一种在生物液体中检测人血清白蛋白的方法

摘要

一种使用具有聚集诱导发射(AIE)特性的小分子荧光化合物检测生物流体中的人血清白蛋白(HSA)的方法，包括将生物流体与荧光探针混合后用紫外光照射混合物，在检测到可观察到的荧光发射时确定是否存在人血清白蛋白。荧光探针与生物流体中的人血清白蛋白结合，探针与人血清白蛋白结合产生发射。体液可以是尿液。这些探针可以是水溶性的，并且可以包括四唑标记的AIEgens。本方法可使用医院中的常规荧光光谱仪或使用HSA检测装置来执行。HSA检测装置是便携式的，可供患者在家使用。

说明书

技术领域

本发明总体上涉及一系列具有聚集诱导发光(AIE)特征的荧光探针用于检测生物流体中人血清白蛋白的方法。

背景技术

慢性疾病的早期诊断和日常监测对疾病治疗十分重要。慢性肾病是一种常见的慢性疾病，在老年人或有糖尿病、高血压、泌尿道感染、急性胰腺炎等患者，以及正在服用对肾功能有损伤的药物的患者中十分常见。尿液是一种非侵入性的生物液体，是监测肾脏损害的理想分析物。

人血清白蛋白(HSA)是血浆中的主要蛋白质，除非肾脏功能异常和肾小球通透性异常升高，否则尿中通常不存在HSA。因此，尿液HSA浓度是与肾脏疾病密切相关的参数。例如，尿中HSA浓度在30mg/L至300mg/L的范围内，称为微量白蛋白尿，可能是早期肾脏疾病的信号。尿中HSA浓度超过300mg/L则为蛋白尿。

在医学检测中，磺基水杨酸测试和Heller测试已用于快速定性检测尿液中HSA的存在；比色法，例如Bradford和Lowry分析，也常用于蛋白质检测，但是这些测试通常缺乏准确性、敏感性或无法对蛋白质进行定量。如需定量检测，则会用到一些复杂，耗时且昂贵的方法，例如微芯片电泳，毛细管电泳，高效液相色谱，酶促免疫测定或比浊抑制免疫测定。

在商业市场中也有一些尿蛋白的检测产品，例如，干化学试纸可以用于定性检测尿蛋白的存在，并根据所用试纸和色标之间的颜色比较粗略估计尿蛋白的浓度，该方法虽然快速但缺乏准确性。胶体金免疫(层析)条也是一种可以半定量尿蛋白的方法，但此方法相对较贵且灵敏度不足。

胶体金免疫层析条也是一种广泛应用的半定量方法。只有当分析物金颗粒络合物在测试线上聚集到一定程度时，红色测试线才表明存在尿液HSA。金颗粒的标记是由于静电相互作用，但这不是一个足够稳定的物理吸附过程。此外，该方法相对昂贵且不够敏感。

荧光方法是一种更便宜，更灵敏，更简单的检测手段，如果荧光探针可以溶于水溶液，且仅在与HSA结合后才点亮，则可以在生物液体中灵敏地检测HSA的存在。另外，HSA浓度应与线性范围内的荧光强度成正比，因此，合适的水溶性点亮型荧光探针是定量检测HSA浓度十分理想的材料。

虽然已经报道了许多HSA特异性荧光探针，但是以前的荧光探针很少用于真实的尿液样本。例如，CN106153942、CN105572095A和CN1058355A中描述的现有探针基于扭曲分子内电荷转移(TICT)机制。“推拉”结构包括强电子供体(例如，二甲胺基)、可旋转桥(例如，双键)和强电子受体(例如，丙二腈基)在极性水溶液中通常不是很易于发射，但在相对非极性HSA腔中易于发射。因此，这些结构可以实现长波长发射。然而，它们大多是水不溶性的，并且需要有机共溶剂来溶解探针以进行检测。这对保持蛋白质构象是有害的。此外，由于这种探针对极性有反应，因此荧光可能会随着尿液样本pH值的变化而变化。

