用于铂基药物的药物递送系统

摘要

本发明涉及用于抗癌治疗的纳米医学领域。使用铂基化合物治疗癌症包括一些缺点，诸如生物相容性、负载效力、药物在储存期间和血液中的泄漏，更特别是由用于铂递送的纳米载体的性质引起。发明人发现一种新的纳米系统，其可改进铂基药物在体内的性能、动力学和功效。特别地，本发明涉及用作药物递送系统的纳米颗粒，所述纳米颗粒至少由以下形成：(a)铂基药物，(b)聚‑L‑精氨酸和(c)透明质酸。特别地，发明人就包封率测试了这些纳米颗粒，并且还在2D细胞培养(研究B6KPC3、A549和HT‑29细胞的生存能力)和3D细胞模型(由HTC‑116制成的球体)中进行了体外实验和体内实验(通过向小鼠静脉注射所述纳米颗粒或对比的奥沙利铂溶液)来证明其功效。

说明书

技术领域

本发明涉及用于抗癌治疗的纳米医学领域，并提出了包封至少一种铂基药物的新型纳米颗粒。本发明还涉及了用于制备这些纳米颗粒的方法、包含这些纳米颗粒的药物组合物以及这些纳米颗粒的治疗用途。

背景技术

在过去的几十年中，已知药物递送研究在用于抗癌治疗的纳米药物领域取得了显著增长。由于其具有通过以组织特异性或细胞特异性方式靶向递送药物来改进药物在生物利用度和治疗功效方面的性能并降低毒性的能力，纳米药物产品有望改进治疗策略。

由于显而易见的原因，药物的靶向递送对于难以手术且当前化疗药物几乎不起作用的肿瘤和/或癌症特别有利。例如，胰腺导管腺癌(PDAC)是胰腺癌的最常见形式，其位于胰头的位置使这种肿瘤看起来像是坚固的堡垒。

已经考虑了两种主要途径(“被动”和“主动”靶向)，以增加纳米药物对肿瘤的选择性。由于血管结构异常和淋巴引流不畅，被动靶向可从EPR(增强的渗透和滞留)效应中受益。主动靶向使用亲和配体，诸如抗体、维生素、靶向肽或某些受体(即CD44)的过表达来靶向肿瘤。在被考虑用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中，铂基药物，例如铂(II)化合物(诸如顺铂、卡铂和奥沙利铂)在世界范围内得到认可。

由美国国立卫生研究院(NIH)维护的临床试验数据库(其列出了180多个国家/地区的大于186 000次临床试验)指出顺铂是比其他任何抗癌药更有效的临床试验的成分。欧盟临床试验登记网站(其由欧洲药品管理局(EMA)维护并且列出了使用欧洲临床试验数据库(EudraCT)协议进行的超过25 000次试验)以及WHO的国际临床试验注册平台也保持类似的趋势。

这些活性剂是化学疗法的重要成分，但受到严重的剂量限制副作用以及尤其是在顺铂的情况下，肿瘤能够迅速产生耐药性的限制。在临床建立的铂化合物中，顺铂以剂量依赖性方式对器官(诸如神经系统、Corti器和肾脏)产生最大毒性作用。常规剂量的卡铂和奥沙利铂没有肾毒性。另外，与顺铂相反，这两种药物仅具有中等程度的致呕作用。奥沙利铂最重要的剂量限制性副作用是感觉性周围神经病。此外，用奥沙利铂治疗后的严重过敏反应已有报道。术语“奥沙利铂诱导的超敏反应”可指急性神经感觉症状、与血浆中IL-6和TNF-α浓度升高有关的细胞因子释放综合征或涉及抗体形成和组胺释放的免疫反应。

关于铂基化合物的作用机理，其涉及四个关键步骤：(i)细胞摄取，(ii)水合/激活，(iii)DNA结合，以及(iv)导致细胞死亡的DNA损伤的细胞处理。

顺铂在细胞内经历水解(水合)，生成高反应性的带电荷的铂复合物[Pt(NH

奥沙利铂用于顺铂耐药性癌症，与顺铂无交叉耐药性。奥沙利铂是有机铂结构，其中铂原子与二氨基环己烷(也称为“DACH”)复合，并与作为离去基团的草酸酯配体复合配合。水合后，形成了数种瞬时反应性物质，包括与大分子共价结合的一水和二水DACH铂。最初仅形成单加合物，但最终奥沙利铂同时连接至两个核苷酸碱基，从而导致DNA交联。这些交联在两个相邻鸟嘌呤(GG)、相邻腺嘌呤鸟嘌呤(AG)和被居间核苷酸分隔的鸟嘌呤(GNG)的N7位置之间形成。它们抑制DNA复制和转录。奥沙利铂细胞毒性是细胞周期非特异性的。

如上所述，对于旨在减少与顺铂治疗相关的剂量限制性毒性的第二代铂复合物的研究，可见显著降低了肾脏毒性发生率的卡铂的成功开发。

第三代铂复合物的设计旨在克服细胞对顺铂/卡铂的耐药性。在设计和评估的数千种铂复合物中，在顺铂的胺配体上含有DACH修饰的顺式二氯(1,2-二氨基环己烷)铂(II)(DACHPtCl

根据配体的性质，铂化合物在水中具有不同的溶解度。实际上，例如，奥沙利铂的溶解度为6mg/mL，DACHPtCl

除了尚未完全理解的内在作用外，绝大多数副作用通常是由于药物分布的特异性差导致了重要的继发性副作用(参见上文)。

为了解决溶解度和靶向性的问题，已经描述了开发改进铂化合物性能的纳米载体的许多尝试。

设想包覆铂化合物的第一类载体是脂质体，例如在Senzer等(Mol CancerTher.2009；8(Supplement 1):C36-C36)和Hang等(Biochem Compd.2016；4(1):1中描述的那些。

还研究了其他类型的铂化合物载体。例如，通过在蒸馏水中用聚(乙二醇)-聚(谷氨酸)嵌段共聚物与DACHPtCl

但是，用于铂递送的纳米载体的一些常出现的缺点仍然需要解决，诸如生物相容性、负载功效、储存期间及血液中的药物泄漏。

此外，靶向能力可以防止在非靶向组织中出现不加区分的系统分布和聚集，从而防止出现铂化合物的副作用，诸如神经毒性(神经病)、视力障碍、耳毒性或骨髓抑制。

基于这些事实，纳米颗粒系统仍倾向于在体内改进铂基药物，特别是铂(II)基药物和/或铂(IV)基药物，优选铂(II)基药物(诸如DACHPt)的性能、动力学和功效。

因此，在本领域中仍需要提供能改进药物功效的抗癌产品，该药物是诸如铂化合物，特别是铂(II)基药物和/或铂(IV)基药物，优选铂(II)基药物(诸如)DACHPt，该药物功效在于包封率、改进的生物利用度、通过将药物靶向递送至恶性细胞的同时最大程度地减少对健康组织的暴露而增强的治疗效果、以及降低的毒性。

本领域仍需要提供包含纳米载体的抗癌药物，所述纳米载体是生物相容的且可生物降解的，且与铂基药物生物相容，特别是铂(II)基药物和/或铂(IV)基药物，优选铂(II)基药物(诸如DACHPt)。

本领域仍需要提供包含无需强制性化学合成的包含纳米载体的抗癌药物。

本领域仍需要提供稳定的且可以即用型冻干纳米颗粒的形式配制的抗癌药。

本发明涉及用作药物递送系统的纳米颗粒，所述纳米颗粒至少由以下形成：(a)铂基药物，(b)聚-L-精氨酸和(c)透明质酸。

本发明还涉及用于制备所述纳米颗粒的方法、可通过所述方法获得的纳米颗粒、包含至少一种所述纳米颗粒和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物、以及用于预防和/或治疗癌症的所述纳米颗粒。

附图说明

图1显示了在蒸馏水和人血清中温育1小时后，荧光标记的PArg-HA纳米颗粒的SPT(单颗粒跟踪)测量。

图2显示了用浓度增加(0-200μM)的奥沙利铂、空白NP和负载DACHPt的NP，于37℃温育24小时的24h后，对B6KPC3(A)、HT-29(B)和A549(C)细胞进行的活性评估(平均值±SD，n＝6(A)&n＝3(B和C))。

图3A和3B显示了在小鼠静脉推注35.9μg负载DACHPt的纳米颗粒(图3A)或奥沙利铂溶液(图3B)后，铂衍生物的血浆浓度-时间曲线。圆圈符号“○”代表单个小鼠中观察到的血浆浓度。曲线代表根据数据计算出的最佳拟合。在图3A中，横坐标：时间以小时表示。纵坐标，DACHPt浓度以mg/L表示。在图3B中，横坐标：时间以小时表示。纵坐标，奥沙利铂溶液浓度，以mg/L表示。

