用于毛发护理领域的头状胡枝子提取物

摘要

本发明涉及一种头状胡枝子提取物，其用于毛发护理领域中的化妆品和/或皮肤病学的用途，更具体地用于治疗和/或预防脱发和/或头皮皮脂溢的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一种头状胡枝子(Lespedeza capitata Michx.)提取物，其用于毛发护理领域中的化妆品和/或皮肤病学的用途，更特别地其用于治疗和/或预防脱发和/或头皮皮脂溢的用途。

背景技术

头状胡枝子是一种来源于北美的豆科草本多年生植物。头状胡枝子在欧洲种植，尤其是在法国。

头状胡枝子是一种被绒毛的植物，其直立茎可以达到1.5米的高度。其叶为互生的，复叶的，通常是三叶形的；小叶尺寸约为4.5×1.8cm；叶柄短(2至5mm)。叶和茎覆盖着紧密的毛，可以使植物带有银色的光泽。花为蝶形的，密集地组成腋生花序。除旗瓣以外的花瓣为白色，所述旗瓣具有一些粉红色至紫色。花萼为宿存的，随着时间的推移呈现棕色。果实为不开裂的，具有一粒种子。头状胡枝子扎根深，初生根可扎到地下2.5米。

头状胡枝子是许多美国原住民种族的传统药物的一部分。奥马哈人(Omaha)和篷卡人(Ponca)用茎作为灼烙剂治疗风湿病或神经痛。科曼奇人(Comanches)以浸泡剂的形式使用叶子。梅斯基瓦基人(Meskwaki)将根用作解毒剂(USDA-NRCS.Plant Guide05dec.2000)。目前，主要种植头状胡枝子以在膳食补充剂以及药物、顺势疗法和兽医制剂中使用。

已经基本上研究了头状胡枝子的地上部分在泌尿领域的特性(特别是其利尿和抗氮血症能力)。多项临床研究已经报道。大多数是在60到80年代进行的，主要是在法国。临床研究特别地涉及向患有肾脏疾病的患者静脉内施用头状胡枝子提取物。在39名患有稳定高胆固醇血症的受试者中进行的临床研究中报道了口服施用的头状胡枝子酊剂的降胆固醇活性(Yarnell和Abascal,Alternative and Complementary Therapies.13(1):18-23,2007)。

如今，头状胡枝子的地上部分因其治疗性质而仍然在使用。它们以粉末或提取物的形式出售，用于配制浸泡剂，作为膳食补充剂、顺势疗法或药物制剂(氮血症；泌尿领域)或兽药制剂(泌尿领域)。

近期的一份文献显示，头状胡枝子的乙醇提取物在体外诱导成纤维细胞和角化细胞的增殖，抑制胶原酶，刺激成纤维细胞的胶原蛋白合成，并具有脂解作用(Pastorino等人2017.Industrial Crops and Products.96:158-164)。专利申请CN104606122也指出，与其他植物混合的头状胡枝子能够消除妊娠相关的腹部脂肪。

发明内容

出乎意料且令人惊讶地，本申请人证明，头状胡枝子提取物在治疗和/或预防皮肤和毛发疾病的领域中，尤其是在用于对抗脱发和用于治疗头皮皮脂溢及相关疾病上具有令人关注的药理活性。

事实上，本发明人证明，头状胡枝子提取物抑制真皮乳头细胞对Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的合成和释放。因此，头状胡枝子将有助于延缓和防止脱发，并延长毛发的寿命。

此外，本发明人已经证明，头状胡枝子提取物抑制皮肤乳头细胞中的5α-还原酶活性。因此，头状胡枝子提取物可用于脱发预防领域以及头皮皮脂溢及相关的皮肤和毛发疾病。

头状胡枝子在毛发护理领域中的这种新用途是本发明的主题，并能够预见应用各种基于头状胡枝子的产品以通过护理毛发改善毛发的美学外观，以及预防和/或治疗脱发和/或头皮皮脂溢及所有相关的皮肤和毛发疾病。