因此，非常需要一种克服这些挑战的在生物流体中检测HSA的方法。

发明内容

本发明涉及一种使用具有聚集诱导发光(AIE)特征的小分子荧光探针在生物流体中检测人血清白蛋白(HSA)的方法。该方法包括混合生物液体与荧光探针，用紫外线照射该混合物，以及当检测到荧光时确定人血清白蛋白的存在。当混合物中不存在HSA时，荧光探针在紫外灯下不能发出荧光，当混合物中有HSA存在时，荧光探针能与HSA结合并在紫外灯下发出荧光。生物液体可以是尿液。这类荧光探针包括具有四唑基的水溶性聚集诱导发光分子。这一方法需要用到常规的荧光光谱仪或可在家中使用的便携式紫外发射装置。

这类荧光探针具有的骨架结构举例如下：

其中X是O或S；

其中R、R′、R”或R”’至少有一个独立地从以下的基团中选择：

其中R,R′,R”,和R”’中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢、杂原子、烷基、非饱和烃基、含杂原子的烃基、环烃基、含杂原子的环烃基、芳香基、含杂原子的芳香基。

在一个实施例中，荧光探针具有以下的骨架结构：

其中至少有两个R和R′基团独立地从以下基团中选择：

其中R和R′中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢、杂原子、烷基、非饱和烃基、含杂原子的烃基、环烃基、含杂原子的环烃基、芳香基、含杂原子的芳香基。

在一个实施例中，荧光探针可以从以下结构中选取：

附图说明

图1描绘了(A)在pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)(包括[TPE-4TA]＝5μM)中，不同浓度的HSA的荧光光谱；λex＝370nm；(B)(A)中对应的荧光峰强度，其中I0＝[HSA]＝0mg/L的荧光强度；(C)pH 7.4PBS(包括[TPE-2TA-a]＝5μM)中HSA的荧光光谱，λex＝370nm；(D)(C)对应的荧光峰强度，其中I

图2描绘了(A)在pH梯度下TPE-4TA的荧光光谱，[TPE-4TA]＝5μM；(B)pH梯度下490nm处TPE-4TA及其对应的HSA-(TPE-4TA)复合物的荧光强度变化，其中[TPE-4TA]＝5μM，[HSA]＝0.5μM；(C)TPE-4TA探针对PBS中的生物分子的荧光响应，其中[TPE-4TA]＝5μM，[生物分子]＝1mg/mL。I0:空白探针溶液490nm处的强度；(D)尿液中常见成分对PBS中HSA-(TPE-4TA)复合物在490nm处荧光强度的影响，其中[TPE-4TA]＝5μM，[HSA]＝5μM，[尿液成分]＝10mg/mL。I0:空白TPE-4TA溶液的荧光强度。

图3描绘了(A)连续注射TPE-4TA滴定HSA时的ITC量热曲线。[TPE-4TA]＝0.07mM，[HSA]＝0.001mM,25℃；(B)连续滴定峰积分面积的拟合曲线(采用连续结合模型)；(C)测定TPE-4TA与HSA结合化学计量的Job plot，[TPE-4TA]+[HSA]在pH 7.4的PBS中保持2mM不变。

图4描述了用免疫比浊法预先测定尿蛋白浓度(X轴)的真实尿液与TPE-4TA测定的荧光强度(Y轴)的线性关系图。I0等于没有加入TPE-4TA探针的尿液在490nm处的荧光强度。

图5A描绘了根据本教学方法的HSA检测装置的俯视图。

图5B描绘了根据本教学方法的HSA检测装置的侧视图。

具体实施方式

提供以下定义是为了理解本发明和所附专利权利要求书。

注意，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用。

这里的“λ

这里的“聚集导致发光猝灭”或“ACQ”是指π-共轭荧光团的聚集导致荧光团的荧光强度显著降低的现象。

这里的“聚集诱导发光”或“AIE”在这里使用的是指化合物在非晶态或晶体(固体)聚集时表现出显著的光发射增强，而在稀溶液中表现出微弱或几乎没有发射的现象。

本文所称“发射强度”是指通常通过荧光光谱仪或荧光显微镜测量得到的荧光/磷光强度；本文所称“荧光团”、“荧光探针”，是指发射荧光的分子；“发光原”或“发光团”是指发光的分子；这里的AIEgen是指具有AIE特征的分子。