图4显示了用5μM的负载DACHPt的NP和奥沙利铂处理后，多细胞HT116球体的标准化体积。

图5显示了用25μM的负载DACHPt的NP和奥沙利铂处理后，多细胞HT116球体的标准化体积。

图6显示了用50μM的空白、负载DACHPt的NP和奥沙利铂处理后，多细胞HT116球体的标准化体积。

图7是第0、1、2、3、4和7天拍摄的未经处理的多细胞HT116球体和用50μM的负载DACHPt的NP和奥沙利铂溶液处理的球体的照片。

本发明人已经构思了稳定的纳米颗粒(本发明中也称为NP)，其允许有效掺入铂基活性成分并根据药物动力学特征释放铂基活性成分，从而确保最佳的治疗活性，尤其允许最佳的抗癌活性。

更精确地，发明人已经构思了包含(i)铂基药物，(ii)聚-L-精氨酸和(iii)透明质酸的组合的纳米颗粒，所述纳米颗粒包封治疗有效量的铂基药物，该铂基药物可以选自具有不同结构和/或理化性能性能的各种铂基药物，诸如顺铂和DACHPt等等。

此外，根据本公开提供的含铂纳米颗粒允许根据药代动力学特征释放被包封的铂基纳米颗粒，从而确保所述活性成分的最佳治疗效果。如本文的实施例中所示，所述纳米颗粒允许获得与未被包封的相同药物相比AUC值高度增加的被包封的铂基药物。

对于允许增加的AUC的药物制剂而言，非常令人惊讶的是，本文所述的纳米颗粒还允许获得与未被包封的相同药物相比Cmax增加的铂基药物。

而且，与奥沙利铂药物溶液相比，如分布半衰期所反映的，根据本公开将铂基药物包封在纳米颗粒中允许实质性地提升血浆血液循环，而未增加消除半衰期。

此外，如本文中通过药代动力学模拟的实施例所示，所述含铂纳米颗粒允许避免包封在其中的铂基药物的积聚，而在其施用后迅速达到稳态。换言之，根据本公开的含铂纳米颗粒允许在不存在药物积聚的情况下确保本文中被包封的铂基药物的高暴露。该药代动力学特征表明，本文所述的含铂纳米颗粒完全符合重复施用方案。

因此，根据第一方面，本发明涉及用作药物递送系统的纳米颗粒，所述纳米颗粒至少由以下形成：

(a)铂基药物，

(b)聚-L-精氨酸，和

(c)透明质酸。

因此，本文描述的纳米颗粒由铂基药物递送系统，即含铂药物递送系统组成。

在一个优选的实施方案中，铂基药物是选自铂复合物(II)、铂复合物(IV)及其混合物的铂复合物。

根据一些实施方案，所述(a)铂基药物选自下组：铂(II)基药物、铂(IV)基药物及其混合物，优选是铂(II)基药物，更优选是DACHPt。在本公开中，“铂基药物”也可被称为“含铂药物”。

在水溶液中不含溶剂的情况下生产本发明的纳米颗粒。如果铂基药物在水中呈低可溶性形式，例如含有氯原子，它可以以更水溶性的形式转化，例如通过消除氯原子而不含氯原子。如果必须避免铂基药物的氯形式，则应避免在聚-L-精氨酸中氯原子的存在。

在一些实施方案中，所述(a)铂基药物以不含氯原子的形式存在，即所述铂基药物不含氯。

在本发明的意义上，表述“不含氯原子”、“缺乏氯原子”或“无氯”是指所述铂基药物缺乏任何氯原子；换言之，(a)铂基药物中存在的氯原子的数目为零。

根据其他实施方案，所述(a)铂基药物包含氯原子。

根据一些实施方案，所述(b)聚-L-精氨酸不是盐酸盐的形式，即所述(b)聚-L-精氨酸缺乏氯离子，例如无氯离子。

在本发明的意义上，表述“不含氯离子”、“缺乏氯离子”或“无氯离子”是指所述(b)聚-L-精氨酸，例如在盐酸盐形式下，不包含任何可检测量的氯离子，或者不包含氯离子。

根据另外的实施方案，所述(b)聚-L-精氨酸以含氯离子的形式提供。例如，所述(b)聚-L-精氨酸优选在存在于所述聚-L-精氨酸中的精氨酸残基的每个单体单元中包含一个氯离子。

根据又另外的实施方案，所述(b)聚-L-精氨酸以以下形式提供：其为不含氯离子的形式和含氯离子的形式的混合物，优选为聚-L-精氨酸盐酸盐和聚-L-精氨酸氢氧化物的混合物。

本公开的纳米颗粒具有简单的结构，该结构包含透明质酸聚合物和聚-L-精氨酸的网络，其包封铂基药物分子。因此，本公开的纳米颗粒不包含核-壳结构。

根据一些实施方案，所述化合物(a)、(b)和(c)彼此非共价连接。

例如在US2012/0177728和Brown等(J.Am.Chem.Soc.,2010,132,4678)中已经描述了包含铂(II)化合物(诸如奥沙利铂)的纳米颗粒。这些现有技术的纳米颗粒是分别基于脂质的纳米颗粒和基于金的纳米颗粒。因此，这些现有技术的纳米颗粒不包含透明质酸和聚精氨酸。

同时包含透明质酸和聚精氨酸的纳米载体本身是本领域已知的，例如Oyazurn-Ampuero等(Eur J Pharm Biopharm Off J ArbeitsgemeinschaftFürPharmVerfahrenstechnik eV.2011；79(1):54-57)使用透明质酸和聚精氨酸获得了纳米载体，并评估了此类纳米载体的稳定性，该纳米载体未负载任何药物。这些作者考虑通过将亲水性药物负载至纳米载体中来进一步探索这类纳米载体的相关性，尤其是从肽的口服递送来看。此外，Kim等(2009,Gene Med,Vol.11:791-803)已经测试了通过带负电荷的透明质酸和阳离子聚-L-精氨酸的静电复合形成的纳米颗粒用于递送siRNA。

根据另一方面，本发明涉及一种用于制备本文所述的纳米颗粒的方法，所述方法至少包括以下步骤：

(i)提供不含氯原子的水性复合物形式的铂基药物，

(ii)提供不含氯离子的聚-L-精氨酸水溶液，

(iii)将(i)的水性复合物形式的铂基药物与所述(ii)的水溶液混合，

(iv)在适合于形成纳米颗粒的条件下，向步骤(iii)获得的混合物中添加透明质酸，并且任选地，

(v)回收在步骤(iv)中获得的纳米颗粒。

根据一个特定实施方案，不含氯原子的铂基药物的水性复合物形式(i)是通过用AgNO

根据一个特定实施方案，从聚-L-精氨酸盐酸盐(PArg-Cl)获得不含氯离子的聚-L-精氨酸(ii)。

本发明的另一主题涉及通过所述制备方法而获得的纳米颗粒。

根据另一个主题，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种本发明中定义的纳米颗粒和至少一种药学上可接受的赋形剂。

根据其另一个主题，本发明涉及本文所述的纳米颗粒，其用于预防和/或治疗癌症，诸如胰腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)、结直肠癌，肺癌、小细胞癌和非小细胞肺癌、卵巢癌、睾丸癌、乳腺癌、脑癌、肉瘤、淋巴瘤、头颈癌、转移性结直肠癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌、宫颈癌、白血病，诸如慢性粒细胞白血病、前列腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、骨癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、肠癌。

本发明还涉及本文所述的纳米颗粒，其用于预防和/或治疗癌症(通常为顺铂抗性癌症)。

如本文其他部分所述，本发明涉及用作药物递送系统的纳米颗粒，所述纳米颗粒至少由以下形成：

(a)铂基药物，

(b)聚-L-精氨酸，和

(c)透明质酸。

根据一个特定实施方案，本发明涉及用作药物递送系统的纳米颗粒，所述纳米颗粒至少由以下形成：

(a)以不含氯原子的形式存在的铂基药物，

(b)聚-L-精氨酸氢氧化物，和

(c)透明质酸。

根据一个优选的特定实施方案，本发明涉及用作药物递送系统的纳米颗粒，所述纳米颗粒至少由以下形成：

(a)DACHPt，

(b)聚-L-精氨酸氢氧化物，和

(c)透明质酸。

在其中DACHPt用作(a)铂基药物的特定实施方案中，使用聚-L-精氨酸氢氧化物(代替聚-L-精氨酸盐酸盐或代替聚-L-精氨酸氢氧化物和聚-L-精氨酸盐酸盐的混合物)作为(b)聚-L-精氨酸允许有利地避免形成由于不溶于水而沉淀的DACHPtCl