因此，本发明还涉及一种头状胡枝子提取物，其用于治疗和/或预防至少一种皮肤和毛发疾病的用途。

有利地，所述皮肤和毛发疾病选自脱发、头皮脂溢性皮炎、头皮红斑、头皮皮脂溢及其组合。

皮肤和毛发疾病还可以是油性毛发。

具体实施方式

出于美容目的、防止脱发和毛发再生目的的毛发护理一直是研究人员感兴趣的。

毛囊是固定在皮肤至皮下组织中的微型器官，其主要功能是产生发干。毛囊是产生毛发的动态结构。毛发不会持续生长，而是根据毛发生长周期生长，所述周期分为三个阶段：

-生长期(毛发生长初期)：真皮乳头细胞(成纤维细胞)向球干细胞发送信号，使其增殖。这些细胞将被转化并包裹真皮乳头以形成毛发的硫基质。它们分裂并分化为角化细胞，即负责毛发结构的细胞。为了合理地构造毛发，角化细胞需要含硫的蛋白质、维生素B6和各种矿物质如锌和镁。该阶段的持续时间决定了头发的长度，并取决于毛囊底部基质细胞的增殖和分化。

-消退期(毛发生长中期)：基质死亡，作为结果，真皮乳头不再与该基质接触。细胞之间不再有交换。毛囊和真皮乳头向上移动到表皮。

-休止期(毛发生长静止期)：真皮乳头和球细胞完整且不活动。毛发脱落。为了使新的毛发生长，必须重新开始循环。

毛发不断自我更新，在构成毛发的100,000至150,000根毛发中，大部分处于生长期。对于健康的毛发，正常的生理性脱发每天约为60至100根。超过上述的脱发被认为是病理性的，无论是偶然的还是持续的。

术语脱发表示部分或整体毛发脱失。脱发可能涉及许多因素，例如遗传因素、年龄、性别、疾病、压力、激素问题、药物副作用和受伤。脱发可分为几种形式：

-遗传性雄激素性脱发是最常见的。早期脱发发生在遗传易感受试者中，特别影响男性。其表现为发量减少甚至光秃，影响了50％的50岁以上男性；

-绝经后脱发是女性脱发的最常见原因。相比于男性，女性的脱发更加弥漫和扩散。女性弥漫性脱发是一种通常始于更年期的疾病，涉及约40％的70岁以上老年女性。术语弥漫表示，与男性不同，脱发均匀地涉及到头上的所有毛发；

-急性或反应性脱发可能与化学疗法、压力、分娩、主要饮食缺乏、铁缺乏和激素紊乱有关。其为大量毛发的同时弥漫性脱失；

-皮肤问题(肿瘤、烧伤、斑秃)、急性辐射、红斑狼疮或寄生虫(癣、苔藓病)可以引起疤痕性脱发；

-斑秃似乎是自身免疫来源的，其特征是在一处或多处大小不一的斑块损伤；

-先天性脱发很少见，其为发根缺失或毛发异常(突变)。

脱发本质上与头发更新的破坏有关，上述破坏首先导致循环频率的加速，以头发的质量和数量为代价。最常见的现象是由于细胞增殖的停止而导致的生长周期(毛发生长初期)减少。结果是过早地诱发了毛发生长中期，使处于毛发生长静止期的毛囊数量更多，从而造成更多的脱发。为了对抗脱发，因此有必要重新启动毛发周期，例如通过激活毛发生长初期。

目前已知，导致遗传性雄激素性脱发(也被称为脂溢性脱发)的机制涉及激素组分，其具有雄激素受体(睾酮和DHT受体)的过表达以及5-α-还原酶的更强活性。这种激素失调导致睾酮的活性代谢产物二氢睾酮(DHT)的过量产生。在真皮乳头处，这种代谢物将刺激毛发周期抑制剂的产生，导致毛发生长初期缩短，迫使毛发过早进入毛发生长静止期，使得毛囊没有足够的时间产生优质的角蛋白，在数个循环之后，将必然耗尽毛囊产生发干的能力。

