pH响应型铜基化合物纳米材料用作双硫仑载体在制备肿瘤多层级选择性治疗药物中的应用

摘要

本发明提供一种pH响应型铜基化合物纳米材料用作双硫仑载体在制备肿瘤多层级选择性治疗药物中的应用，采用金属离子掺杂的模版法制备了在介孔二氧化硅纳米粒子中进行铜掺杂(Cu‑MSNs)的功能化载体，负载双硫仑后得到纳米给药系统。本发明制备的纳米给药系统能够通过EPR效应富集于肿瘤部位后释放出铜离子与双硫仑，并在组织与细胞双层面发挥作用，提高化疗药物效果，同时减少了传统给药途径引起的全身毒副作用，为肿瘤的原位局部治疗提供一个新的研究方向。

说明书

技术领域

本发明属于纳米生物医学领域，涉及一种pH响应型铜基化合物纳米材料用作双硫仑载体在制备肿瘤多层级选择性治疗药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，尽管癌症的诊断和治疗已取得重大进展，但如何有效控制、攻克恶性肿瘤成为一个亟需解决的问题。近年来，使用各种药物的化疗手段在手术或放射治疗后实施是临床上最常用的肿瘤治疗策略之一。然而，化疗药物的全身给药有其局限性，如高剂量给药产生严重的副作用和低选择性肿瘤毒性。随着纳米技术的发展，具有肿瘤微环境反应能力的纳米粒子已显示出刺激释放化疗药物并取得优异的抗肿瘤效果。

近年来，经美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗酒精中毒的双硫仑(DSF)被发现具有诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤活性。此外，研究表明当DSF与铜离子(Cu

目前已知的铜基纳米材料，如铜掺杂介孔二氧化硅可提高肿瘤部位铜离子的富集。因此，如何将化疗药物与高稳定性的纳米材料结合，以实现选择性细胞毒性和细胞毒性扩增，达到更好的肿瘤治疗效果成为有待解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是针对如何将化疗药物与高稳定性的纳米材料结合，以实现选择性细胞毒性和细胞毒性扩增，达到更好的肿瘤治疗效果的目的，提供了一种pH响应型铜基化合物纳米材料用作双硫仑载体在制备肿瘤多层级选择性治疗药物中的应用。

pH响应型铜基化合物纳米材料，为有序介孔结构，孔径为2～20nm；采用金属离子掺杂的模版法制备了铜掺杂的介孔二氧化硅纳米球，具体采用以下方法制备得到：

含铜化合物溶解在醇类共溶剂、正硅酸乙酯、表面活性剂、氟化铵、蒸馏水混合溶液中，磁力搅拌3～5小时，离心分离，用蒸馏水和乙醇洗涤3～ 5次，真空冷冻干燥，在空气中以500～700℃烧结6～8小时后，得到铜掺杂的介孔二氧化硅纳米球Cu-MSNs，即pH响应型铜基化合物纳米材料。

作为优选，含铜化合物为氯化铜。

作为优选，含铜化合物中铜离子、醇类共溶剂、正硅酸乙酯、表面活性剂、氟化铵、水的摩尔比为0.252:(10～23.1):0.49:4.49:11.1:(2530～ 3030)。

作为优选，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三乙基溴化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵中的至少一种，优选为十六烷基三甲基溴化铵。

作为优选，醇类共溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇中的至少一种，优选为乙醇。

本发明的另一个目的是提供一种抗肿瘤药物，为负载双硫仑的pH响应型铜基化合物纳米材料Cu-MSNs/DSF，Cu-MSNs/DSF的平均粒径在90-110nm，且Cu-MSNs的载药量为20％～30wt％；具体采用以下方法制备得到：

pH响应型铜基化合物纳米材料Cu-MSNs加入水中均匀分散后，与溶解在乙醇的双硫仑溶液磁搅拌下混匀，离心分离，用水洗涤3～5次得到负载双硫仑的pH响应型铜基化合物纳米材料Cu-MSNs/DSF。