根据另一个特定实施方案，本发明涉及用作药物递送系统的纳米颗粒，所述纳米颗粒至少由以下形成：

(a)含氯原子的铂基药物，

(b)聚-L-精氨酸盐酸盐，和

(c)透明质酸。

根据一个优选的特定实施方案，本发明涉及用作药物递送系统的纳米颗粒，所述纳米颗粒至少由以下物质形成：

(a)顺铂，

(b)聚-L-精氨酸盐酸盐，和

(c)透明质酸。

在顺铂用作(a)铂基药物且其中聚-L-精氨酸盐酸盐用作(b)聚-L-精氨酸的特定实施方案中，优点是尤其保护药物免受血浆蛋白损害，以及该药物在肿瘤中的更特异性的积聚。

根据本发明的纳米颗粒形成具有基质系统的聚合物纳米系统。

根据本发明的纳米颗粒是球形的。

更特别地，根据本发明的纳米颗粒将铂基药物包封(缔合)在其基质中。

例如，假设所述DACHPt纳米颗粒是基于带负电的HA和阳离子聚-L-精氨酸在水溶液中以不含氯离子的形式(诸如PAG-OH)的静电复合形成的。基于该假设，铂基药物、聚-L-精氨酸和透明质酸彼此非共价偶联。

用去离子水将纳米颗粒分散液以1/60稀释后，在25℃下使用Malvern

如实验部分所示，铂基载药纳米颗粒(诸如负载DACHPt的纳米颗粒)比相应的空白系统(即未负载的纳米颗粒)小。这种差异可能是由于药物存在下聚合物链的不同重排而引起的。猜测驱动DACHPt缔合的主要动力是来自铂的正电荷与来自HA的羧基负电荷之间的相互作用。

此外，用去离子水将纳米颗粒分散液以1/60稀释后，在25℃下使用Malvern

此外，在冷冻干燥之前，根据本发明的纳米颗粒具有小于或等于0.20，优选为0.01～0.20，更优选为0.03～0.06的多分散指数(PDI)。

另外，根据本发明的纳米颗粒，特别是冻干物形式的纳米颗粒是特别有利的。

实际上，一旦将纳米颗粒的冻干(或冷冻干燥)粉末用纯化水重溶，则悬浮液的pH和渗透浓度就可以与如静脉注射(IV)完全相容。

此外，冷冻干燥的粉末具有延长的保存期限。与先前的制剂(诸如胶束(其尺寸仅在240小时内保持稳定))相比，该结果是非常有利的。

因此，根据一个具体实施方案，将根据本发明的纳米颗粒冻干。冷冻干燥过程可以使用配有RZ6 Vacubrand pomp的ALPHA 1-4LSC(CHRIST)冷冻干燥机(Fisher Scientific,Illkirch,France)进行。从而获得纳米颗粒的即用型稳定冻干形式。

冷冻干燥后，使用与上述冷冻干燥前相同的方法和设备将粉末重悬于水中后，还可评估这些纳米颗粒的尺寸、多分散性和ζ电势。这些数值各自的范围分别定义如下。

根据本发明的纳米颗粒在冷冻干燥后具有小于或等于300nm，优选100nm～300nm，特别是200nm～300nm的平均尺寸(即流体动力学尺寸)。

因此，由上可知并且如实施例中所示，在冷冻干燥后，根据本发明的纳米颗粒的平均尺寸(即流体动力学尺寸)略有增加。这种变化与系统稳定性的下降无关。

此外，根据本发明的纳米颗粒在冷冻干燥后具有小于或等于0.20，优选0.010～0.200，特别是0.050～0.150，或甚至0.054～0.133的多分散指数(PDI)。

如实验部分所示，在冷冻干燥之前或之后，所述纳米颗粒的PDI特性值表明所获得的纳米颗粒群体是相当均匀的且是单分散的。

制剂的形状和约200nm的尺寸以及低多分散性(PDI低于0.2)意味着外渗和扩散，导致体内的肿瘤聚集。

此外，根据本发明的纳米颗粒的包封率为35％～90％，优选为40％～80％，更优选为42％～75％。

假设系统具有良好的靶向性，则较高的包封率意味着相同施用剂量下药物的效率提高。

铂基药物，特别是铂(II)基药物与聚合物残基缔合的机理在于铂基药物、HA和PAG之间的复合。带负电荷的HA(COO

以不同的[HA]/[PArg]重量比获得的颗粒的负表面电荷表明，在颗粒表面存在大量的HA。负电荷结合的聚合物的生物相容性意味着促进血液循环和网状内皮系统巨噬细胞摄取受限。

该制剂的主要优点在于不需要有机溶剂，从而避免了产品降解且促进了生产过程。将本发明的纳米颗粒与Cabral等(J Control Release.2005；101(1-3):223-232)开发的胶束进行比较，用于配制HA/PArg纳米颗粒的聚合物是药学上可接受的，且无需化学修饰。

例如，当铂基药物是二水(1,2-二氨基环己烷)铂(II)(DACHPt：奥沙利铂的活性形式)时，新配制的纳米颗粒在溶液中的尺寸稳定性约为2周，而14天后奥沙利铂降解出现。

为了解决该问题，在充当冷冻保护剂的甘露醇10％(w/w)溶液中制备聚合物溶液。在尺寸稳定性和包封效果方面可确保约1个月。纳米颗粒的最终甘露醇浓度约为7％(w/w)。

根据本发明的纳米颗粒形成由透明质酸(HA)和聚-L-精氨酸制备的聚合物纳米系统，以包封(或缔合)铂基药物，特别是铂(II)基药物，诸如二水(1,2-二氨基环己烷)铂(II)。

a)

如上所述，在适用于本发明的铂基药物中，可以提及铂(II)基药物、铂(IV)基药物及其混合物。

例如，作为铂(II)基药物，可以列举DACHPt、顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、乐铂、依铂。

例如，作为铂(IV)基药物，可以列举沙铂。

根据一个特定实施方案，所述(a)铂基药物以不含氯原子的形式存在。

根据一个优选的特定实施方案，所述不含氯原子的(a)铂基药物是铂(II)基药物。

根据一个更优选的特定实施方案，所述不含氯原子的(a)铂基药物选自下组：DACHPt、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、乐铂、依铂、顺二氨二水铂(II)、二水(1,2-二氨基甲基)环丁烷)铂(II)、二水(4,5-二氨基甲基-2-异丙基-1,3-二氧戊环)铂(II)及其混合物。

根据又一个更优选的特定实施方案，所述不含氯原子的(a)铂基药物是DACHPt。

根据另一个特定实施方案，所述(a)铂基药物包含氯原子。

根据一个优选的特定实施方案，所述含氯原子的(a)铂基药物选自下组：铂(II)基药物和铂(IV)基药物。

根据一个更优选的特定实施方案，所述含氯原子的(a)铂基药物选自下组：顺铂和沙铂。

根据又一个更优选的特定实施方案，所述含氯原子的(a)铂基药物是顺铂。

顺铂(CDDP，顺二氨二氯铂(II))是经典的铂复合物的第一个成员。铂原子与两个氯原子和两个作为配体的NH

卡铂(顺二氨(1,1-环丁烷二羧基)铂(II))是第二代铂药物。在卡铂中，两个氯原子(存在于顺铂中)被氧化的配体取代，该配体来自C

奈达铂(顺二氨基葡萄糖铂(II))是第二代铂药物。

奥沙利铂是第三代铂药物，是由铂和1,2-二氨基环己烷(<>)组成的有机复合物，并具有草酸酯配体作为离去基团(1,2-二氨基环己烷铂(II)草酸酯)。其IUPAC名称是(R,R)-1,2-二氨基环己烷(乙二酸酯-O,O)铂。目前，奥沙利铂由Sanofi以

奥沙利铂作为抗癌药的活性涉及多种途径。主要作用在于铂原子通过连接鸟嘌呤而结合DNA并形成单链或双链的能力，使得细胞无法增殖而导致其死亡。在进入细胞后，奥沙利铂经历水解，其中草酸酯部分与氯离子交换。这使得二氯二氨基环己烷铂(DACHPtCl

乐铂是第三代铂药物，是由乳酸形成的螯合物。其化学名称是顺式-[(1R*,2R*)-1,2-环丁烷双(甲基氨基)-N,N’][(2S)-2-羟基丙烷(2-)-O1,O2]铂。

依铂是铂丙二酸复合物，其化学名称为顺式-丙二酸(4,5-双(氨基甲基)-2-异丙基-1,3-二氧戊环)铂(II)。其也是第三代铂药物。

作为铂(IV)化合物，更特别地可以是沙铂。

适用于本发明的铂基药物可以以很大变化的量存在于本公开的纳米颗粒中，取决于包含在其中的铂基药物的种类。实际上，基于与铂基药物有关的大量文献，本领域技术人员知道确定包封在纳米颗粒内的铂基药物的合适用量。

相对于纳米颗粒的总重量，适用于本发明的铂基药物的含量为0.0001重量％-15重量％，优选为0.001重量％-10重量％，更优选为0.001重量％-1重量％。

b)