由于雄激素过多而引起的脱发也影响更年期期间的女性(绝经后脱发)或雄激素治疗后的女性。其开始于太阳穴和头顶。相比于男性，这种脱发更加弥漫和扩散。脱发均匀地涉及整个头皮。

因此，5-α-还原酶抑制剂能够治疗和/或预防男性和/或女性的脱发。

皮脂溢是皮脂腺对皮脂的过量产生。整体上，人具有2,000,000个皮脂腺，附着在6,000,000根毛发上。皮脂腺的分布不均匀。面部和头皮的皮脂腺密度达到300到900个皮脂腺/cm

皮脂溢表现的部位是面部中间区域(额头、鼻子、下巴)，在所述区域中皮脂腺最多且最大。皮脂溢还表现在头皮，主要是额叶和额颞叶区域以及颅骨顶部。

头皮皮脂溢引起美学和皮肤病学病症，如头皮脂溢性皮炎和头皮红斑。

头皮脂溢性皮炎(DS)的特征是弥漫性、粉红色的炎性斑块，覆盖有油性、白色的硬皮鳞屑，粘附在表皮上，有时呈化脓性，有时引起严重的瘙痒。

皮脂溢通常与雄激素性脱发有关。

因此，5α-还原酶的活性抑制剂将能够减少皮脂分泌、治疗皮脂溢和解决与皮脂溢有关的皮肤病学和/或美学问题。

毛发生长周期是一个高度受控的过程，在此过程中，毛囊的各个部分(真皮乳头、位于球中的干细胞、毛囊基质的角化细胞)通过各种分子交换进入紧密的关系。在涉及的信号中，已知Wnt/β-连环蛋白信号促进毛发生长(Leiros等人,Br.J.Dermatol.166(5)-1035-1042,2012)。

雄激素性脱发是脱发的最常见形式，明确是一种雄激素性疾病。雄激素异常调节由真皮乳头分泌的因子，其通过抑制标准的Wnt信号传导通路导致干细胞分化失败。

已知毛发生长周期抑制剂“Dickkopf相关蛋白1(DKK1)”阻断由β-连环蛋白介导的Wnt通路的标准活化，并促进毛发生长中期的进行(Kwack等人,J.Invest.Dermatol.132(6):1554-60,2012)。还描述了DKK1受雄激素调节(Kwack等人,J.Invest.Dermatol.128(2):262-9,2008)。

综上所述，这些结果表明DKK1在雄激素诱导的毛发生长抑制和雄激素性脱发中毛发生长中期的早期诱导中发挥着重要作用(Inui和Itami,J.Dermatol.Sci.61(1):1-6,2011)。

在本说明书中，头状胡枝子植物可以简称为头状胡枝子(Lespedeza capitata)。

在本发明的上下文中，从头状胡枝子植物的一个或多个部位中获得头状胡枝子提取物，所述部位选自根和地上部分如茎、枝、叶、果实、种子和/或花。有利地，其为地上部分，所述地上部分选自单独的叶、茎或花或其混合物。

在本发明的一个特别的实施方案中，由头状胡枝子的叶和/或茎和/或花(尤其是干燥的叶和/或茎和/或花)获得提取物。

在本发明的一个特别的实施方案中，由头状胡枝子细胞的培养物获得提取物。

根据一个特别的实施方案，所述提取物为水醇提取物，特别是水乙醇提取物。有利地，其为通过水醇提取，特别是水乙醇提取获得的提取物。

根据一个优选的实施方案，可以通过以下描述的根据本发明的方法获得根据本发明的提取物。

头状胡枝子植物或其部分可以是新鲜的或干燥的，完整的，切碎的或压碎的，然后经受提取步骤。

根据本发明的提取物的制备方法将包括头状胡枝子植物的全部或部分通过亲水性至非极性溶剂，优选亲水性至中等极性水性溶剂的提取步骤。

在本发明的含义内，“中等极性溶剂”是指一种溶剂，其选自C1至C5醇、二醇(丙二醇、丁二醇、戊二醇)、甘油、丙酮、烷基酯(特别如乙酸乙酯和乙酸异丙酯)，与水混溶的溶剂的混合物例如水醇混合物或丙酮/水混合物，甚至是助水溶性溶剂。可替代的助水溶性溶剂为可溶于水中的两亲性分子，足够浓度的所述分子可以提取如提取物的表征中所描述的中等极性化合物。

