公开/公告号CN112791178A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-05-14
原文格式PDF
申请/专利权人 深圳市图微安创科技开发有限公司;
申请/专利号CN202110094194.6
申请日2021-01-22
分类号A61K38/16(20060101);A61P13/12(20060101);
代理机构11006 北京律诚同业知识产权代理有限公司;
代理人高龙鑫;张燕华
地址 518000 广东省深圳市坪山区坑梓街道秀新社区聚龙山A路深城投创意工厂生命科学园厂房B3401
入库时间 2023-06-19 11:00:24
技术领域
本发明涉及一种GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物，特别涉及一种GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物在预防或治疗肾纤维化中的应用，尤其涉及一种GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物在通过调节PERK介导的内质网应激途径改善肾纤维化中的应用。
背景技术
慢性肾脏疾病(CKD)仍然是医疗保健系统的主要负担，全球患病率为9.1％，并与心血管疾病的发病率和死亡率增加相关(Collaboration GBDCKD.Global,regional,andnational burden of chronic kidney disease,1990-2017:a systematic analysis forthe Global Burden of Disease Study 2017.Lancet.2020；395(10225):709-33.Said S,Hernandez GT.The link between chronic kidney disease and cardiovasculardisease.J Nephropathol.2014；3(3):99-104)。CKD可能发展为需要透析或肾脏替代治疗的终末期肾脏疾病(ESRD)。据报道，2017年全球有120万人死于CKD(CollaborationGBDCKD.Global,regional,and national burden of chronic kidney disease,1990-2017:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study2017.Lancet.2020；395(10225):709-33.)。糖尿病，高血压，肥胖，感染性感染和自身免疫性疾病等许多因素促成了CKD的发展(Hall ME,do Carmo JM,da Silva AA,Juncos LA,Wang Z,Hall JE.Obesity,hypertension,and chronic kidney disease.Int J NephrolRenovasc Dis.2014；7:75-88)。不管最初的病因是什么，肾纤维化都是CKD的最终组织学标志，其特征是间质中过多的病理性细胞外基质蛋白产生和沉积，从而导致结构损伤，肾功能受损，最终导致ESRD(Zeisberg M,Neilson EG.Mechanisms of tubulointerstitialfibrosis.J Am Soc Nephrol.2010；21(11):1819-34)。尽管CKD的研究取得了进展，但很少有FDA批准的药物可用于治疗肾纤维化，并且在肾纤维化疗法的研究中仍然面临挑战。
与伤口愈合反应相似，肾纤维化也是一个动态而复杂的过程。肾间质纤维化的关键事件包括肾小管周围炎性细胞浸润，这些炎性细胞可分泌多种促纤维化刺激因子包括TGF-β和IL-4，肾小管细胞凋亡，上皮-间质转化(EMT)以及肌成纤维细胞的活化和扩增(LiuY.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis.J AmSoc Nephrol.2010；21(2):212-22.)。
内质网(ER)对于许多细胞功能至关重要，包括蛋白质合成，折叠，修饰和运输。这些功能受到细胞外或细胞间刺激的破坏会影响蛋白质的正确折叠并导致内质网应激。ER由三个ER应力传感器控制，包括PERK，IRE1α和ATF-6。PERK途径被自身磷酸化激活，然后磷酸化eIF2α并促进包括C/EBP同源蛋白(CHOP)在内的促凋亡蛋白的表达。目前，内质网应激通路是否在GLP-1R/GCGR激动剂的肾脏保护作用中起作用尚不清楚。
现有技术中治疗肾纤维化的药物鲜有成效，实有必要提供一种有效治疗肾纤维化的新药物。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物的新生物活性及其在治疗或预防肾纤维化中的应用，该GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物通过调节PERK介导的内质网应激途径从而改善肾纤维化。
本发明人经过大量的实验研究，证明该类GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物能够明显改善单侧输尿管阻塞(UUO)诱导的肾纤维化。证明该类GLP-1R/GCGR双靶点激动剂多肽衍生物对肾纤维化具有显著的治疗作用。
本发明的一个目的在于提供该GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物新的适应症治疗用途。该GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物有望作为新一代对肾纤维化的预防或治疗药物。
本发明的GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物具有以下氨基酸序列表示的母体肽：
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-COR
其中，R
Xaa2＝Aib或D-Ser；
Xaa10＝Lys或Tyr；
Xaa13＝Lys或Tyr；
Xaa16＝Ser，Aib，Lys或Glu；
Xaa17＝Lys或Arg；
Xaa18＝Arg或Ala；
Xaa20＝His，Gln或Lys；
Xaa21＝Asp或Glu；
Xaa23＝Ile，Val；
Xaa24＝Glu或Gln；
Xaa27＝Met，Leu，Nle；
Xaa28＝Asn，Asp，Arg，Ser或不存在；
Xaa29＝Gly，Thr或不存在；
Xaa30＝Gly或不存在；
Xaa31＝Gly或不存在；
Xaa32＝Pro或不存在；
Xaa33＝Ser，Val或不存在；
Xaa34＝Ser或不存在；
Xaa35＝Gly或不存在；