通常，聚-L-精氨酸以其盐酸盐形式使用，即聚-L-精氨酸盐酸盐(PArg-Cl)。通常是Alamanda

它是每个精氨酸单元含有一个HCl的带正电荷的合成聚氨基酸。它是可溶于水的结晶固体。其安全性非常令人感兴趣，其在可被人类酶降解方面的表现类似于多肽，因此在生物体内的积聚最少。

根据一个特定实施方案，以含氯离子的形式提供所述(b)聚-L-精氨酸，即存在于聚合物中的每个精氨酸单元包含一个氯离子(或一个HCl)。

根据一个优选的特定实施方案，以含氯离子的形式提供的所述(b)聚-L-精氨酸为聚-L-精氨酸盐酸盐。

根据另一个特定实施方案，所述(b)聚-L-精氨酸以不含氯离子的形式提供。

根据一个优选的特定实施方案，以不含氯离子形式提供的所述(b)聚-L-精氨酸是聚-L-精氨酸氢氧化物(PArg-OH)。

根据另一个特定实施方案，所述(b)聚-L-精氨酸以以下形式提供：其为不含氯离子的形式和含氯离子的形式的混合物，优选为聚-L-精氨酸盐酸盐和聚-L-精氨酸氢氧化物的混合物。

在根据本发明的纳米颗粒中，聚-L-精氨酸盐酸盐与聚-L-精氨酸氢氧化物的重量比可以是0/100-100/0，特别地可以是0/100、25/75、50/50、75/25或100/0。

应当理解，例如当聚-L-精氨酸盐酸盐与聚-L-精氨酸氢氧化物的重量比为0/100时，这意味着(b)聚-L-精氨酸仅是聚-L-精氨酸氢氧化物或当聚-L-精氨酸盐酸盐与聚-L-精氨酸氢氧化物的重量比为100/0时，这意味着(b)聚-L-精氨酸仅是聚-L-精氨酸盐酸盐。

可以通过将碱(诸如NaOH)添加到含有树脂的柱上，用离子交换树脂对PArg-Cl进行修饰来制备PArg-OH。然后，在柱底部回收由此获得的聚-L-精氨酸，PAG-OH。

优选地，根据本发明的PAG-OH的平均分子量(Mw)优选为3000-17000道尔顿，优选为5000-15000道尔顿。

相对于纳米颗粒的总重量，根据本发明的(b)聚-L-精氨酸的含量是2重量％-30重量％，优选为5重量％-20重量％，更优选为10重量％-17重量％。。

c)

透明质酸(也称为透明质酸素或透明质酸盐)是由天然存在于人体(生物流体和组织)中的含有N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸的二糖单元构成的阴离子多糖，且被广泛用于制药。

HA也是无毒、粘膜粘附性和可生物可降解的。

此外，HA具有内在的靶向活性，因为它充当了对CD44的亲和配体。CD44在肿瘤细胞上表达，并在某些抗性细胞系和癌症干细胞中过表达，尤其是在用某些抗癌药物(如吉西他滨)治疗后。

此外，有利的是，肿瘤微环境通常富含透明质酸酶，其可诱导更强的药物原位释放。

根据本发明的透明质酸的平均分子量(Mw)为10kDa-100kDa，优选为10kDa-30kDa，优选为15kDa-25kDa，更优选为20kDa，或优选为50kDa-100kDa。

本文中所有表示透明质酸的“分子量”的数字应理解为指示道尔顿(Da)的平均分子量(Mw)。

适用于本发明的透明质酸可以是Lifecore Biomedical销售的透明质酸(HA,LMWHA(Mw≈20kDa))。

相对于纳米颗粒总重量，根据本发明的透明质酸的用量为2.5重量％-12重量％，优选4重量％-12重量％。

如实验部分所示，当[HA]/[PArg]的质量比在0.5/2.5以下时，获得具有正ζ电势的纳米结构，表明这些系统的表面可以主要由带正电的PArg组成。高于此比，组织被倒转且HA链暴露在表面。在载药纳米结构的情况下，7/2.5-12/2.5的比未观察到尺寸差异，这表明系统是稳定的，并且进一步添加HA不会引起缔合的任何变化。

因此，这些纳米颗粒的[HA]/[PArg]重量比(或质量比)高于0.5/2.5(＝0.2)，优选为0.6/2.5(＝0.24)～15/2.5(＝6)，更优选为3/2.5(＝1.2)～12/2.5(＝4.8)，例如3/2.5、4/2.5(＝1.6)、7/2.5(＝2.8)、9/2.5(＝3.6)、10/2.5(＝4)、11.25/2.5(＝4.5)和12/2.5，还更优选为11.25/2.5。

此外，这些纳米颗粒的[铂基药物]/[HA]+[PArg]重量比(或质量比)为0.01-1.00，优选为0.03-0.50，更优选为0.04-0.10。

根据一个优选实施方案，用作根据本发明的药物递送系统的纳米颗粒至少由以下形成：

(a)铂(II)基药物，

(b)聚-L-精氨酸，和

(c)透明质酸。

根据一个更优选的实施方案，用作根据本发明的药物递送系统的纳米颗粒至少由以下形成：

(a)二水(1,2-二氨基环己烷)铂(II)，

(b)聚-L-精氨酸，和

(c)透明质酸。

根据又一个更优选的实施方案，用作根据本发明的药物递送系统的纳米颗粒至少由以下形成：

(a)二水(1,2-二氨基环己烷)铂(II)，

(b)聚-L-精氨酸氢氧化物，和

(c)透明质酸。

如实施例中所示，即使在冷冻干燥之后，特别是在尺寸方面以及在生物学条件下，根据本发明的纳米颗粒也是稳定的。

此外，如实验部分所示并且更特别地，在体外实验中，证明了未负载的纳米载体对被测细胞系无毒，有望用于体内。

游离药物与负载的纳米颗粒之间IC

在本发明中，通过动态光散射(DLS)确定纳米颗粒的流体力学尺寸和多分散指数(PDI)。将样品在去离子水中稀释至适当的浓度，及每次分析在25℃且检测角度为173°的条件下进行。

在本发明中，ζ电势(ZP)值由平均电泳迁移率值计算，该平均电泳迁移率值是由激光多普勒风速仪(LDA)测定。对于LDA测量，使用预先稀释的样品并将其放置在电泳池中。

使用

如上文所述；本发明涉及用于制备根据本发明的纳米颗粒的方法，所述方法至少包括以下步骤：

(i)提供不含氯原子的水性复合物形式的铂基药物，

(ii)提供不含氯离子的聚-L-精氨酸水溶液，

(iii)将所述(i)的水复合物形式的铂基药物与所述(ii)的水溶液混合

(iv)在适合于形成纳米颗粒的条件下，向步骤(iii)获得的混合物中添加透明质酸，并且任选地

(v)回收在步骤(iv)中获得的纳米颗粒。

该制备方法是如下所述的改进的离子性凝胶化方法。离子性凝胶化方法的一般程序例如描述于Oyarzun-Ampuero等(Eur J Pharm Biopharm Off J ArbeitsgemeinschaftFür Pharm Verfahrenstechnik eV.2011；79(1):54-57)中。

根据一个特定实施方案，本发明涉及用于制备根据本发明的纳米颗粒的方法，所述方法至少包括以下步骤：

(i)提供DACHPt，

(ii)提供聚-L-精氨酸氢氧化物的水溶液，

(iii)将所述(i)的DACHPt和所述(ii)的水溶液混合

(iv)在适合于形成纳米颗粒的条件下，向步骤(iii)获得的混合物中添加透明质酸，并且任选地

(v)回收在步骤(iv)获得的所述纳米颗粒。

有利地，根据本发明的制备方法允许通过使铂基药物，特别是铂(II)基药物水性复合物与聚精氨酸溶液中任选存在的氯化物相容，而提供稳定的铂基药物纳米颗粒，特别是铂(II)基药物纳米颗粒。

在步骤(i)中，提供了不含氯原子的水性复合物形式的铂基药物。

这种水性复合物形式的铂基药物可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得。

例如，可以通过用硝酸银(AgNO

将所述铂基药物的二氯化物(诸如DACHPtCl

在铂基药物的二氯化物形式中，可以列举二氨二氯铂(II)(顺铂)、二氯(1,2-二氨基环己烷)铂(II)(DACHPtCl

优选地，铂基药物的二氯化物形式是二氯(1,2-二氨基环己烷)铂(II)。

例如，二氯(1,2-二氨基环己烷)铂(II)可以是由Sigma Aldrich提供的DACHPtCl

反应后，形成氯化银(AgCl)沉淀。

然后，通过在3000rpm离心10分钟-20分钟，更优选20分钟来去除这些AgCl沉淀物。

然后，通过0.22μm过滤器过滤来纯化上清液，并由此回收相应的水复合物。

因此，相应的以无氯原子的水复合物形式存在的铂基药物可以选自二氨二水铂(II)、二水(1,2-二氨基环己烷)铂(II)(DACHPt)、二水(1,2-二氨基甲基)环丁烷)铂(II)、二水(4,5-二氨基甲基-2-异丙基-1,3-二氧戊环)铂(II)及其混合物，并且优选是二水(1,2-二氨基环己烷)铂(II)。