在本发明的含义内，“烷基酯”表示R

在本发明的含义内，“(C

在本发明的含义内，“非极性溶剂”是指一种溶剂，其选自庚烷、己烷、柠檬烯、卤代烃(氯仿、二氯甲烷)、超临界CO

应当理解，选择如上面所定义的非极性溶剂用于萃取不是优选的。

“亲水性溶剂”是指一种溶剂，其选自水、亚临界水、与水可混溶的醇(例如乙醇)、C3至C5二醇、甘油、丙酮及其混合物。

“水性溶剂”是指一种溶剂，其选自单独的水和与亚临界水组合的水、与水可混溶的醇(例如乙醇)、C3至C5二醇、甘油、丙酮及其混合物组合的水。

在本发明的含义内，“干燥提取物”是指没有提取溶剂或载体溶剂，或仅包含痕量的溶剂的提取物。因此，这种干燥提取物仅包含来源于头状胡枝子的物质。其还可以包含痕量的提取溶剂。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述提取溶剂可以选自乙酸乙酯、乙酸异丙酯、C1至C5醇、C3至C5二醇、甘油或水或其混合物。优选地，其为水或水/醇混合物。有利地，其为乙醇/水混合物。

甚至更有利地，该乙醇/水混合物的特征在于乙醇/水的比例为9:1至7:3(v/v)。

更有利地，中等极性溶剂为比例为9:1(v/v)的乙醇/水混合物。

根据本发明的另一个特别的实施方案，在搅拌下或静止下，在回流、在环境温度或介于环境温度和回流之间的温度进行提取。可以通过超声波、微波或以植物重量/溶剂体积比为1/3至1/30的挤出来辅助提取，持续时间为1分钟至48小时。提取可以重复2至3次。

根据本发明的另一个特别的实施方案，然后通过离心或过滤分离固体相，以回收无颗粒物的澄清液体相。可以通过截留阈值为5至20μm，特别是10至20μm的纸过滤器或过滤板进行过滤。可以从

在本发明的另一个实施方案中，可以在浓缩步骤期间加入载体，以获得含有1至75％干燥提取物的提取物。载体可以为麦芽糖糊精、乳糖、二氧化硅、甘油、二醇、或使提取物增溶的任何其他化妆品上可接受的载体，优选生物基来源的，例如生物基二醇(1,2-戊二醇、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇等)，以及助水溶物，例如烷基糖苷(Sepiclear、Apyclean、APXC4等)。

根据本发明的一个特别的实施方案，可以例如通过活性炭从提取物中去除颜色，从而消除所有或部分的叶绿素。

根据本发明的一个特别的实施方案，根据本发明的头状胡枝子提取物的特征在于以每100克干燥提取物中的表儿茶素克数计2至40％，特别是5至35％，更特别是10至30％，更特别是约25％的总多酚含量(相对于干燥提取物的重量以重量计％)。

在本发明中，“约”是指所涉及的值可以比所指的值低或高10％，尤其是5％，特别是1％。

本发明的另一个主题涉及一种化妆品、皮肤病学或皮肤和毛发组合物，其包含至少一种根据本发明的头状胡枝子提取物和至少一种化妆品或皮肤病学上可接受的赋形剂，其旨在用于毛发和/或头皮的护理。

在本发明中，“化妆品或皮肤病学上可接受的”是指可用于制备化妆品、皮肤病学或皮肤和毛发混合物的物质，其通常是安全的、无毒的、并且不是生物学上或其他方面所不期望的，其对于化妆品、皮肤病学或皮肤和毛发的使用是可接受的，特别是通过局部应用于毛发和/或头皮。