Xaa36＝Ala或不存在；
Xaa37＝Pro或不存在；
Xaa38＝Pro或不存在；
Xaa39＝Pro或不存在；
Xaa40＝Ser或不存在；
所述Xaa10，第12位，Xaa16，Xaa17或Xaa20中至少一个为Lys，所述至少一个Lys的侧链与亲脂性的取代基相连接，所述连接方式为所述亲脂性的取代基以其羧基与桥接基团的氨基形成酰胺键，所述桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的Lys的N-末端残基形成酰胺键以连接到所述母体肽上，所述桥接基团为Glu，Asp和/或(PEG)
本发明中涉及的化合物基于理论分子内桥可以稳定分子的螺旋结构，从而提高了针对GLP-1R或GCGR的效力和/或选择性。本发明化合物在序列中携带一个或多个分子内桥。这样的桥是由两个氨基酸残基的侧链之间形成，所述两个氨基酸残基通常被线性序列中的三个氨基酸所分隔。例如所述桥可在残基对12与16、16与20、17与21或者20与24侧链之间形成。两个侧链可通过离子相互作用或通过共价键彼此相连接。因此，这些残基对可包含带相反电荷的侧链，从而通过离子相互作用形成盐桥。例如，一个残基可以是Glu或Asp，而另一残基可以是Lys或Arg，Lys与Glu配对以及Lys与Asp配对分别还能够反应形成内酰胺环。
当所述氨基酸序列的第10、12、16、17或20位为Lys时，所述Lys侧链与所述亲脂性取代基及所述桥接基团连接为下述结构之一：
所述母体肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQID NO：47和SEQ ID NO：48母体肽的氨基酸序列。
本发明的另一目的在于提供含有本发明的GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物的药物组合物，以所述GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物作为活性成分添加药学上可接受的载体和/或辅料制成药物组合物。
本发明的GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物对于肾纤维化具有改善和治疗作用。本发明的GLP-1R/GCGR双激动剂多肽衍生物可用于直接或间接治疗由肾纤维化所引起的或者以其为特征的病症。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。
适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂、以及可用于注射的无菌溶液。
含有本发明多肽的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配制，液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。
本发明多肽在药物组合物中的用量可以在较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素如疾病的种类、病情严重程度、患者体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。
本发明的优点在于：
1)本发明的GLP-1R/GCGR双激动剂多肽能在体内和体外抑制肾小管细胞上皮-间质转化，能改善线粒体形态，同时能够多肽化合物抑制TGF-β诱导的EMT过程中PERK介导的内质网应激通路，从而治疗或改善肾脏纤维化以及肾纤维化导致的炎症。
2)具有良好的生物学活性；
3)在药物的药代实验中显示稳定性，稳定性好，易于放大生产，成本低；
4)与小分子化合物相比具有更低毒性，安全窗口更大，用量更小。
在具体的实施方案中，涉及下述GLP-1R/GCGR双激动剂多肽，其具有以下氨基酸序列：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG
H-(d-S)-QGTFTSDYS-K(PEG
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG
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H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-Aib-K(PEG
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His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG
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H-(d-S)-QGTFTSD-K(PEG
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG
H-(d-S)-QGTFTSD-K(PEG
本发明的母体肽的氨基酸序列中，与所述亲脂性的取代基连接的Xaa10，第12位，Xaa16，Xaa17或Xaa20的Lys被HomoLys、Orn、Dap或Dab代替。
本发明中所用缩写具体含义如下：
Boc为叔丁氧羰基，Fmoc为芴甲氧羰基，t-Bu为叔丁基，ivDDe为1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基-丁基的脱除与亲脂取代基，resin为树脂，TFA为三氟乙酸，EDT为1,2-乙二硫醇，Phenol为苯酚，FBS为胎牛血清，BSA为牛血清白蛋白，HPLC为高效液相，GLP-1R为胰高血糖素样肽1受体，GCGR为胰高血糖素受体，GLP-1为胰高血糖素样肽，mPEG为单甲氧基聚乙烯二醇，OXM为胃泌酸调节素，His为组氨酸，Ser为丝氨酸，D-Ser为D-型丝氨酸，Gln为谷氨酰胺，Gly为甘氨酸，Glu为谷氨酸，Ala为丙氨酸，Thr为苏氨酸，Lys为赖氨酸，Arg为精氨酸，Tyr为酪氨酸，Asp为天冬氨酸，Trp为色氨酸，Phe为苯丙氨酸，Ile为异亮氨酸，Leu为亮氨酸，Cys为半胱氨酸，Pro为脯氨酸，Val为缬氨酸，Met为蛋氨酸，Asn为天冬酰胺，HomoLys为高赖氨酸，Orn为鸟氨酸，Dap为二氨基庚二酸，Dab为2,4-二氨基丁酸，Nle为正亮氨酸，Aib为2-氨基异丁酸，AEEA为[2-[2-(氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1：为本发明化合物中桥接基团与肽链的连接示意图。
图2：为小鼠肾脏组织使用H&E染色后的切片图。
图3：为小鼠肾脏组织使用Masson染色后的切片图。
图4：为小鼠肾脏组织CD68染色后的切片图。