作为优选，Cu-MSNs与双硫仑的质量比为1:4～6。

本发明的又一个目的是提供一种给药系统，将上述抗肿瘤药物分散在任何适于临床应用的生理盐水(例如质量分数为0.9％的氯化钠溶液)或缓冲盐 (例如pH＝7-9的PBS缓冲液)中，剂型为注射剂。

本发明Cu-MSNs/DSF纳米球具有高选择性肿瘤毒性，可通过EPR效应递送双硫仑药物到肿瘤部位，提高化疗药物双硫仑的肿瘤富集，减少了传统给药途径引起的全身毒副作用，在肿瘤治疗中的起到一定促进作用。

本发明还提供了一种组织层面实现肿瘤选择性治疗的新方法。将pH响应型铜基化合物纳米材料用作双硫仑载体，在肿瘤弱酸性微环境中可选择性释放出双硫仑与铜离子，二者在肿瘤内进一步结合在一起，形成DSF-Cu络合物，产生一定抗肿瘤作用。由于双硫仑和铜离子是在肿瘤原位释放的，以pH 响应型铜基化合物纳米材料作为双硫仑载体可实现肿瘤选择性治疗。所述肿瘤包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌或脑癌等。

本发明还提供了一种针对肿瘤细胞进行肿瘤选择性治疗的新思路。pH响应型铜基化合物纳米材料用作双硫仑载体在肿瘤部位释放双硫仑和铜离子后，形成的DSF-Cu络合物能够有选择地提高肿瘤细胞内的自由基(ROS)水平并抑制相关蛋白酶体活性，从而特异性诱导肿瘤细胞凋亡。所述蛋白酶包括但不限于超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、丝氨酸蛋白酶等。

本发明提供的纳米给药系统中纳米材料与负载双硫仑的比例可以根据肿瘤细胞的类型，通过本领域常规手段确定。进一步的，本发明提供的纳米给药系统中pH响应型铜基化合物纳米材料与负载双硫仑的比例及使用量只要能满足使其通过注射的方式顺畅地进入机体，并到达特定的肿瘤部位且肿瘤处富集最大即可。

本发明具有以下的优点：

1)本发明提供的纳米给药系统可以递送双硫仑药物至肿瘤部位，提高化疗药物疗效。

2)本发明采用的铜基化合物纳米材料可通过EPR效应在肿瘤聚集，提高肿瘤内Cu

3)以本发明提供的纳米材料作为双硫仑载体能够有区域选择性地在肿瘤弱酸性微环境中释放并生成活性成分DSF-Cu络合物，从而克服药物对正常组织产生的潜在生物毒性。

本发明提供的纳米材料在肿瘤部位形成DSF-Cu络合物后，可以通过提高肿瘤细胞内自由基ROS的水平并抑制肿瘤特异性高表达的相关蛋白酶活性，选择性诱导肿瘤细胞凋亡，从而只对肿瘤区域内的肿瘤细胞起到杀伤作用。

附图说明

图1为Cu-MSNs的TEM图；

图2为Cu-MSNs中Si，O和Cu的EDS元素分布；

图3为Cu-MSNs氮气吸附-解吸分析；

图4为不同酸性条件下Cu-MSNs的铜离子释放曲线；

图5为不同酸性条件下Cu-MSNs/DSF的DSF释放曲线；

图6为不同酸性条件下Cu-MSNs与DSF的紫外-可见光谱；

图7为4T1细胞的细胞存活率；

图8为L929细胞的细胞存活率；

图9为小鼠肿瘤体积变化曲线；

图10为不同条件处理下的组织切片；其中(a)对照组，(b)静脉注射生理盐水与DSF，(c)静脉注射盐水与Cu-MSNs，(d)静脉注射盐水与 Cu-MSNs/DSF。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

pH响应型铜基化合物纳米材料，为有序介孔结构，孔径为2～20nm；采用金属离子掺杂的模版法制备了铜掺杂的介孔二氧化硅纳米球，具体采用以下方法制备得到：

含铜化合物溶解在醇类共溶剂、正硅酸乙酯、表面活性剂、氟化铵、蒸馏水混合溶液中，磁力搅拌3～5小时，离心分离，用蒸馏水和乙醇洗涤3～ 5次，真空冷冻干燥，在空气中以500～700℃烧结6～8小时后，得到铜掺杂的介孔二氧化硅纳米球Cu-MSNs，即pH响应型铜基化合物纳米材料。