本文中的“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

本文使用的，“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1个至40个碳原子(即C1-40烷基)，(例如，1个至30个碳原子(即，C1-30烷基))。在一些实施方案中，烷基可具有1个至6个碳原子，并且可指“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)和丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷基、链烯基或炔基取代。

如本文所用，“烯基”指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。在各种实施例中，烯基可具有2到40个碳原子(即，C2-40烯基)，例如，2到20个碳原子(即，C2-20烯基)。在一些实施例中，可如本文所述取代烯基。烯基通常不被另一烯基、烷基或炔基取代。

如本文使用的，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，并且包括(例如)氮、氧、硅、硫、磷和硒。

如本文使用的，“芳基”是指芳族单环环烃体系或多环体系，即两个或更多个芳族烃环稠环(即，具有共同的键)在一起或至少一个芳组单环环烃与一个或多个环烷基和/或杂环烷基环稠合。芳基在其环体系中可具有6个至24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可包括多个稠环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8个至24个碳原子。芳基的任意的合适的环位置可与定义的化学结构共价连接。仅具有芳族碳环的芳基的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、戊炔基(五环)等基团。其中至少一个芳族碳环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的多环体系的实例包括(尤其为)环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-双环环烷基/芳环体系)、环己烷(即，四氢萘基，其为6,6-双环环烷基/芳环体系)、咪唑啉(即，苯并咪唑啉基，其为5,6-双环环杂烷基/芳环体系)和吡喃(即，色烯基，其为6,6-双环环杂烷基/芳环体系)。芳基的其他实例包括苯并二恶烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基等。在一些实施方案中，芳基可如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基可具有一个或多个卤素取代基，并且可被称为“卤代芳基”。在“卤代芳基”的定义内包括全卤芳基，即所有氢原子均被卤素原子(例如，-C

如本文所用，杂芳基系指含有选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)的至少一个环杂原子的芳香族单环体系或其中存在于环体系中的至少一个环是芳香族且含有至少一个环杂原子的多环体系。多环杂芳基包括具有两个或多个熔合在一起的杂芳基的基团，以及具有至少一个单环杂芳基环熔合到一个或多个芳香碳环、非芳香碳环和/或非芳香环杂烷基环的基团。杂芳基作为一个整体可以具有例如5到24个环原子并且包含1-5个环杂原子(即，5-20个成员的杂芳基)。杂芳基可以附着在任何杂原子或碳原子上，从而形成稳定的结构。通常，杂芳基环不含O-O、S-S或S-0键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如，吡啶N-氧化物噻吩S-氧化物、噻吩S、S-二氧化物)。杂芳基的实例包括例如如下所示的5-或6-元单环和5-6-双环系统：其中T是O、S、NH、N-烷基、N-元1、N-(芳烷基)(例如，N-苄基)、SiH2，SiH(烷基)，Si(烷基)2，SiH(芳烷基)，Si(芳烷基)2或Si(烷基)(芳烷基1)。杂芳基的实例包括例如如下所示的5-或6-元单环和5-6-双环系统：其中T是O、S、NH、N-烷基、N-元1、N-(芳烷基)(例如，N-苄基)、SiH

如本文所使用的，“施体”材料指具有空穴作为主要电流或电荷载流子的有机材料，例如有机纳米粒子材料。

如本文所用，“受体”材料指具有电子作为主要电流或电荷载流子的有机材料，例如有机纳米粒子材料。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与当前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

如果提供了数值的范围，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，则应理解，除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应为下限单位的十分之一，在所述范围的上限和下限与所述范围内的任何其他所述或中间值之间，包含在所述发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且这些实施例也包括在所描述的发明中，受制于所述范围中的任何具体排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，所述标的物中还包括不包括这些包括的限制的一个或两个的范围。