图5：为小鼠肾脏组织中I型胶原α1链的基因表达情况图。
图6：为体内EMT过程中小鼠肾脏组织经E-cad和α-SMA染色的IHC图像。
图7：为图6中小鼠肾脏组织的E-cad细胞百分比图。
图8：为图6中小鼠肾脏组织的α-SMA细胞百分比图。
图9：为体外EMT过程中小鼠肾小管上皮细胞经α-SMA染色的IF图像。
图10：为图9中小鼠肾小管上皮细胞的α-SMA细胞百分比图。
图11：为图9中小鼠肾小管上皮细胞中I型胶原α1链的基因表达情况图。
图12：为小鼠肾小管细胞的RNAseq分析图。
图13：为图12中差异表达基因的KEGG途径富集分析图。
图14：为小鼠肾小管细胞PERK基因表达情况。
图15：为小鼠肾小管细胞PERK和p-PERK以及CHOP的蛋白质印迹分析。
图16：为体外EMT过程中PERK介导的内质网应激PERK和p-eIF2αIHC染色切片图。
图17：为图16中PERK阳性细胞的百分比图。
图18：为图16中p-eIF2α阳性细胞的百分比图。
图19：为小鼠肾小管细胞中线粒体染色图。
图20：为小鼠肾小管细胞中线粒体强度柱状图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市购获得。
实施例1、双激动剂多肽的合成
材料:
所有的氨基酸均购自NovaBiochem公司。如果没有特别说明，其他所有试剂均为分析纯，购自Sigma公司。采用Protein Technologies PRELUDE 6通道多肽合成仪。Phenomenex Luna C18制备柱(46mm x 250mm)用来纯化多肽。高效液相色谱仪为Waters公司产品。质谱分析采用Agilent质谱仪进行测定。
以多肽化合物6为例说明本发明多肽化合物的合成方法：
结构序列：
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG
a)主肽链组装：
按照Fmoc/t-Bu策略在CS336X多肽合成仪(美国CS Bio公司)上合成0.25mmol规模的如下多肽：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(ivDde)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide树脂
(1)第一步：将0.75克Rink amide MBHA-LL树脂(Novabiochem，上样0.34mmol/g)在二氯甲烷(DCM)中溶胀一个小时，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗涤树脂3次；
(2)第二步：以Rink amide树脂为载体，以偶联剂由6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)，有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIEPA)两者按物质的量比1:1，以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接
Fmoc-Ser(t-Bu)-OH，Fmoc-Pro-OH(3x)，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(t-Bu)-OH(2x)，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH(2x)，Fmoc-Thr(t-Bu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2x)，Fmoc-Lys(ivDde)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(t-Bu)-OH，Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(t-Bu)-OH，Fmoc-Thr(t-Bu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Thr(t-Bu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-D-Ser(t-Bu)-OH，Boc-His(Boc)-OH得到：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(ivDde)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-B u)-rink amide树脂。此后依次用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗涤树脂各3次。
在反应中，1)第一个氨基酸Fmoc-Ser(t-Bu)-OH的用量与树脂用量的物质的量比为1:1～6:1；2)接下来的每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸，6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)，有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIEPA)的用量均过量2～8倍，反应时间为1～5个小时。
b)1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基-丁基(ivDde)的脱除与亲脂取代基的引入：
用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)＝1:1(体积比)的溶液中将树脂洗涤两次，加入新鲜制备的3.0％的肼水合物N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，将该反应混合物在室温下振荡10～30分钟进行阱处理步骤，然后过滤。将肼处理步骤重复5次得到：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide树脂。此后依次用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗涤树脂各3次。
加入FmocNH-PEG
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc-PEG
20％的哌啶(Piperidine)/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除Fmoc基团(30分钟，重复脱除两次)，加入Fmoc-PEG
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc-PEG
