤的 治疗上进入临床试验阶段。SM03单抗的结合表位不同于Epratuzumab抗体，其对B 细胞的免疫抑制作用也更强。由于SM03单抗以成熟B细胞为目标并抑制其功能，这 一单抗产品应用已扩展到其它自身免疫疾病适应症的治疗，尤其是类风湿性关节炎 (RA)和系统性红斑狼疮(SLE)。SM03单抗的生产过程需要一种基于细胞的活性测 定方法(cell-based assay)来确保产品质量的均一性。然而由于作用机理的差异，借鉴 其他针对B细胞淋巴瘤已商业化抗体如Rituximab的活性测定方法并不可行。

Rituximab是通过抗体的FC片段和自然杀伤细胞(Natural Killer Cells，NK)表面 的FC受体相结合并引导其对靶细胞产生杀伤(抗体依赖的细胞杀伤作用，antibodydependent cell cytotoxicity，ADCC)，或者通过FC片段募集血清中的补体攻击靶细胞(补体依赖的细胞杀伤作用，complement dependent cytotoxicity，CDC)。然而由于SM03在结合CD22分子后会被靶细胞迅速内吞，因此SM03并不依赖补体或其他免疫细胞 对靶细胞形成杀伤。所以适用于Rituximab的体外ADCC和CDC检测方法对SM03 产品质量控制不适用。

综上所述，目前尚缺乏一种稳定可靠易操作的基于细胞的活性检测方法用于SM03的产品质量控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定、可靠、易操作的基于细胞的SM03单抗活性检测 方法及其在SM03单抗产品的质量检测或监控中的应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种SM03单抗活性的检测方法。

本发明提供的SM03单抗活性的检测方法包括如下步骤：通过测量SM03单抗在 体外培养环境下对B淋巴瘤细胞的杀伤效果实现SM03单抗活性的检测。

上述SM03单抗活性的检测方法可包括如下步骤：将SM03单抗固定在酶标板上， 孵育；然后加入含抗IgM抗体的B淋巴瘤细胞悬液，孵育；再通过检测孵育后B淋巴 瘤细胞的存活率实现SM03单抗活性的检测。

上述SM03单抗活性的检测方法中，所述B淋巴瘤细胞可为现有技术中常见的B 淋巴瘤细胞，如Ramos细胞或Daudi细胞等。在本发明的一个具体实施例中，所述B 淋巴瘤细胞为Ramos细胞。

上述SM03单抗活性的检测方法中，所述抗IgM抗体可为现有技术中常见的抗IgM抗体，如羊抗人IgM抗体或小鼠抗人IgM抗体或鸡抗人IgM抗体等。在本发明的一 个具体实施例中，所述抗IgM抗体为羊抗人IgM抗体。

上述SM03单抗活性的检测方法中，所述检测孵育后B淋巴瘤细胞的存活率的试 剂可为Celltiter Glo试剂或CCK-8试剂。在本发明的一个具体实施例中，所述检测孵 育后B淋巴瘤细胞的存活率的试剂为Celltiter Glo试剂。

上述SM03单抗活性的检测方法具体可包括如下步骤：

1)将可吸附抗体的材料包被至酶标板上，洗涤；

2)将不同浓度梯度的SM03单抗溶液分别加入至步骤1)得到的酶标板中，孵育， 洗涤；

3)将含抗IgM抗体的Ramos细胞悬液加入至步骤2)得到的酶标板中，孵育；

4)将Celltiter Glo试剂加入至步骤3)得到的酶标板中，震荡均匀后读取各孔的荧光值，并计算出各孔的相对荧光强度值；以SM03单抗浓度的对数值为横坐标，以 相对荧光强度值为纵坐标，拟合四参数曲线，获得IC

更进一步的，所述1)中，所述可吸附抗体的材料可为Protein A或Protein G或Protein L。在本发明的一个具体实施例中，所述可吸附抗体的材料为Protein A。