步骤(ii)在于提供不含氯离子的聚-L-精氨酸的水溶液。

根据一个特定实施方案，不含氯离子的聚-L-精氨酸是从聚-L-精氨酸盐酸盐(PArg-Cl)获得的。

根据另一个特定实施方案，所述不含氯离子的聚-L-精氨酸的水溶液是聚-L-精氨酸氢氧化物(PArg-OH)的水溶液。

例如，可以通过使用碱和离子交换树脂使聚-L-精氨酸盐酸盐(PArg-Cl)脱盐来获得聚-L-精氨酸氢氧化物。因此，用离子交换树脂(柱)，特别是阴离子交换树脂，诸如由Rohm&Haas销售的名为

首先，将碱添加到含有相应湿树脂的柱中。适用于本发明的碱可以选自NaOH、LiOH、…及其混合物。

经过足够的时间(例如15分钟-1小时，优选30分钟)后，用纯化水洗柱，直至溶液的pH达到中性pH。

然后，将PARg-Cl溶液，例如Alamanda

然后，在柱底部回收PArg-OH溶液。接下来，用纯化水冲洗该PArg-OH溶液，直到溶液达到所需浓度，例如12.5mg/mL。

将PArg-Cl特定修饰为PArg-OH允许消除残留的氯化物(Cl

因此，步骤(ii)允许克服PArg氯化物盐与铂基药物，特别是铂(II)基药物的不相容性问题，并有助于随后获得稳定的纳米颗粒。

步骤(iii)对应于将步骤(i)的不含氯原子的铂基药物的水性复合物与步骤(ii)的不含氯离子的聚-L-精氨酸的水溶液混合。

将不含氯离子的聚-L-精氨酸水溶液(诸如PArg-OH溶液)，和不含氯原子的铂基药物(诸如铂(II)基药物的水性复合物)，在例如小瓶中混合在一起，并在搅拌下放置1分钟-20分钟，优选10分钟。

由此获得步骤(i)和(ii)的两种上述组分的混合物。

在步骤(iv)中，将透明质酸，例如由Lifecore Biomedical销售的HA(LMWHA(Mw≈20kDa))，添加至由步骤(iii)获得的混合物中，以获得所需的纳米颗粒。

有利地，在混合之前，用0.22μm的过滤器过滤溶液以确保无菌。

然后，通过于室温下、在磁力搅拌下简单地混合聚合物水溶液，将HA与(i)中所述水性复合物和由步骤(iii)获得的(ii)中所述水溶液的混合物合并，以形成负载的纳米颗粒。

可以在步骤(iv)中添加不同浓度的HA，例如2.5mg/ml-12mg/ml，优选0.5mg/ml-12mg/ml。这允许获得纳米颗粒的不同[HA/PArg]质量比，因此可以帮助确定聚合物对纳米系统的贡献，并且可以定制纳米颗粒以掺入带正电荷的亲水性分子，诸如DACHPt。

此外，检查在甘露醇10％w/v存在下制备的所有制剂的pH和渗透浓度(osmolality)。

在中性pH下，HA是带负电荷的多糖，而PArg是具有正电荷的聚氨基酸，能够通过静电相互作用(即通过非共价键)形成纳米颗粒。

步骤(v)是任选的，并且包括分离由步骤(iv)获得的纳米颗粒。

为了分离系统，将给定体积(例如1mL)的纳米颗粒悬浮液转移到Eppendorf管中，并在给定体积(例如20μL)的甘油床中离心(例如以16000g，在25℃下30分钟)。

然后，丢弃上清液，并使用移液器和剧烈涡旋振荡将纳米颗粒重悬于水中。

根据本发明的制备方法允许获得由以上定义的透明质酸和以上定义的聚精氨酸组成的生物启发的聚合物纳米载体。

如实验部分所示，该纳米结构可以成功地包封(或缔合)铂基药物，特别是铂(II)基药物，诸如奥沙利铂的活性形式，即DACHPt。

猜测驱动铂基药物，特别是铂(II)基药物(例如DACHPt)缔合的主要动力是来自铂的正电荷与来自HA的羧基负电荷之间的相互作用。

因此，铂基药物，特别是铂(II)基药物、聚-L-精氨酸和透明质酸的分子通过静电相互作用，即通过非共价键彼此偶联。

有利地，所述方法简单且不需要有机溶剂，这与迄今为止文献

因此，由于其简便性，可以容易地在无菌环境中和在GMP(良好生产规范)条件下设想根据本发明的制备方法。

如实施例中所示，本发明定义的纳米颗粒能够预防和/或治疗癌症，诸如胰腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)、结直肠癌、肺癌、小细胞癌和非小细胞肺癌、卵巢癌、睾丸癌、乳腺癌、脑癌、肉瘤、淋巴瘤、头颈癌、转移性结直肠癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌、宫颈癌、白血病，诸如慢性粒细胞白血病、前列腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、骨癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、肠癌。

因此，根据本发明的纳米颗粒可用于制备药物，尤其是可用于预防和/或治疗癌症的药物，该癌症是诸如胰腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)、结直肠癌、肺癌、小细胞癌和非小细胞肺癌、卵巢癌、睾丸癌、乳腺癌、脑癌、肉瘤、淋巴瘤、头颈癌、转移性结直肠癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌、宫颈癌、白血病，例如慢性粒细胞白血病、前列腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、骨癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、肠癌。

因此，在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的纳米颗粒的药物。

这些药物在治疗上被采用，尤其是在如上所述的癌症的治疗和/或预防中。

根据另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含作为活性成分的根据本发明的纳米颗粒。更特别地，这些药物组合物包含有效剂量的根据本发明的纳米颗粒以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

考虑到纳米颗粒的小尺寸，可以静脉内(IV或i.v.)、皮下(SQ或s.q.)、皮内(IC或i.c.)、肌内(IM或i.m.)或腹膜内(IP或i.p.)施用，优选以水悬浮液的形式静脉内施用，因而与血管微循环相容。

因此，药物组合物可以肠胃外、静脉内或通过任何其他合适的途径施用。

在一个实施方案中，通过将组合物注射到靠近肿瘤位点的位置，来肠胃外施用药物组合物。如本文所用，“靠近肿瘤部点”是指将组合物局部靶向和递送至肿瘤部点，并且是指包括直接注射到肿瘤中以及在肿瘤的约1cm内(例如，1cm内、约5mm内、5mm内、约2mm内、2mm内等)注射。例如，可以通过单次注射或通过多次注射来施用药物组合物，诸如在通过将药物组合物注射到肿瘤以及肿瘤周围的情况下。

在另一个实施方案中，将药物组合物全身性施用于受试者，例如在将药物组合物静脉内施用，诸如通过将组合物注射到受试者的循环系统中的情况下。

在另一个示例性的实施方案中，例如将药物组合物经肠道内施用以冲洗胃肠道中的肿瘤。

根据药物形式和所需的施用方法，从本领域技术人员已知的常规赋形剂中选择药学上可接受的赋形剂。

在本发明的药物组合物中，根据本发明的纳米颗粒可以以单位施用形式，与常规药物赋形剂的混合物形式施用于动物和人类，以用于预防或治疗如上所述的癌症。

根据另一个有利的实施方案，根据本发明的纳米颗粒为冻干物的形式。因此，可以制备和储存包含所述纳米颗粒的即用型稳定的冻干形式。然后，一旦将冻干的粉末用纯化水重溶，则悬浮液的pH和渗透浓度与例如静脉注射完全相容。

关于与根据本发明的组合物相容的药物制剂的实例，可以特别提及：

-静脉注射液；

-静脉输液。

当纳米颗粒用作在水溶液中的分散体时，它们可以与赋形剂(诸如螯合剂或络合剂、抗氧化剂、pH调节剂和/或缓冲剂)联用。

除上述化合物外，根据本发明的药物组合物还可包含诸如防腐剂、湿润剂、增溶剂和着色剂的试剂。

但是，其还可包含其他活性剂，从治疗的角度来看，利用它们连同铂基药物，特别是铂(II)基药物的作用，可能是有益的。

关于可以与根据本发明的纳米颗粒组合的这些活性材料，可以特别提及其他抗癌或细胞生长抑制分子或大分子(例如不同于适用于本发明的铂基药物的铂盐、5-氟尿嘧啶、亚叶酸或其盐、蒽环类、有丝分裂纺锤体毒物、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂或金属蛋白酶抑制剂)、皮质类固醇类(例如地塞米松)或非皮质类固醇的抗炎药或具有免疫佐剂活性的其他分子(例如具有抗癌活性的抗体)、具有镇痛活性的分子，诸如右丙氧芬、曲马多、奈福潘、扑热息痛、可待因、对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药(NSAID)，包括阿司匹林、布洛芬、吲哚美辛、十一烷酸、奥昔芬衍生物、COX-2抑制剂(coxib)(例如