20％的哌啶(Piperidine)/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除Fmoc基团(30分钟，重复脱除两次)，然后按照常规条件依次偶联Fmoc-γGlu-OtBu，加入十六酸(棕榈酸)得到：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(PEG
c)多肽全保护的脱除：
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys(PEG
His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG
d)多肽化合物的精制纯化：
将所得粗品化合物溶于乙腈(ACN)/H
基于以上合成步骤，合成本发明的如下多肽化合物(表1)：
表1、本发明实施例中所合成的多肽化合物结构：
实施例2、GLP-1R/GCGR双激动剂多肽对UUO诱导的肾纤维化的改善和治疗作用
本发明的小鼠肾纤维化模型采用单侧输尿管阻塞(UUO)法建立，本实施例随机选用多肽化合物1、3、11、21、28、40、41进行试验。使用成年B6小鼠进行单侧输尿管阻塞(UUO)的小鼠模型，假手术小鼠作为对照组。手术后每天对小鼠给药，并在第14天处死。收集组织样品用于免疫组织化学和肾脏mRNA基因表达分析，用TGF-β刺激的小鼠肾小管细胞(mTECs)被用作纤维化的体外模型。具体操作方法如下：
处理小鼠：
选用80只6-8周龄的B6(H2b)雄性小鼠，这些小鼠均北京维通利华试验动物公司。将小鼠分为10组，每组8只，其中9组进行单侧输尿管阻塞(UUO)手术处理建立小鼠肾纤维化模型，1组作为对照组进行假手术处理。对于进行UUO手术处理的小鼠，其处理方法为：使用手术剪刀将小鼠腹部皮肤切开，使用棉签将小肠移至小鼠的右侧，使用8-0缝合线结扎左输尿管，关闭腹部切口。对于进行假手术处理的小鼠，其处理方法为：打开小鼠腹部，将小肠移出并放回原处，闭合腹部。
术后，将10组小鼠分别做以下处理：
1)假手术对照组，不做任何处理，n＝8；
2)生理盐水组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射生理盐水200uL，n＝8；
3)索马鲁肽组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射索马鲁肽(80ug/kg)，n＝8；
4)多肽化合物1组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射多肽化合物1(80ug/kg)，n＝8；
5)多肽化合物3组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射多肽化合物3(80ug/kg)，n＝8；
6)多肽化合物11组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射多肽化合物11(80ug/kg)，n＝8；
7)多肽化合物21组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射多肽化合物21(80ug/kg)，n＝8；
8)多肽化合物28组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射多肽化合物28(80ug/kg)，n＝8；
9)多肽化合物40组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射多肽化合物40(80ug/kg)，n＝8；
10)多肽化合物41组，经UUO处理的小鼠每天经腹膜内注射多肽化合物41(80ug/kg)，n＝8。
在第14天处死小鼠，收集小鼠肾脏组织并进行切片，切片厚度为4um，使用苏木精-伊红(H&E)和马松(Masson)进行染色，其结果如图2和图3所示。
使用小鼠单侧输尿管阻塞(UUO)模型确定本发明多肽化合物在治疗和改善肾纤维化中的功效。在8-12周龄的小鼠中进行UUO阻塞14天后，从图2和图3的结果可以看出，经单侧输尿管阻塞(UUO)处理的小鼠肾小管有明显受损，并有浸润细胞区域，经14天给药后，Masson染色切片显示小鼠肾脏经UUO处理后具有弥漫性胶原沉积；其中，经本发明的多肽化合物处理可显著改善肾脏的组织形态并减少胶原蛋白的沉积。此外，图2和图3的染色切片结果显示，使用本发明多肽化合物1、3、11、21、28、40、41处理的小鼠肾脏组织中显示较少的巨噬细胞浸润，表明小鼠的肾脏组织中炎症较少，且效果优于索马鲁肽。
由此可以证明，使用本发明的多肽化合物能够明显减轻肾纤维化导致的炎症，且治疗效果更佳。
实施例3、GLP-1R/GCGR双激动剂多肽改善和治疗肾纤维化作用机制的研究
为进一步了解本发明多肽化合物在改善和治疗肾纤维化过程中的作用机制，随机选用实施例2中经多肽化合物40给药治疗的UUO小鼠、假手术对照组以及生理盐水组加以研究。
在第14天处死小鼠，收集小鼠肾脏组织并进行切片，切片厚度为4um，使用CD68(包括抗体E-cad、抗α-SMA、抗体PERK和抗体p-eIF2α)对小鼠肾脏组织切片进行免疫组织化学(IHC)染色，随后观察染色后的小鼠肾脏组织切片小鼠肾脏形态和纤维化，其结果如图4所示。收集组织样品用于免疫组织化学和肾脏mRNA基因表达分析，用TGF-β刺激的小鼠肾小管细胞(mTECs)被用作纤维化的体外模型。
体外细胞培养：
从小鼠肾脏分离出肾小管上皮细胞(mTECs)。然后将mTECs在补充有肾的上皮细胞生长培养基中于37℃和5％CO
蛋白质提取和蛋白质印迹：
收集TGF-β1和/或本发明的多肽化合物处理48小时后的mTEC，使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液在冰上裂解处理48小时后的mTEC，并提取蛋白质。通过BCA分析定量蛋白质浓度，然后将蛋白质与上样缓冲液混合并煮沸，进行蛋白质印迹实验。蛋白质在电泳缓冲液中的10％SDS-PAGE上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用BSA缓冲液封闭，并与抗PERK，抗p-PERK，抗-CHOP和抗β-肌动蛋白在4℃过夜孵育，使用PBST洗涤3次，通过化学发光检测信号，并通过化学发光成像系统ChemiScope 3300MiniImaging System可视化。
实时聚合酶链反应：
根据制造商Thermo Fisher Scientific的说明()，使用Trizol试剂从小鼠肾脏中提取总RNA。使用qScript cDNA合成试剂盒(Quanta Biosciences，Gaithersburg，MD)、1μgRNA进行逆转录酶反应，实时定量PCR在Bio-Rad IQ2PCR机上运行，每种PCR混合物在15μLSYBR绿色反应混合物(Bio-Rad)中包含40ng cDNA模板和10μnM引物，使用2-ΔΔCt方法计算基因表达水平的变化。