在整个应用中，各种实施例的描述使用“包含”语言。然而，本领域技术人员将理解，在一些特定实例中，可替换地使用“基本上由”或“由”组成的语言来描述实施例。

为了更好地理解本教导并且不以任何方式限制教导的范围，除非另有指示，否则表示说明书和权利要求书中使用的量、百分比或比例的所有数字以及其他数值应被理解为在所有情况下被术语“关于”修改。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求书中所述的数值参数是近似值，其可根据寻求获得的期望特性而变化。至少，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量和应用普通舍入技术来解释。

本发明涉及一种使用具有聚集诱导发光(AIE)特征的小分子荧光探针在生物流体中检测人血清白蛋白(HSA)的方法。具有聚集诱导发光(AIE)特性的荧光化合物也称为“AIEgen”。该方法包括混合生物液体与荧光探针，用紫外线照射该混合物，以及当检测到荧光时确定HSA的存在。该方法可以使用任何合适的荧光光谱仪器或紫外发射装置例如便携式紫外灯。荧光探针在生物液中与HSA结合，该复合物可以在紫外灯下发出荧光。生物液体可以是尿液。所述生物液与所述荧光探针溶液的体积比可从约1:6至约1:12范围。荧光探针可以包括四唑标记的AIEgens。这些荧光探针是水溶性的。

本方法可使用通常存在于医院中的常规荧光光谱仪或使用本文所述的HSA检测装置来执行。HSA检测装置是便携式的，可供患者在家使用。

这类荧光探针具有的骨架结构举例如下：

其中X是O或S；

其中R,R′,R”或R”’至少有一个独立地从以下的基团中选择：

其中R,R′,R”,和R”’中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢，杂原子，烷基，非饱和烃基，含杂原子的烃基，环烃基，含杂原子的环烃基，芳香基，含杂原子的芳香基。

在一实例中，荧光探针具有以下的骨架结构：

其中至少有两个R和R′基团独立地从以下基团中选择：

其中R和R′中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢，杂原子，烷基，非饱和烃基，含杂原子的烃基，环烃基，含杂原子的环烃基，芳香基，含杂原子的芳香基。

在一实例中，荧光探针具有以下的骨架结构：

例举合成四种荧光探针TPE-4TA,TPE,2TA-a,TPE-2TA-b,TPE,2TA-c的反应过程如下：

过程1

过程2

过程3

过程4

根据实施例，将二苯酮经Mcmurray偶联合成的四苯乙烯(TPE)中加入溴化液，得到四溴四苯乙烯。二溴化TPE衍生物可以由二苯基甲烷/1-苄基-4-溴苯和相应的溴化联苯酮合成。这些TPE衍生物上的-Br可以进一步被-CN取代，-CN再与叠氮离子(N

本文描述的荧光探针具有聚集诱导发光(AIE)特性。荧光探针是水溶性的。在没有HSA的尿液样本中，荧光探针在紫外灯下不发荧光，原因是它们灵活的分子内运动会导致显著的非辐射衰减。在含有HSA的尿液样本中，荧光探针与HSA结合，导致其分子内运动受限，并固定成一个相对刚性的构型，非辐射跃迁大大减弱，因此一旦与HSA结合，这些化合物就能在紫外灯下发出强烈的荧光。

用于HSA检测的荧光探针在pH一般为中性的PBS缓冲液中几乎不发射(例如pH＝7.4)。然而，在PBS缓冲溶液中加入HSA后，荧光探针与HSA结合形成的HSA-AIEgen复合物在370nm的光照下发出强烈的荧光。图1A、1C、1E、1G分别为TPE-4TA、TPE-2TA-a、TPE-2TA-b、TPE-2TA-c的磷酸盐缓冲盐水中不同浓度的HSA的荧光检测光谱，λex＝370nm。图1B、1D、1F、1H分别为图1A、1C、1E、1G对应的荧光峰强度，其中I

用等温滴定量热法(ITC)测定了HSA-(TPE-4TA)复合物的解离常数在微摩尔水平。图3A为连续注入TPE-4TA滴定HSA时的ITC曲线，其中[TPE-4TA]＝0.07mM，[HSA]＝0.001mM,温度为25°。图3B为连续滴定峰积分面积的拟合曲线(采用连续结合模型)TPE-4TA具有较高的结合亲和力。图3C为测定TPE-4TA与HSA结合化学计量的Jobplot，其中[TPE-4TA]+[HSA]在pH 7.4的PBS中均保持在2mM不变。