还可以提及抗氧化剂，诸如儿茶素、多酚、黄酮醇、黄酮、咖啡因、抗坏血酸、柠檬酸、酒石酸、卵磷脂或天然或合成生育酚。

纳米颗粒形式的铂基药物，特别是铂(II)基药物的制剂防止其他类型的活性剂之间的任何化学缩合相互作用，并因此允许它们在相同的盖仑制剂中进行调节。

在某些具体情况下，高剂量或低剂量是适当的；该剂量不脱离本发明的范围。根据常规实践，由每个医生根据施用方式以及所述患者的体重和反应来确定适合于每个患者的剂量。

例如，对个人施用的剂量(单剂量或多剂量)将根据多种因素而变化，包括药代动力学特性、患者状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、体型)、症状的程度、同时进行的治疗、治疗的频率和所需的效果。

为了预防和/或治疗癌症，根据本发明的纳米颗粒可用于单一治疗。无论患者或有需要的受试者是否对某些其他抗癌药显示抗药性，均有利地推荐进行单一治疗。

或者，根据本发明的纳米颗粒可以与至少一种具有相同或不同作用机理的如上文所定义的那些有效抗癌化合物联合使用。

因此，在其另一方面，根据本发明的纳米颗粒将是联合治疗的一部分，该治疗包括施用两种或更多种具有相关或不相关作用机理的抗癌化合物。根据本发明的纳米颗粒和至少一种其他抗癌活性成分(不同于本发明所定义的纳米颗粒)的这种联合可被包含在诸如先前公开的相同的盖仑制剂中或不同的盖仑制剂。

根据一个实施方案，当该联合被包含在相同的盖仑制剂中时，该联合优选是固定剂量联合，其中纳米颗粒和至少一种其他抗癌活性成分(与这些纳米颗粒不同)可以被一起配制在例如相同的粉末、小瓶中。

根据另一个实施方案，当该联合被包含在不同的盖仑制剂中时，这些活性成分中的每一个的施用可以是同时的或依次的。

在一些实施方案中，可以在另一种抗癌剂、抗癌疗法或手术之前、之后或与之联合施用根据本发明的纳米颗粒。

根据本发明的另一方面，本发明还提供治疗上述病状的方法，其包括向患者施用有效剂量的根据本发明的纳米颗粒，任选地与其他抗癌剂和/或以上定义的其他活性成分联合。

以下实施例解释本发明，但本发明不限于此。

具体实施方式

二氯(1,2-二氨基环己烷)铂(II)(DACHPt Cl

聚-L-精氨酸盐酸盐(分子量5kDa-15kDa)购自Alamanda

透明质酸(HA,LMWHA(Mw≈20kDa))购自Lifecore Biomedical(Chaska,USA)。

MTS细胞滴定板

Alexa Fluor 647羧酸三(三乙胺)盐(0.8mg/ml)(Invitrogen,Merelbeke,Belgium)由比利时根特大学的Pr Katrien Remaut提供。

用去离子水将纳米颗粒分散液以1/60稀释后，使用Malvern

使用配备Orius

将纳米颗粒固定在

使用间接方法测定包封率(EE)。将负载DACHPt的样品放入Amicon超滤离心管(截留30kDa，Merck Millipore,Cork,Ireland)中并离心(7000g,30min,20℃)。使用ICP-OES(电感耦合等离子体发射光谱法)(ICP-OES ICAP 7200duo Thermo Scientific)测定底部溶液的浓度。

为了冻干纳米系统，将HA和PArg溶于10％w/v甘露醇溶液中制备了空白纳米颗粒和负载DACHPt的纳米颗粒。选择10％(w/w)的甘露醇作为冷冻保护剂，因为它在保持纳米颗粒的理化特性方面表现出最佳性能(数据未显示)。使用配备有RZ6 Vacubrand pomp的ALPHA 1-4 LSC(CHRIST)冷冻干燥机(Fisher Scientific,Illkirch,France)进行冷冻干燥过程。将粉末重悬于水中后，评估其尺寸、多分散性、ζ电势和包封率。

荧光单粒子跟踪(fSPT)用于表征纳米颗粒在缓冲液和血清中的扩散。

在这方面，fSPT使用配备了MLC 400B激光(Agilent technologies,California,USA)的iXon Ultra EMCCD相机(Andor Technology,Belfast,UK)和扫频共聚焦(SFC)显微镜(Nikon eclipse Ti,Japan)以获取单个荧光标记的颗粒的影像。使用内部图像处理软件分析这些影像会导致扩散系数的分布，考虑到进行实验的生物流体的粘度，可以使用Stokes-Einstein方程将其转换为尺寸分布。SPT非常适合表征生物流体(如人血清、腹水、人血浆和血液)中纳米颗粒的尺寸。

与广泛使用的尺寸测定(Sizing)技术(例如动态光散射(DLS))相比，fSPT的主要优点是能够在未稀释的生物液体中进行尺寸测定测量，而不会影响这些液体中存在的蛋白质。

如下所述，对90％体积的生物流体中的F-PArg-HA纳米颗粒进行SPT测量。

首先，将纳米制剂在蒸馏水中稀释15倍。然后，将5μl制备的稀释液添加到45μl缓冲液或人血清(90％体积)中，并在37℃下温育1小时。然后，将7μl样品安装在固定密封胶垫(8孔，直径9mm，深0.12mm，Invitrogen,Merelbeke,Belgium)中间的显微镜载玻片上。载玻片用盖玻片(24×50mm)覆盖，以避免样品蒸发并完全自由扩散。随后，将载玻片放置在扫描场共聚焦显微镜上，并聚焦在显微镜载玻片底部上方约5μm处记录影像。使用驱动EMCCD相机的NIS Elements软件(Nikon,Japan)和配有CFI Plan Apo VC 100×NA1.4油浸物镜的扫场共聚焦显微镜(Nikon,Japan)，在室温(22.5℃)下录制视频。

使用内部开发的软件对视频进行分析。如前所述，从健康供体获得人血清。

使用以下描述的离子性凝胶化法制备空白纳米颗粒及由透明质酸(HA)和聚精氨酸(PArg)制成的负载DACHPt的纳米颗粒。

将DACHPtCl

通过用离子交换树脂(

通过改造Oyarzun-Ampuero等(Eur J Pharm Biopharm Off JArbeitsgemeinschaft Für Pharm Verfahrenstechnik eV.2011；79(1):54-57)已描述的方法，获得空白纳米颗粒，即未负载铂基药物的纳米颗粒。

在其使用前，将PArg-OH溶液和HA溶液用0.22μm的过滤器过滤，以确保无菌。

将500μl实施例2的PArg-OH溶液(2.5mg/ml)和500μl蒸馏水一起混合在一个小瓶中。然后，添加500μL HA溶液(0.5-12mg/ml的不同浓度范围)，并将该溶液在室温下磁力搅拌10分钟。

所有制剂均在10％w/v甘露醇存在下溶解聚合物而制备。

表1显示了筛选的[HA]/[PArg]质量比和相应的理化性能，即空白纳米颗粒制剂的尺寸、多分散指数(PDI)和ζ电势(ZP)，其中n至少等于3(即三次或更多)：

为获得负载DACHPt的纳米颗粒，将实施例1中获得的500μl的DACHPt溶液代替水添加至由实施例2中获得的PAG-OH溶液中，接着进行根据实施例3中描述的针对未负载的纳米颗粒的相同方法。更特别地，将获自实施例1的DACHPt溶液与获自实施例2的PAG-OH溶液混合，并在搅拌下放置10分钟。将HA添加到DACHPt-PArg-OH溶液中从而形成负载的纳米颗粒。

检查所有制备的制剂的pH和渗透浓度。

为了分离系统，将1mL纳米颗粒悬浮液转移到Eppendorf管中，并在20μL甘油床中离心(16000g,30min,25℃)。

丢弃上清液，并使用移液器和剧烈涡旋振荡将纳米颗粒重悬于水中。

为确定聚合物对纳米系统的贡献并定制用于掺入带正电荷的亲水性分子(如DACHPt)的纳米颗粒，筛选了几种HA/PArg质量比。所有制剂在甘露醇10％w/v存在下制备。

表2显示了筛选的[HA]/[PArg]质量比和相应的理化性能，即负载DACHPt的纳米颗粒制剂的尺寸、pH、多分散指数(PDI)和ζ电势(ZP)，其中n至少等于3(即三次或更多)，以及660μg DACHPt/mL制剂。