所述洗涤可为用PBST进行洗涤。所述PBST为在PBS中加入Tween20，并使Tween20终浓度为0.05％(体积百分含量)后得到的溶液。

所述洗涤的次数可为3次。

更进一步的，所述2)中，所述不同浓度梯度的SM03单抗溶液的浓度可分别为15000ng/mL、10000ng/mL、6667ng/mL、4444ng/mL、2963ng/mL、1975ng/mL、1317 ng/mL、878ng/mL、585ng/mL、390ng/mL和260ng/mL。

所述SM03单抗溶液的加入量可为100μL/孔。

所述洗涤可为用PBS进行洗涤。

所述洗涤的次数可为3次。

所述孵育的条件可为室温孵育30min。

更进一步的，所述3)中，所述含抗IgM抗体的Ramos细胞悬液的细胞浓度可为 4×10

所述抗IgM抗体的浓度可为1μg/mL。

所述含抗IgM抗体的Ramos细胞悬液的加入量可为100μL/孔。

所述孵育的条件可为37℃、5％CO

更进一步的，所述4)中，所述Celltiter Glo试剂的加入量可为100μL/孔。

所述相对荧光强度值的计算方法为采用酶标仪读取各孔的荧光值，然后将各孔的荧光值减去对照孔的荧光值，得到各孔的相对荧光强度值；所述对照孔为将步骤2) 中的SM03单抗溶液替换为抗体稀释液后得到的孔。

上述SM03单抗活性的检测方法在SM03单抗质量检测或监控中的应用也属于本 发明的保护范围。

为了实现上述目的，本发明又提供了一种SM03单抗的质量检测或监控方法。

本发明提供的SM03单抗的质量检测或监控方法包括如下步骤：按照上述SM03 单抗活性的检测方法获得SM03单抗的IC

上述任一所述方法中，所述IC

为了实现上述目的，本发明最后提供了一种产品；所述产品的功能为如下a1)或a2)：

a1)SM03单抗的活性检测；

a2)SM03单抗的质量检测或监控。

所述产品包括抗IgM抗体和B淋巴瘤细胞。

进一步的，所述产品还可包括Celltiter Glo试剂。

更进一步的，所述产品还可包括Protein A预包被的96孔白板、PBS、FBS、RPMI1640基础培养基、青霉素、链霉素和Tween20。在本发明的一个具体实施例中， 所述产品由抗IgM抗体(如羊抗人IgM抗体)、B淋巴瘤细胞(如Ramos细胞)、Celltiter Glo试剂、Protein A预包被的96孔白板、PBS、FBS、RPMI1640基础培养基、青霉素、 链霉素和Tween20组成。

鉴于抗CD22抗体的特殊作用机制，且目前其活性测量方法稳定性差、操作难度 高不适用于SM03单抗的质量控制。本发明提供了一种适用于SM03单抗质量控制的 基于细胞的活性检测方法，该方法通过测量SM03单抗在体外培养环境下对B淋巴瘤 细胞杀伤效果实现SM03单抗质量的检测。通过实验证明：该检测方法稳定且灵敏度 高，适用于对SM03单抗的质量控制，可用于评估SM03单抗产品在体内疗效是否达 到预期。

附图说明

图1为四参数拟合曲线。X轴指代的是SM03单抗的浓度(取对数值)，Y轴指代 的是相对荧光强度值(Relative Light Unit)。

图2为对比例中的四参数拟合曲线。X轴指代的是SM03单抗的浓度(取对数值)， Y轴指代的是相对荧光强度值(Relative Light Unit)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定于本发明。

下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中所用试剂耗材货号仅供参考，可根据实际情况换用同类产品；所提供浓度仅供参考，请根据实际样品调整。

实施例1、SM03单抗活性的检测方法与产品质量控制方法

一、检测原理

Ramos细胞表面表达膜型IgM和CD22，用特定抗原或抗体交联Ramos细胞表面 的IgM后可引发细胞凋亡，SM03单抗与CD22结合后可增强特定抗原或抗体交联膜 型IgM后的细胞凋亡作用。但由于CD22胞内段含内吞基序，Ramos细胞膜表面的CD22 与某些抗CD22抗体结合后，会引发CD22的内吞而使其促进细胞凋亡的作用减弱。 因此，本发明首先采用protein A将SM03单抗固定在酶标板上，再加入Ramos细胞和 抗IgM抗体进行孵育，通过检测Ramos细胞内的ATP反映细胞活率，进而代表SM03 单抗促进细胞凋亡的作用。