“局部应用”是指在皮肤，尤其是头皮、粘膜和/或覆盖物，尤其是毛发和头皮上的应用。

“覆盖物”是指头部和身体毛发、眉毛、睫毛和/或指甲，优选头部的毛发。

在本发明的一个特别的实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于，其以适合于局部施用至头皮和/或毛发的形式存在。

在本发明的一个特别的实施方案中，根据本发明的组合物旨在用于局部施用，尤其是通过将组合物应用到头皮和/或毛发和覆盖物上。

因此，根据本发明的组合物可以以用于局部施用的常见形式存在，即，尤其是洗剂、香脂、洗发剂、摩丝、凝胶、分散剂、乳剂、喷雾剂、精华、膜剂或霜剂，其具有能够渗透以改善活性成分的性质和可及性的赋形剂。

有利地，根据本发明的组合物可以以用于局部施用至毛发和头皮的常见形式存在，即，尤其是洗发剂、护发素、毛发霜剂、毛发洗剂、膜剂或免冲洗喷雾剂。因此，它们为化妆品、皮肤病学或皮肤和毛发组合物。

因此，区分了被配制为需要冲洗的产品和不需要冲洗的产品。

在本发明的一个特别的实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于其以适合于口服施用的形式存在。实际上已经证明，即便当口服施用时，头状胡枝子可以抑制肾素-血管紧张素系统转化酶(Yarnell,2012,IJKD,卷6,407-418)。因此，该提取物不会在胃肠道内被完全代谢。

根据本发明的另一个实施方案，本发明的组合物还可以以用于口服的常见形式存在，即，尤其是片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂和口服溶液剂或混悬剂。当以片剂形式制备固体组合物时，将主要活性成分与药物载体如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯树胶等混合。可以将片剂用蔗糖或其他合适的材料包衣，或甚至可以处理以使其具有延长或延迟的活性，从而使其连续释放预定量的活性成分。

通过将活性成分与稀释剂混合并将所得的混合物倒入硬胶囊或软胶囊中来获得胶囊制剂。

除根据本发明的提取物以外，这些混合物还含有生理上可接受的介质，通常是水基或溶剂基介质，例如醇、醚或二醇。它们还可以含有表面活性剂、络合剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂、润湿剂、润肤剂、微量元素、精油、香料、染料、保湿剂或温泉水等。

在一个实施方案中，根据本发明的化妆品或皮肤病学组合物，特别是皮肤和毛发组合物将包含相对于组合物的总重量以干燥提取物的重量计0.0001％至2％，优选0.001至1％，优选0.005％至0.8％，更优选0.01％至0.5％的头状胡枝子提取物。

在根据本发明的组合物中使用的头状胡枝子提取物将有利地包含相对于提取物的总重量以重量计1％至10％，优选1％至5％的干燥提取物含量。

在一个特别的实施方案中，头状胡枝子提取物是在用于毛发和/或头皮护理的组合物中使用的唯一活性剂。活性剂是指用于本发明所针对的皮肤和毛发疾病的治疗剂或预防剂。

还可以将根据本发明的提取物或根据本发明的化妆品或皮肤病学组合物与脱发治疗剂如非那雄胺或米诺地尔组合使用，和/或与对良好头发结构有用的化合物例如含硫的蛋白质、维生素B6和各种矿物质如锌和/或镁组合使用。