从这些结果可以看出，负载DACHPt的纳米颗粒比相应的空白系统小。

当考虑到摩尔比时，电荷比(正电荷比负电荷)从1.34上升到1.89，因为铂为制剂带来更多的正电荷，因此潜在地提升了系统的网状结构。

此外，对于所有测试的制剂，多分散指数在可接受的范围内(＜0.2)，这表明获得的种群是相当均匀的且单分散的。

此外，ζ电势为负，并且一旦比值超过4/2.5时，一个比值与另一个比值之间相差不大。

为了确认纳米颗粒的结构，进行了透射电子显微镜(TEM)分析以研究负载DACHPt的纳米颗粒的形态结构，其[HA]/[PArg]质量比为11.25/2.5。纳米颗粒用磷钨酸(1％w/v)染色作为对照试剂。获得的图像显示纳米载体是球形的，没有积聚并且很好地定界。观察到的尺寸和多分散性与动态光散射获得的结果一致。

Alexa Fluor 647羧酸被用作标记PArg-HA纳米制剂的方法。

在这方面，将80μl的PArg-OH溶液(2.5mg/ml)和120μl的Alexa Fluor 647羧酸三(三乙胺)盐(0.8mg/ml)(Invitrogen,Merelbeke,Belgium)通过磁力搅拌器混合在琥珀色的玻璃小瓶中。然后，将100μl的HA溶液(9mg/ml)添加至涡旋(vortex)中间，并将分散液在磁力搅拌下保持10分钟。

为分离纳米颗粒，将300μl的纳米载体分散液转移至含有20μl的甘油的Eppendorf管中，并在25℃下以16000g离心30分钟。随后，弃去上清液，并通过剧烈涡旋振荡将沉淀重悬在蒸馏水中。之后将荧光标记的纳米颗粒存储在4℃下。

将HA溶液(浓度范围为9-11.25mg/ml)与DACHPt溶液混合，以查看是否必需存在PArg才能形成纳米颗粒。

用DLS(动态光散射)未观察到纳米颗粒的形成，凸显了PArg和HA相互作用对于获得稳定的纳米系统的重要性。

冷冻干燥后，确定DACHPt对不同制剂(以不同的HA/PArg比制备)的包封率。

如材料和方法部分所述，使用ICP-OES(电感耦合等离子体发射光谱法)评估包封率。冷冻干燥之前的包封率是相关的，因为该制剂旨在并被设计为用于重构后使用。而且，冷冻干燥显著提高了EE。

表3显示了冷冻干燥后的重构溶液的包封率和渗透浓度取决于HA/PArg比，n至少等于3(即三次或更多)。

从这些结果可以看出，当[HA]/[Parg]重量比大于或等于2时，冷冻干燥后将DACHPt包封至纳米颗粒上特别有效。

在根据上述方法进行冷冻干燥后，追踪纳米颗粒在尺寸和ζ电势方面的稳定性。

如表4所示，所有测试的纳米颗粒的尺寸增加，但是这种变化与系统稳定性的降低无关。由于DACHPt对光敏感，所有样品均在棕色玻璃小瓶中、黑暗下于+4℃保存1-3个月。用橡胶盖和铝密封件密封小瓶。用DLS评估尺寸的稳定性，并在重构后至少保持4周稳定。此外，重构后观察到的渗透浓度与人血浆中的渗透浓度非常接近(290mmol/L)，因此适合静脉内(IV)注射(表3)。

表4显示了在[HA]/[PArg]的不同质量比下，冷冻干燥之前和之后，负载DACHPt的HA-PArg纳米颗粒的理化性能，其中n至少等于3(即三次或更多)。

事实证明，生物流体中蛋白质的存在会在DLS测量过程中散射光，从而干扰纳米颗粒特性的评估。考虑到DLS是研究生物流体中纳米颗粒的理化性能的一项具有挑战性的技术，因此SPT已被提议作为一种有效的方法来测量未稀释生物流体(例如人血清、血液和腹水)中的纳米系统的尺寸。

图1显示，将用Alexa Fluor 647标记的PArg-HA纳米载体在蒸馏水中稀释后，平均粒径为266nm。另外，在90％体积的人血清中于37℃温育1小时后，纳米颗粒显示窄的尺寸分布，其平均尺寸为275nm。

结果证明了在生物学条件下PArg-HA纳米系统的胶体稳定性对于生产性生物医学应用至关重要。

细胞系

将比萨大学L.Migliore教授提供的人肺泡癌A549细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、1mM谷氨酰胺和抗生素的Ham’s F12培养基中生长。将帕尔马大学P.Petronini教授提供的人结直肠腺癌HT-29细胞在补充有10％FBS、2mM谷氨酰胺和抗生素的DMEM High(葡萄糖4.5g/l)中生长。将细胞在37℃、5％CO

B6KPC3、A549和HT29细胞的活力

将3.5×10

通过以下公式评估细胞活力(CV)百分比：

CV(％)＝(吸光度(经处理的孔))/(吸光度(对照孔))×100

吸光度(对照孔)考虑了在无药物的培养基中温育的未经处理细胞的吸光度。

将B6KPC3(图2A)、HT-29(图2B)和A549细胞(图2C)与浓度递增(0-200μM)的奥沙利铂(

B6KPC3(见图2A)、HT-29(见图2B)和A549(见图2C)的细胞活力对奥沙利铂、DACHPt、空白和负载DACHPt的HAPArg-NP的剂量反应。结果表明，这些细胞对DACHPt的敏感性高于奥沙利铂(对于HT-29细胞，DACHPt的IC

表4BIS-在37℃温育24小时后，浓度(0-200μM)增加的奥沙利铂、DACHPt、空白和负载DACHPt的纳米颗粒对于B6KPC3、HT-29和A549细胞系的IC

表4 BIS

A.材料与方法

向健康小鼠(8周雌性C57BL/6)静脉注射200μl负载DACHPt的纳米颗粒和奥沙利铂溶液，剂量为35.9μg铂当量/小鼠。

在给药后的15、30分钟，1、1.5、3、5、8和12h的特定时间点，取200μl血液并与血浆分离。使用ICP/MS检测Pt含量。

使用WinNonlin 6.4、Connect 1.4在Phoenix(Pharsight-Certara

然后，该模型用于模拟多次施用方案。采用每周两次的方案模拟了3.5mg/kg的奥沙利铂溶液或负载DACHPt的纳米颗粒八个周期(Marmiroli P.et al.,Susceptibility ofdifferent mouse strains to oxaliplatin peripheral neurotoxicity:Phenotypicand genotypic insights,PLoS One)。每只小鼠的平均体重为25g且绝对剂量为87.5μg。疗程安排为：在第1-4-8-11-15-18-22和第25天静脉输注(2h)，或每周共2剂，持续4周。

B.结果

对于某些药物，静脉推注后的血浆浓度-时间曲线显示出清晰的两相模式。这种两相模式是铂衍生物广泛分布到不同组织中，然后从体内最终消除的结果。基于获得的分布(profile)(图3A和3B)，使用两室模型分析数据。对Pt浓度和衍生自负载DACHPt的纳米颗粒的DACHPt浓度进行了评估和比较，结果相当。最后，绘制了衍生自奥沙利铂溶液的Pt浓度和衍生自负载DACHPt的纳米颗粒的DACHPt浓度随时间变化的曲线。

从拟合曲线获得的参数显示在下面的表5中。

从获得的PK结果中可以看出，施用DACHPt纳米颗粒后，药物的AUC为24h*mg/L，比施用奥沙利铂溶液后的数值3.76hr*mg/L高出6倍。C

分布和消除半衰期表明，将药物包封在纳米颗粒中时，其分布(半衰期α)较慢(纳米颗粒半衰期α为0.370h VS奥沙利铂溶液为0.135h)。

但是，与奥沙利铂溶液相比，消除速率(半衰期β)更快(纳米颗粒半衰期β为6.49hVS奥沙利铂溶液为13.6h)。

结果表明，与纳米系统相比，对于奥沙利铂溶液，血浆中的Pt浓度在较低的水平开始并且最初下降得更快。与用DACHPt纳米颗粒获得的相比，奥沙利铂溶液的K12(从中央到外围区室的分布速率常数)更高(4.14vs 1.08h

中央和外围区室的分布体积(对于纳米颗粒为Vc 0.003及Vp 0.008L VS对于奥沙利铂溶液为Vc 0.014及Vp 0.150L)以及相对于奥沙利铂溶液，稳态(Vss)下的分布体积较低(Vss 0.011vs 0.165L)。血浆清除率相差六倍，纳米颗粒和奥沙利铂溶液的血浆清除率分别为0.002和0.010L/h。