RNAseq分析：
在处理后48小时收集使用或不使用TGF-β1(10ng/mL)处理的mTEC。提取这些样品的RNA(n＝3/组)并进行RNAseq分析。使用Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies，CA，USA)的RNA Nano 6000分析试剂盒评估RNA完整性。每个样品的总量为1ug RNA用作RNA样品制备的输入材料。使用用于
使用绘图工具GraphPad Prism(GraphPad Software，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚)进行数据分析。各组之间的统计学显著性是通过Wilcoxon非参数检验或配对或非配对t检验确定的。用单向方差分析分析代表两组以上的数据。P<0.05被认为代表统计学上的显著差异。误差线始终表示平均值的标准误差(SEM)。
试验结果分析：
(1)本发明的多肽化合物能够抑制I型胶原基因ColI的表达。
经14天给药后，图4中使用CD68进行的IHC染色切片显示，使用本发明多肽化合物处理的小鼠肾脏组织中显示较少的巨噬细胞浸润，表明小鼠的肾脏组织中炎症较少，由此可以证明使用本发明的多肽化合物可以减轻肾纤维化导致的炎症。图5为小鼠肾脏组织中I型胶原α1链(ColIα1)的基因表达情况图，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，单向方差分析；I型胶原α1链基因用于编码I型胶原，使用qPCR方法分析小鼠肾脏组织分析I型胶原α1链(ColIα1)的基因表达情况，其结果如图5所示。根据图5的结果显示，与未治疗组相比，使用本发明多肽化合物的治疗组中，I型胶原基因ColIα的mRNA也降低了，由此可以证明本发明的多肽化合物可以抑制I型胶原基因表达。
(2)本发明的多肽化合物能在体内和体外抑制肾小管细胞上皮-间质转化(EMT)。
图6为体内EMT过程中小鼠肾脏组织经E-cad和α-SMA染色的IHC图像。图7为图6中小鼠肾脏组织的E-cad细胞百分比图，其中*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，单向方差分析。图8为图6中小鼠肾脏组织的α-SMA细胞百分比图，其中*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，单向方差分析。肾小管细胞上皮-间质转化是导致肾纤维化的关键过程。为了确定本发明的多肽化合物是否在改变EMT过程中起作用，将对照组、生理盐水组以及使用本发明多肽化合物处理的小鼠肾脏组织进行E钙黏蛋白(E-cad)和α-肌动蛋白(α-SMA)的IHC染色，其结果如图6所示。使用Image J软件计算图6中E钙黏蛋白(E-cad)细胞和α-SMA细的百分比，其结果如图7和图8所示。根据图6至图8的结果显示，对照组中大多数正常肾小管E-cad呈阳性，而经UUO处理的小鼠肾脏中E-cad的表达则明显降低。但是与生理盐水组相比，使用本发明的多肽化合物治疗组则显著地具有更多的正常小管。α-SMA是成纤维细胞活化的敏感标记，在对照组的小鼠肾脏中α-SMA主要位于血管中，而在经UUO处理的小鼠肾脏中肾小管和肾小管间质中的α-SMA明显上调，但经本发明多肽化合物处理的小鼠显著降低了肾小管和肾小管间质中的α-SMA。由此可以证明，本发明的多肽化合物能够抑制体内肾纤维化过程中的肾小管细胞上皮-间质转化(EMT)。
图9为体外EMT过程中小鼠肾小管上皮细胞经α-SMA染色的IF图像。图10为图9中小鼠肾小管上皮细胞的α-SMA细胞百分比图，其中*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，单向方差分析。图11为图9中小鼠肾小管上皮细胞中I型胶原α1链(ColIα1)的基因表达情况图，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，单向方差分析；I型胶原α1链基因用于编码I型胶原，使用qPCR方法分析小鼠肾脏组织分析I型胶原α1链(ColIα1)的基因表达情况。为了确定本发明的多肽化合物是否在体外改变EMT过程中起作用，，在体外培养了小鼠肾小管上皮细胞，并使用TGF-β诱导EMT过程，其结果如图9至图11所示。根据图9至图11中α-SMA染色和ColIα1基因表达情况显示，在培养系统中添加本发明的多肽化合物能显著抑制TGF-β诱导的成纤维细胞活化。
(3)本发明的多肽化合物抑制TGF-β诱导的EMT过程中PERK介导的内质网应激通路。
为了确定由TGF-β刺激的肾小管细胞的转录组谱，我们进行了48小时经或不经TGF-β1(10ng/mL)刺激的mTEC的RNAseq分析，其结果如图12所示。根据图12的结果显示，超过8000个基因受到差异调节。对这些差异表达基因的KEGG途径富集分析，结果如图12所示。根据图12的结果表明，调节葡萄糖代谢和内质网(ER)应激的信号传导途径是TGF-β刺激后肾小管细胞改变的主要途径。
内质网应激通路在肾损伤和肾纤维化中起关键作用，内质网激酶(PERK)和C/EBP同源蛋白(CHOP)是ER压力调节剂的关键调节剂，可导致肾小管上皮细胞损伤和成纤维细胞活化。为了确定ER应激是否受GLP1R/GCGR调控，通过qPCR分析了ER应激基因(包括XBP1s，PERK和ATF-6)，其结果如图14所示。根据图14的结果表明，在TGF-β的诱导下，肾小管细胞PERK基因表达明显上调，加入本发明的多肽化合物后PERK基因表达受到明显抑制。图15的Western印迹结果表明，本发明的多肽化合物降低了TGF-β诱导的EMT过程中PERK，p-PERK和CHOP的蛋白表达。
为了进一步确定本发明的多肽化合物是否在体外过程中起作用，，在对照组(空白对照，不经TGF-β处理)、TGF-β组(使用10ng/mLTGF-β处理)；TGF-β+本发明多肽化合物40(同时使用10ng/mLTGF-β和10umol/L本发明的多肽化合物40处理)治疗的阻塞性肾脏中进行了PERK和p-eIF2αIHC染色，其结果如图16所示。图17和图18分别为PERK和p-eIF2α阳性细胞的百分比，其中*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001，单向方差分析。根据图16至图18的结果显示，PERK和p-eIF2α主要位于受损的肾小管细胞中。与对照组的正常肾脏相比，阻塞性肾脏显示PERK和p-eIF2α阳性肾小管细胞显著增加。但是，经本发明多肽化合物处理可显著降低阻塞性肾脏中PERK和p-eIF2α的表达。由此可以证明，本发明的多肽化合物能抑制抑制EMT过程中PERK介导的内质网应激通路。