图2A为TPE-4TA在pH梯度下的荧光。如图所示，当在pH>5的PBS中，探针不能发出荧光，其中[TPE-4TA]＝5μM。图2B为pH梯度下490nm处TPE-4TA(底线)和相应的HSA-(TPE-4TA)复合物(顶线)的荧光强度变化，其中[TPE-4TA]＝5μM，[HSA]＝0.5μM。

生物分子的存在一般不会干扰荧光探针的荧光强度。图2C为TPE-4TA探针对PBS中生物分子的荧光响应，其中[TPE-4TA]＝5μM，[生物分子]＝1mg/mL。I

该荧光探针具有灵敏度高、结合亲和度高、检出限低、量子产率高等特点，可有效应用于真实尿液样品中。

一种测定生物流体或生物流体测试样本中人血清白蛋白浓度的方法，可包括如上所述检测生物液体测试样本中人类血清白蛋白的存在；测量检测到的发射的荧光强度；以及基于生物液体参考样本中的已知人血清白蛋白浓度与当荧光探针添加到生物液体参考样本中时产生的荧光强度之间的预定相关性来确定生物液体中的人类血清白蛋白浓度。生物流体测试样本可以是来自一个个体的人类尿液，生物流体参考样本可以是来自另一个个体的人类尿液。

可通过从人群获得多个人类尿液参考样品、使用常规方法(例如，浊度抑制免疫测定法)确定每个人类尿液参考样品中的人类血清白蛋白浓度来确定预定相关性。在确定每个人尿液参考样品的人血清白蛋白浓度后，可通过将每个尿液参考样品分离为第一部分和第二部分，将荧光探针添加到每个参考样品的第一部分以提供多个目标样品来确定相关性，将磷酸盐缓冲液添加到每个参考样品的第二部分，以提供多个空白样品，在最大波长发射下获得每个参考尿样的目标样品和空白样品的荧光强度；从每个目标尿样参考样品的荧光强度减去空白样品的荧光强度，以提供每个参考人尿样的参考荧光强度；绘制每个人尿参考样品的已知人血清白蛋白浓度与相应参考强度的线性曲线，以提供校准曲线。校准曲线可以提供预定的相关性。最大波长发射可以是AIEgen-HSA络合物的发射峰。TPE-4TA的发射峰为490nm。

通过获得目标尿样的荧光强度，参考与已知HSA浓度相关联的参考荧光强度的校准曲线，在校准曲线上绘制目标尿样的荧光强度，可以获得来自患者的目标尿样的未知HSA浓度，并用拟合线图计算目标样品中未知的HSA浓度。参考荧光强度可以包括具有已知HSA浓度的参考人类尿液样品的荧光强度，或者仅仅是具有不同已知HSA浓度的制备的HSA溶液的荧光强度。制备的HSA溶液可通过将HSA溶解在磷酸盐缓冲盐水中以提供HSA储备溶液和制备HSA储备溶液的系列稀释液以提供具有不同已知HSA浓度的制备的HSA溶液来制备。根据一个实施例，通过测量样本的荧光强度，在校准曲线上找到匹配的参考荧光强度，然后识别与匹配的参考荧光强度相对应的HSA浓度，可以获得来自患者的新尿液样本的未知HSA浓度在校准曲线上。匹配的参考荧光强度可以与测量的荧光强度相同或近似相同。这种测定尿液样本中HSA浓度的方法比其他仪器分析更简单、更快、更具成本效益。

目前的方法可以使用传统的荧光光谱仪，或使用HSA检测设备。HSA检测装置可以是以下所描述的免疫(色谱)条。当测试样品在其中横向流动时，该条对其进行分析，从而提供一种横向流动测试。HSA检测装置包含一种或多种具有聚集诱导发射特性的荧光化合物作为共轭染料。HSA检测装置可以是便携式的，并且可以被患者在家中用来测定患者尿液中的人血清白蛋白水平。