为了研究药物治疗的维持情况，模拟了重复施用方案。重复施用方案旨在将副作用减至最小，同时保持血浆中以及作用部点的治疗药物浓度。剂量、循环频率和持续时间取决于患者的需求和总体状况(Cisterna A et al.Targeted nanoparticles forcolorectal cancer,Nanomedicine(Lond).2016)。为模拟体内多次施用方案，决定施用8个周期的3.5mg/kg的奥沙利铂溶液或负载DACHPt的纳米颗粒施用(Marmiroli P.et al.,Susceptibility of different mouse strains to oxaliplatin peripheralneurotoxicity:Phenotypic and genotypic insights,PLoS One)。

通常，影响平均稳态浓度的因素是剂量的施用率(在这种情况下，每周两次，持续4周)和血浆清除率。影响血浆浓度波动的因素是药物施用频率和清除半衰期。在我们的给药方案中，以相同的频率模拟了相似的Pt剂量。DACHPt纳米颗粒和奥沙利铂溶液具有不同的血浆清除率，其中纳米颗粒从血液中的药物清除率比奥沙利铂溶液低。

但是，两种化合物的清除半衰期是截然不同的，对于奥沙利铂溶液为13小时，而对于DACHPt纳米颗粒为6小时。

从模拟中可以看出，Pt没有积聚，并且所有标绘的化合物均迅速达到了稳态。通常，在重复施用方案中，当在之前的剂量被完全清除前施用药物时，会发生积聚。然后，体内的药物量将逐渐增加。

从我们的模拟结果可以看出，药物总是被清除而没有积聚。在纳米颗粒的情况下，在给药期间和给药后立即达到更高的暴露即是证明。然后，对于奥沙利铂溶液和DACHPt纳米颗粒，活性化合物的浓度均迅速下降。

但是，在DACHPt的情况下，至少要维持两天较高的暴露水平，而在奥沙利铂溶液的情况下，即使在开始时，血液中检测到的药物量也非常低。

这些结果与从区室分析获得的C

基于该模拟，可以明确地表明，施用DACHPt纳米颗粒可以确保长时间内更高的药物暴露而不会药物积聚。

在临床研究中，观察到在输注奥沙利铂2小时结束时，全身循环中仅存在15％的施用的铂。与文献相符，在奥沙利铂施用后人血浆超滤液中铂的PK典型地是两相的，其特征在于初始分布期短和末端消除期长。此外，铂与血浆蛋白(主要是血清白蛋白)和红细胞不可逆地结合。在全身循环中，红细胞不能作为铂的储库，并且血细胞中铂的积聚不被认为具有临床意义(M.A.Graham,G.F.Lockwood,D.Greensdale,S.Brieza,M.Bayssas,E.Gamelin,Clinical pharmacokinetics of oxaliplatin:a critical review,Clin.Cancer Res.6(2000)1205–1218.)。

总而言之，来自区室分析和模拟的多剂量方案的结果表明，HA-PArg纳米颗粒能够以有效方式缔合药物，由于DACHPt血浆蛋白结合而阻碍了药物的快速清除。C

通过对载药纳米系统的药代动力学评估文献的深入分析，我们发现在开发长循环纳米颗粒制剂方面已经做出了巨大的努力(Preparation and biological properties ofdichloro(1,2-diaminocyclohexane)platinum(II)(DACHPt)-loaded polymericmicelles,Journal of controlled release 2005)。但是，延长的循环还意味着纳米颗粒(包括在靶组织中)的缓慢的组织分布以及非常缓慢的药物释放。此外，在奥沙利铂的情况下，如果该药物如前所述被释放到血液中，它将与蛋白质或红细胞结合。因此，需要在长循环特性与分布和消除速率之间保持正确的平衡，以避免产生次级效应(Pharmacokineticsand Biodistribution of Nanoparticles,Molecular pharmaceutics 2008)。

与单独的药物相比，此处显示的结果与纳米颗粒的高稳定性(高药物暴露)、较慢的释放和清除有关。

为了研究来自PArg Cl的Cl离子的影响，获得了含有不同质量比或重量比的PArgOH和PArgCL的纳米颗粒。

在其使用前，将PArg-OH和PArg-Cl溶液以及HA溶液用0.22μm的过滤器过滤，以确保无菌。

为了获得负载DACHPt的纳米颗粒，将500μl从以上实施例1获得的DACHPt溶液添加到PAG-OH和PAG-Cl溶液的混合物中(根据下表6中所示的质量比进行混合)。

将HA添加到DACHPt-PArg-OH溶液中以形成负载的纳米颗粒。

如前所述计算包覆效率(即包封率或缔合效率)。在将冷冻干燥的纳米颗粒重悬于水中之后，评估包覆效率。

表6显示了PARg-OH/PARg-Cl的重量比对负载DACHPt的纳米颗粒的缔合效率的影响。

从这些结果可以看出，对于负载DACHPt的纳米颗粒，PARg-OH的量越大，包覆的效果越好。

为了获得负载顺铂的Ha-PArg纳米颗粒，进行了与获得DACHPt纳米颗粒相同的实验方案。将与DACHPt浓度相同的顺铂混合到Parg-OH溶液中，并遵循上述相同的实验方案。在甘露醇10％w/v的存在下制备纳米系统并冷冻干燥。重悬后，还根据先前的方案评估了包覆效率。

表7显示了在冷冻干燥之前和之后，顺铂与HA/Parg(无氯纳米系统)的缔合效率。

从这些结果得出，对于负载顺铂的纳米颗粒，冷冻干燥后的缔合效率比冷冻干燥前的更高。

根据此前公开的方法[Virgone-Carlotta A,Lemasson M,Mertani HC,et al.In-depth phenotypic characterization of multicellular tumor spheroids:Effects of5-Fluorouracil.PLOS ONE.2017；12(11):e0188100.doi:10.1371/journal.pone.0188100]制得了多细胞肿瘤球体(MCTS)。简言之，使用HTC-116细胞系在超低附着(ULA)96孔圆底板(Greiner bio-one)中形成MCTS，以避免细胞-基底附着。用胰蛋白酶消化细胞，并使用Malassez网格对细胞进行计数，以获得2,400个细胞/毫升。选择该细胞浓度(即每孔480个细胞，体积为200μL)，以获得每孔单个球状体，实验结束时球状体直径不超过500μm。在室温下将板在1200g下离心5分钟以开始形成球体。在整个实验过程中，将板在振荡下置于37℃和5％CO2的培养箱中。在接种后的第一天结束时，添加100μL培养基以确保适当的3D生长。接种两天后，用奥沙利铂水溶液、负载DACHPt的纳米颗粒(NP)以5、25和50μM的不同药物浓度处理MCTS。3天内重复处理。结果如图4-图6所示。

空白NP也用于评估系统可能产生的非特异性毒性。在处理后第0、1、2、3、4和7天监测MCTS。在每种浓度(5、25和50μM)下探测了8个球体(n＝8)。处理一天后，自发出现一圈分离细胞。将球体转移到新的孔板中，以机械方式去除这种无粘性的外周细胞层，并恢复药物和培养基。因此，在处理期间监测到的体积减少是由于活力的丧失以及内聚力的丧失引起的。

结果显示在表8-10中，这些结果说明与同一天的对照球体尺寸相比，分别用空白、负载DACHPt的纳米颗粒(NP)和奥沙利铂(OXP)在5、25和50μM下处理的多细胞HT116球体的尺寸减小(％)。

用倒置显微镜(Leica DMIRB)在奥沙利铂暴露后第0、1、2、3、4、7天的时间点，在96孔板内部以相位对比的方式拍摄MCTS的照片。我们使用Image J软件对每个球体使用sobel阈值进行了边缘检测。使用ImageJ“分析粒子”插件将生成的二进制图像拟合至长轴(LM)和短轴(Lm)的椭圆。由此计算出平均直径，D＝(LM+Lm)/2。然后，假设球体是球形V＝πD3/6，确定体积V。结果如图7所示。

为建立在更真实的体外培养系统中纳米颗粒对肿瘤活力的影响，在衍生自HCT-116细胞系的多细胞肿瘤球体(MCTS)上处理3天期间，测试了奥沙利铂溶液与负载DACHPt的NP的剂量反应。从

如图4-6所示，处理2天后，即使在5μM的药物剂量下，负载DACHPt的NP也能够减少球体的体积。在较高剂量(25和50μM)下，细胞毒性作用更为明显。在观察25和50μM药物浓度的7天后，与奥沙利铂溶液相比，使用DACHPt-NP获得的肿瘤体积减少更为明显(图5和6)，这表明与奥沙利铂溶液相比，包覆药物的活性更优越。空的纳米颗粒不会影响MCTS的尺寸。

拍摄经处理的MCTS的照片以显示球体的演变。在图7中，未经处理的球体与用最高浓度(50μM)的奥沙利铂和负载DACHPt的NP处理的MCTS进行比较。可以注意到，用DACHPt-NP处理会引起球体的塌陷，而在奥沙利铂的情况下，很少有细胞仍存在并形成聚集体。