还可以将根据本发明的提取物或组合物与至少一种抗细菌剂、抗真菌剂、抗炎剂及其混合物组合。

可以将根据本发明的提取物或根据本发明的化妆品或皮肤病学组合物用于具有微移植物的个体。

优选地，根据本发明的组合物具有轻薄的质地，还允许最佳的渗透而不会使毛发或头皮油腻。从第一次应用开始，毛发将恢复强度和活力。

因此，本发明还涉及根据本发明的皮肤病学组合物，其用于治疗和/或预防至少一种皮肤和毛发疾病的用途。

用于治疗和/或预防至少一种皮肤和毛发疾病的用途的根据本发明的组合物的特征在于，至少一种皮肤和毛发疾病选自脱发、头皮脂溢性皮炎、头皮红斑、头皮皮脂溢及其组合。

用于治疗和/或预防至少一种皮肤和毛发疾病的根据本发明的组合物的特征在于，脱发选自雄激素性脱发、反应性脱发、绝经后脱发和斑秃。

本发明的另一个目的涉及一种包含根据本发明的头状胡枝子提取物的皮肤病学组合物，其用于预防和/或治疗脱发的用途。

在本发明的一个特别的实施方案中，脱发选自雄激素性脱发、绝经后脱发、反应性脱发和斑秃。

根据另一个方面，本发明涉及根据上述方法的根据本发明的提取物或根据上述方法的根据本发明的化妆品或皮肤病学组合物用于护理毛发和/或头皮以限制脱发，和/或促进毛发生长和/或增加毛囊的密度和/或获得更多的覆盖毛发和/或促进毛囊再生，和/或减少头皮皮脂溢和/或使头发减少油腻的美容用途。

在另一个方面，本发明涉及一种用于毛发和/或头皮以限制脱发，和/或促进毛发生长和/或增加毛囊的密度和/或获得更多的覆盖毛发和/或促进毛囊再生，和/或减少头皮皮脂溢和/或使头发减少油腻的美容处理方法，其包括将根据本发明的提取物施用至有需要的人。这种施用可以是局部的或口服的。

因此，本发明涉及根据本发明的头状胡枝子提取物用于限制脱发，和/或促进毛发生长和/或增加毛囊的密度和/或获得更多的覆盖毛发和/或促进毛囊再生，和/或减少头皮皮脂溢和/或使头发减少油腻的美容用途。

可替代地，本发明涉及根据本发明的化妆品组合物用于护理毛发和/或头皮以限制脱发，和/或促进毛发生长和/或增加毛囊的密度和/或获得更多的覆盖毛发和/或促进毛囊再生，和/或减少头皮皮脂溢和/或使头发减少油腻的美容用途。

本发明还涉及用于护理毛发和/或头皮以限制脱发，和/或促进毛发生长和/或增加毛囊的密度和/或获得更多的覆盖毛发和/或促进毛囊再生，和/或减少头皮皮脂溢的美容方法，其包括根据前述方法向有需要的个体施用有效量的根据本发明的提取物或根据本发明的化妆品或皮肤病学组合物。

在另一个方面，本发明涉及一种用于毛发和/或头皮以限制脱发，和/或促进毛发生长和/或增加毛囊的密度和/或获得更多的覆盖毛发和/或促进毛囊再生，和/或减少头皮皮脂溢和/或使头发减少油腻的美容处理，其包括将根据本发明的化妆品组合物施用至有需要的人。优选地对毛发和/或头皮局部进行这种施用。

有利地，将局部和/或口服施用根据本发明的提取物或化妆品或皮肤病学组合物。

如本文所述的根据本发明的组合物的特征在于，其以适合于局部施用至头皮和/或毛发的形式存在。

如本文所述的根据本发明的组合物的特征在于，其以适合于口服施用的形式存在。

根据本发明的提取物或根据本发明的化妆品或皮肤病学组合物还通过延长毛发周期来帮助阻止脱发，从而在数量和质量上保持毛发基础。

根据另一个方面，本发明还涉及一种旨在通过促进毛发生长和/或通过促进产生更多的覆盖毛发和/或通过限制脱发来改善毛发的美学的美容性毛发护理方法，其特征在于，其包括将有效量的根据本发明的头状胡枝子提取物或根据本发明的组合物应用于毛发和/或头皮，使组合物与毛发和/或头皮接触，和任选地冲洗毛发和头皮。

根据另一个方面，本发明还涉及一种旨在通过对抗油性毛发和/或使暗哑毛发恢复光泽和/或清洁油性头皮来改善毛发的美学的美容性毛发护理方法，其特征在于，其包括将有效量的根据本发明的头状胡枝子提取物或根据本发明的组合物应用于毛发和/或头皮，使组合物与毛发和/或头皮接触，和任选地冲洗毛发和头皮。