(4)本发明的多肽化合物能改善线粒体形态。
ER应激途径与线粒体功能密切相关，继发于内质网应激的线粒体失调与多种肾脏疾病有关。为了进一步确定本发明多肽化合物是否对肾小管细胞的线粒体形态有影响，在体外细胞系统中将对照组(空白对照，不经TGF-β处理)、TGF-β组(使用10ng/mLTGF-β处理)；TGF-β+多肽化合物组(同时使用10ng/mLTGF-β和10umol/L本发明的多肽化合物处理)的线粒体进行染色；线粒体使用绿色染色剂染色，细胞核使用Hoechst染色，其结果如图19所示；检测线粒体强度，其结果如图20所示。根据图19和图20的结果显示，TGF-β诱导降低了培养的肾小管细胞的线粒体质量，并且通过添加本发明的多肽化合物可以逆转这种效应。由此可以证明，本发明的多肽化合物能在线粒体代谢中起作用。
综上所述，本发明的多肽化合物能在体内和体外抑制肾小管细胞上皮-间质转化，能改善线粒体形态，同时本发明还确定了PERK介导的ER应激途径参与肾纤维化的过程，本发明的多肽化合物能够抑制TGF-β诱导的EMT过程中PERK介导的内质网应激通路，从而治疗或改善肾脏纤维化以及肾纤维化导致的炎症。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求书所界定的保护范围。
序列表
<110> 深圳市图微安创科技开发有限公司
<120> GLP-1R / GCGR双激动剂多肽衍生物预防或治疗肾纤维化
<130> GD2300-20P125135
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
<400> 12
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 13
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-(PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CO2H
<400> 13
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 14
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3
<400> 14
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 15
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<400> 15
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 16
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3
<400> 16
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<400> 17
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1 5 10 15
Lys Ala Ala His Asp Phe Val Glu Trp Leu Leu Arg Ala
20 25
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<400> 18
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
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His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 20
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
<400> 20
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Lys Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 21
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<400> 21
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ala Ala His Asp Phe Val Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 22
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3
<400> 22
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ala Ala His Asp Phe Val Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3
<400> 23
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Arg Ala
20 25
<210> 24
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3
<400> 24
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Arg Ala
20 25
<210> 25
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3
<400> 25
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ala Ala His Asp Phe Val Glu Trp Leu Leu Arg Ala
20 25
<210> 26
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<400> 26
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 27
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CO2H
<400> 27
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 28
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3
<400> 28
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3
<400> 29
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 30
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
<400> 30
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Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 31
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
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His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 32
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)16CH3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
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His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 33
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3
<400> 33
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Lys Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 34
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<400> 34
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 35
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H
<400> 35
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CH3
<400> 36
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 37
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Nle
<400> 37
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Nle
<400> 38
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 39
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<400> 39
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 40
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3
<400> 40
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 41
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Nle
<400> 41
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 42
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3
<400> 42
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 43
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)14CH3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
<400> 43
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 44
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
<400> 44
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 45
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Nle
<400> 45
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 46
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Nle
<400> 46
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
<210> 47
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<210> 48
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<221> MISC_FEATURE
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<223> Lys的侧链连接-PEG2-PEG2-γGlu-CO(CH2)16CO2H
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<223> Xaa=Nle
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His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 40
机译： OXYNTOMODULIN类似物GLP-1R / GCGR双靶标激动剂多肽治疗特发性肺间质纤维化
机译： GLP-1R / GCGR双靶激动剂多肽用于治疗非酒精脂肪肝病
机译： GLP-1R / GCGR双靶激动剂多肽用于治疗脂肪肝疾病，高脂血症和动脉硬化