二、试剂耗材

1、所用试剂耗材如表1所示。

表1、试剂耗材

2、PBST(洗涤用)

在PBS中加入Tween20，使其终浓度为0.05％(体积百分含量)。

3、RPMI1640完全培养基(细胞传代用)

取RPMI1640基础培养基，加入10％FBS(胎牛血清)，再加入青霉素和链霉素， 使两者终浓度分别为100Units/mL和100μg/mL。配制好的培养基置于2～8℃保存。

4、抗体稀释液(活性试验用)

在RPMI1640完全培养基中加入Tween20，使其终浓度为0.05％(体积百分含量)。配制好的抗体稀释液置于2～8℃保存。

三、检测方法

1、洗涤

取Protein A(Thermofisher)预包被的96孔白板，用PBST 200μL/孔洗涤3次。

2、稀释

取SM03单抗标准品(表1中的试剂6)，用抗体稀释液稀释至15000ng/mL作为首浓度点，再按1:1.5倍比稀释，共11个浓度点，即15000ng/mL、10000ng/mL、6667ng/mL、4444ng/mL、2963ng/mL、1975ng/mL、1317ng/mL、878ng/mL、585ng/mL、390ng/mL 和260ng/mL，100μL/孔加入Protein A预包被的96孔白板中，每个梯度均设置复孔；对 照孔中加入100μL/孔抗体稀释液；室温孵育30min。

3、制备细胞悬液

取生长状态良好的Ramos细胞(

4、再洗涤

弃去步骤2得到的酶标板中液体，用PBS 250μL/孔洗涤3次。

5、加入细胞悬液

将步骤3制备的含羊抗人IgM抗体的Ramos细胞悬液以100μL/孔加入到步骤4 得到的酶标板中，于37℃、5％CO

6、检测

向各孔中加入Celltiter Glo，100μL/孔，震荡均匀。采用酶标仪读取各孔的荧光值。 其结果减去对照孔的荧光值后计算得到各孔的相对荧光强度值(Relative LightUnit， RLU)。以SM03单抗的浓度(取对数值)为横坐标，以相对荧光强度值为纵坐标，使 用四参数法拟合曲线，并计算SM03单抗标准品的IC

在实际应用中，可以按照上述方法根据如下标准判断SM03单抗待测样品质量是否合格：若SM03单抗待测样品的IC

实施例2、SM03单抗活性的检测方法在SM03单抗产品质量监控中的应用

一、SM03单抗待测样品的检测

SM03单抗待测样品：按照公开号为CN1542019A，发明名称为抗人非何杰金淋巴 瘤嵌合抗体及其衍生物与应用的发明专利中所述方法生产制备SM03单抗，收获生物 反应器中的细胞悬浮液，并通过进一步提纯浓缩后的样品即为SM03单抗待测样品， 选择SM03-202101-B批次样品、SM03-202102-B批次样品和SM03-202102-H批次样 品作为SM03单抗待测样品。其中，SM03-202102-H批次样品为将SM03-202102-B批 次样品置于高温条件下加热(加热条件具体如下：80度加热20分钟)后所获得的样 品。三个批次样品均为产品研发目的而生产，不会用于临床试验。

将实施例1步骤三的2中的SM03单抗标准品替换为SM03单抗待测样品，并按 照实施例1步骤三中的检测方法对SM03单抗待测样品进行检测，判断其质量是否合 格。

结果如表2所示。结果表明：加热可以使SM03单抗活性降低，SM03-202102-H 批次样品被判定为质量不合格。其他两个批次样品SM03-202101-B、SM03-202102-B 均判定为质量合格。