以下实施例旨在阐明本发明而非限制其范围。通过非限制性实施例的方式给出它们。

用于本发明的提取物的制备

在反应器中，用25升90:10(v/v)的乙醇/水混合物将2.5千克干燥且粉碎的头状胡枝子的地上部分在搅拌下回流提取1小时。然后将提取物通过K900过滤，并将溶剂蒸发以获得250克绿色粉末，质量产率为10％。所得的干燥提取物包含26％以表儿茶素表示的多酚。

在反应器中，用1升乙酸乙酯将100克干燥且粉碎的头状胡枝子的地上部分在搅拌下回流提取1小时。然后将提取物通过K900过滤，并将溶剂蒸发以获得2克绿色糊状物，质量产率为2％。所得的干燥提取物包含3％以表儿茶素表示的多酚。

在反应器中，用350升30:70(v/v)的乙醇/水混合物将20千克干燥且粉碎的头状胡枝子的地上部分在搅拌下在环境温度提取12小时。然后将提取物通过K900过滤，并将溶剂蒸发以获得3.4克棕色粉末，质量产率为17％。所得的干燥提取物包含36％以表儿茶素表示的多酚。

将26克干燥且粉碎的头状胡枝子的地上部分与260毫升90:10(v/v)乙醇/水混合物接触，然后在超声波(20kHz)作用下以100％的幅度提取1分钟，进行3次。通过K900过滤后，将提取物浓缩，并用活性炭(0.2％w/v)脱色。过滤后，蒸发溶剂以获得1.5克棕色粉末，质量产率为6％。所得的干燥提取物包含25％以表儿茶素表示的多酚。

在反应器中，用2800毫升90:10(v/v)的乙醇/水混合物将280克干燥且粉碎的头状胡枝子的地上部分在搅拌下回流提取1小时。通过K900过滤后，将提取物浓缩，并用活性炭(0.2％w/v)脱色。过滤后，蒸发溶剂以获得25克棕色粉末形式的提取物，质量产率为9％。所得的提取物包含25％以表儿茶素表示的多酚。

在反应器中，用25升90:10(v/v)的乙醇/水混合物将2.5千克干燥且粉碎的头状胡枝子的地上部分在搅拌下回流提取1小时。通过K900过滤后，将提取物浓缩，并用活性炭(0.2％w/v)脱色。过滤后，将提取物在1,2-戊二醇中干燥，以获得46克深色粘稠液体形式的提取物。所得的提取物包含50％的1,2-戊二醇和12％以表儿茶素表示的多酚。

在反应器中，用1升90:10(v/v)的乙醇/水混合物将100克干燥且粉碎的头状胡枝子叶在搅拌下回流提取1小时。然后将提取物通过K900过滤，并将溶剂蒸发以获得17克绿色粉末，质量产率为17％。所得的干燥提取物包含28％以表儿茶素表示的多酚。

药理学评估

该研究旨在评估根据本发明的提取物对人毛囊的真皮乳头细胞的DKK1产生和分泌的作用，并评估该提取物作为脱发预防剂的皮肤病学和美容价值。已证明DKK1是雄激素性脱发的关键因素(参见Kwack等人,BMB Reports,卷43,第10期,2010,第688-692页)。

在来源于三个不同供体的人毛囊的真皮乳头细胞中进行实验。

将细胞接种在96孔板上，并在标准培养介质中培养24小时。然后将介质替换为含有待测混合物的测试介质或不含有待测混合物的测试介质(对照条件)。头状胡枝子为根据本发明的实施例5制备的提取物，以3μg/ml和10μg/ml的两种浓度测试该提取物；其为用DMSO稀释的干燥提取物。二十四小时后，收集培养上清液并保存在-80℃。

通过Luminex(试剂盒编号：HBNMAG-51K，Millipore)根据制造商的说明书将DKK1蛋白定量。

通过Microsoft Excel和Prism软件分析原始数据。通过用ANOVA进行的组间比较和之后的Dunnett检验进行统计分析。

结果

下表1显示在存在或不存在头状胡枝子时DKK1表达及其抑制百分比。

人毛囊真皮乳头细胞自然分泌约150pg/ml的DKK1。当将这些细胞用头状胡枝子提取物处理时，该蛋白的表达以浓度依赖的方式降低，并且从3μg/ml的浓度开始显著降低。在10μg/ml头状胡枝子提取物的存在下，DKK1的减少达到72％。