图5A-5B显示了免疫(色谱)条的示意图。图中指定为10的HSA检测装置，包括由顶壁、底壁和连接顶壁和底壁的多个侧壁所组成的中空壳体15。样品入口窗口20在空心外壳的顶壁内。第一检测窗口25a和第二检测窗口25b在顶壁内，并与样品入口窗口20间隔。样品垫35设置在样品入口窗口20下方的壳体15内。共轭衬垫40设置在壳体15内，与样品衬垫35相邻。共轭衬垫40包括至少一种具有AIE的HSA荧光探针。孵化垫45设置在壳体15内，与共轭垫40相邻，位于样品垫35对面的一侧。第一检测垫50设置在壳体15内，与孵化垫45相邻，并位于第一检测窗口25a下方。第一检测垫50包括包括白蛋白特异性抗体的检测线30。第二检测垫55设置在壳体15内，与第一检测垫50间隔，且位于第二检测窗口25b以下。第二检测垫55包括含有人血清白蛋白的控制线33。可在第二检测垫55的一侧与第二检测垫55相邻，该吸附性垫60与第二检测垫55相对，该吸附性垫55面向第一检测垫50吸收样品残留。所述吸收垫60可以与所述第二检测垫55相邻，不与所述第一检测垫50相邻。样品垫、共轭垫、孵育垫以及第一和第二检测垫可以由纤维素膜或其他合适的材料形成。例如，纤维素膜可以是醋酸纤维素膜或玻璃纤维素膜。吸水垫可由任何合适的吸水材料制成，如滤纸。可将便携式荧光阅读器(未显示)或紫外光装置耦合到壳体上。对于定性或半定量检测，一个紫外灯照射测试线就足够了，因为产生的发射可以用肉眼看到。若要定量检测则同时需要紫外光源和检测系统(例如智能手机的相机)。

在使用中，尿样可以通过样品入口窗口20分配到样品垫35上。尿液从样品垫35流向共轭垫40。沉积在共轭垫40上的AIEgen可溶于尿液，并与尿液中的HSA结合。然后，包括AIEgen在内的尿液通过孵化垫45流向第一个检测垫50。一旦HSA被测试线30上的抗体捕获，测试线30就会发出荧光。荧光强度可以指示样品中蛋白质的浓度。HSA的浓度应该与荧光强度成正比。对照线33也应该是荧光的，以确认其有效性。

在共轭衬垫40上的荧光探针的骨架结构可以从以下基团中选择：

其中X是O或S；

其中R,R′,R”或R”’至少有一个独立地从以下的基团中选择：

其中R,R′,R”,和R”’中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢，杂原子，烷基，非饱和烃基，含杂原子的烃基，环烃基，含杂原子的环烃基，芳香基，含杂原子的芳香基。

在一实例中，荧光探针具有以下的骨架结构：

其中至少有两个R和R′基团独立地从以下基团中选择：

其中R和R′中除了以上基团外的其他基团从以下基团中选择：氢，杂原子，烷基，非饱和烃基，含杂原子的烃基，环烃基，含杂原子的环烃基，芳香基，含杂原子的芳香基。

在实例中，荧光探针具有以下的骨架结构：

以下例子可以进行说明。

为了检验使用荧光探针定量尿液白蛋白的可行性，我们使用了真实的尿液样本。我们从南方医科大学的病人身上采集了多份尿样，用数字作为编号以保证样品的机密性。样本取材于不同的个体，如不同性别、年龄、疾病状态等，采集时间也不同，如早上、晚上等。用免疫比浊法测定这些样品的蛋白浓度，测定范围为10-2000mg/L，覆盖健康(<30mg/L)、微量白蛋白尿(30-300mg/L)和白蛋白尿(>300mg/L)条件。

样本中加入AIEgen得到尿液-AIEgen混合物。AIEgen在溶液中的浓度为50μM。尿液/AIEgen混合物的体积比为1:6～1:12。激发后，利用荧光光谱仪记录尿液-AIEgen混合物(I)最大发射波长处的荧光强度和尿液-PBS空白(I

本发明可能有其他修改和变型，这些修改和变型不应该被视为背离本发明的主旨和范围，并且这些修改和变型都在以下权利要求书要求的范围内。