本发明的其中一种方式，含铜化合物为氯化铜。

本发明的其中一种方式，含铜化合物中铜离子、醇类共溶剂、正硅酸乙酯、表面活性剂、氟化铵、水的摩尔比为0.252:(10～23.1):0.49:4.49:11.1: (2530～3030)。

本发明的其中一种方式，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三乙基溴化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵中的至少一种，优选为十六烷基三甲基溴化铵。

本发明的其中一种方式，醇类共溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇中的至少一种，优选为乙醇。

一种抗肿瘤药物，为负载双硫仑的pH响应型铜基化合物纳米材料 Cu-MSNs/DSF，Cu-MSNs/DSF的平均粒径在90-110nm，且Cu-MSNs的载药量为20％～30wt％；具体采用以下方法制备得到：

pH响应型铜基化合物纳米材料Cu-MSNs加入水中均匀分散后，与溶解在乙醇的双硫仑溶液磁搅拌下混匀，离心分离，用水洗涤3～5次得到负载双硫仑的pH响应型铜基化合物纳米材料Cu-MSNs/DSF。

本发明的其中一种方式，Cu-MSNs与双硫仑的质量比为1:4～6。

实施例1

1、铜掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒的制备

氯化铜(0.034g)首先溶解在少量乙醇(1mL)、正硅酸乙酯(1mL)，超声混合均匀。然后将该溶液缓慢滴加到溶有十六烷基三甲基溴化铵(0.18 克)和氟化铵(0.3克)的蒸馏水(50mL)中。磁力搅拌4小时后，通过离心(8000rpm，10分钟)收集合成的纳米球，并用蒸馏水和乙醇洗涤三次。产物真空冷冻干燥12h，在空气中以600℃烧结6小时后，可得铜掺杂的介孔二氧化硅纳米球。图1为Cu-MSNs的TEM图，结果显示，该Cu-MSNs的粒径分布均匀，呈球形介孔结构，大约在100nm左右；图2为Cu-MSNs中Si， O和Cu的EDS元素分布，表明铜在整个纳米颗粒中均匀分布；图3为Cu-MSNs 氮气吸附-解吸分析，进一步证实该Cu-MSNs为有序介孔结构，且该Cu-MSNs 孔径在3nm左右。

2、负载双硫仑的铜掺杂介孔二氧化硅纳米球制备

将5毫克制备好的Cu-MSNs加入蒸馏水中(10mL)，超声10分钟以形成均匀的分散。然后，将30毫克的DSF溶解在乙醇(10mL)后与上述溶液混合均匀，并磁力搅拌过夜。通过离心(8000rpm，10分钟)后，用水洗涤 3次所得即产物Cu-MSN

实施例2、铜掺杂介孔二氧化硅纳米球在不同pH下的铜离子释放：

将1mL铜离子浓度为2mg·mL

实施例3、包载双硫仑的铜掺杂介孔二氧化硅纳米球在不同pH下的药物释放：

将5mL质量浓度为1.0mg·mL

实施例4

DSF、Cu-MSNs、Cu-MSNs/DSF对小鼠乳腺癌细胞(4T1)以及小鼠成纤维细胞(L929)的细胞毒性：将上述两种细胞以5000个/孔的密度种于96孔板内，在5％CO

实施例5：肿瘤为卵巢癌

Cu-MSNs/DSF的体内抑瘤情况：6周雌性Balb/c小鼠，平均重量为17 克20只，在右轴区皮下注射1～10

图10为不同条件处理下的小鼠肿瘤组织切片。结果显示用Cu-MSNs/DSF 处理的小鼠肿瘤切片中出现大量细胞坏死，而单纯的DSF、Cu-MSNs组未观察到明显的细胞坏死。