表2、不同批次SM03单抗待测样品的IC

二、检测结果的验证

分别检测步骤一中的SM03单抗待测样品的如下各个指标：澄清度、pH、渗透压(mOsmol/kg)、蛋白含量(mg/mL)、细菌内毒素检查(EU/mg)、微生物限度检查、 分子阻排色谱、非还原型毛细管电泳、CD22结合活性(％)、蛋白质A残留量(ppm)、 外源性DNA残留量(pg/mg)。其中，蛋白含量、微生物限度检查、澄清度、pH、渗 透压、细菌内毒素检查、分子阻排色谱的检测方法记载于“《中华人民共和国药典》2020 年版”中；分子阻排色谱的检测方法记载于“Alley,S.C.,&Anderson,K.E.(2013). Analytical and bioanalyticaltechnologies for characterizing antibody-drug conjugates.Current opinion inchemical biology,17(3),406–411.”中；细菌内毒素检查的 检测方法记载于“SettingEndotoxin Limits During Development of Investigational Oncology Drugs andBiological Products Guidance for Industry:Draft Guidance for Industry”中，毛细管电泳的检测方法记载于“Rustandi,R.R.,Washabaugh,M.W.,& Wang,Y.(2008).Applications of CE SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products.Electrophoresis,29(17),3612–3620”中；CD22结合活性的检测 方法记载于“Xiao,X.,Ho,M.,Zhu,Z.,Pastan,I.,&Dimitrov,D.S.(2009).Identification andcharacterization of fully human anti-CD22 monoclonal antibodies.mAbs,1(3),297–303.”中；外源性DNA残留量的检测方法记载于“Wang,X.,Morgan,D.M.,Wang, G.,&Mozier,N.M.(2012).Residual DNA analysis in biologics development:review ofmeasurement and quantitation technologies and future directions.Biotechnologyand bioengineering,109(2),307–317.”和“《中华人民共和国药典》2020年版”中。

检测结果如表3所示。检测结果表明：按照本发明的SM03单抗质量检测方法获 得的质量合格的SM03单抗待测样品均符合各项检测指标的合格标准，而质量不合格 的SM03单抗待测样品的部分检测指标不符合相应的合格标准。说明本发明的SM03 单抗质量检测方法可用于SM03单抗样品的质量监控。

同时上述实验结果还表明，高温条件失活下的SM03单抗样品对CD22分子的结 合活性下降，高温加热可以使SM03单抗样品产生少量沉淀。SM03-202102-H批次被 判定为不合格，SM03单抗对CD22结合活性的下降和Ramos细胞生长抑制IC

表3、不同批次SM03单抗待测样品的各指标检测结果

对比例、SM03单抗的活性检测方法

1、洗涤

取Protein A(Thermofisher)预包被的96孔白板，用PBST 200μL/孔洗涤3次。

2、稀释

取SM03单抗标准品，用抗体稀释液稀释至3000ng/mL作为首浓度点，再按1:2倍 比稀释，共12个浓度点，即3000ng/mL、1500ng/mL、750ng/mL、375ng/mL、187.500 ng/mL、93.750ng/mL、46.875ng/mL、23.438ng/mL、11.719ng/mL、5.859ng/mL、2.930 ng/mL和1.465ng/mL，100μL/孔加入Protein A预包被的96孔白板中，每个梯度均设置 复孔；对照孔中加入100μL/孔抗体稀释液；室温孵育30min。

3、制备细胞悬液

取生长状态良好的Ramos细胞(

4、再洗涤

弃去步骤2得到的酶标板中液体，用PBS 250μL/孔洗涤3次。

5、加入细胞悬液

将步骤3制备的含羊抗人IgM抗体的Ramos细胞悬液以100μL/孔加入到步骤4 得到的酶标板中，于37℃、5％CO

6、检测

向各孔中加入Celltiter Glo，100μL/孔，震荡均匀。采用酶标仪读取各孔的荧光值。 其结果减去对照孔的荧光值后计算得到各孔的相对荧光强度值(Relative LightUnit， RLU)。以SM03单抗的浓度(取对数值)为横坐标，以相对荧光强度值(Relative LightUnit)为纵坐标，使用四参数法拟合曲线，并计算SM03单抗标准品的IC

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。