因此，发明人证明头状胡枝子提取物对DKK1靶点具有抑制活性。

因此，该提取物用作预防和/或治疗脱发的药剂具有令人关注的活性。

这项研究的目的是评估根据本发明的提取物对真皮乳头细胞中5α-还原酶活性的作用，以测定该提取物在预防脱发和/或头皮皮脂溢领域中的价值。

在来源于两个不同供体的人毛囊的真皮乳头细胞中进行实验。将细胞接种(每孔150,000个细胞)到24孔板上，并在标准培养介质中培养24小时。然后，将介质替换为含有待测混合物的测试介质或不含有待测混合物的测试介质(对照条件)或含有参比产品(10μM的非那雄胺)的测试介质持续24小时。头状胡枝子提取物为根据本发明的实施例5制备的提取物，以30μg/ml和100μg/ml的两种浓度测试该提取物；其为用DMSO稀释的干燥提取物。然后，用含有C

用氯仿/甲醇混合物提取上清液中的类固醇分子。收集有机相，并通过薄层色谱法使用包含二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇的溶剂系统分离DHT。然后在色谱上进行放射自显影，并通过光密度分析法评估转化的睾酮。通过Microsoft Excel软件分析原始数据。通过用重复测量ANOVA进行的组间比较和之后的Dunnett检验进行统计分析。

在这项研究中，选择DHT/睾酮的比例来代表5α-还原酶的活性。如果该比例随着混合物的加入而降低，则该混合物被认为是5α-还原酶抑制剂。为了确定该混合物对这种酶是真正特异的，重要的是要证明5α-雄甾烷-3α,17β-二醇/睾酮的比例和雄烯二酮/睾酮的比例降低，且4-雄烯-3,17-二酮/睾酮的比例升高。

结果

下表2显示在与参比化合物(非那雄胺)和头状胡枝子提取物孵育24小时+24小时后的5α-还原酶活性(DHT/睾酮的比例)。

Con：浓度；Moy：平均值；sem：平均值的标准误差；％inh：相对于对照条件的抑制％；stats：统计学。

非那雄胺对人毛囊真皮乳头细胞的处理非常强烈地减少睾酮向DHT的转化(DHT/睾酮的比例降低)。这些结果是预期的，且可以验证测试。

在头状胡枝子提取物的存在下，DHT/睾酮的比例以浓度依赖的方式降低；当头状胡枝子浓度为100μg/ml时，这种降低(达到60％)具有统计学意义。尽管30μg/ml的活性没有统计学意义，但仍具有指示意义。

因此，本发明人清楚地证明了头状胡枝子提取物对5α-还原酶具有抑制活性。

因此，这种头状胡枝子提取物显示出用于预防和/或治疗皮肤和毛发疾病，特别是脱发和/或头皮皮脂溢及相关疾病的药剂的令人关注的活性。

真皮乳头位于毛囊的底部，深深地固定在皮肤组织中。长期以来，已知真皮乳头细胞在毛囊的生长中发挥关键作用。高度血管化的真皮乳头为毛发递送营养，并在每个周期提供上皮细胞增殖和分化所需的分子信息以产生新的毛发。研究表明，在健康的人毛囊中，在大鼠实验中，在损伤诱导的胡须再生模型中，真皮乳头的尺寸(以及真皮乳头细胞的数量)与毛干的尺寸之间存在相关性。在进行性脱发的情况下这种相关性是保持的，其中随着毛发生长周期，毛囊和毛干的尺寸依次减小。此外，毛囊中真皮乳头细胞数量的增加可以部分地通过真皮乳头中新细胞的募集而发生，不过真皮乳头细胞的增殖也可以有助于这种增加。

这项研究的目的是评估根据本发明的提取物对真皮乳头细胞的代谢活性和/或增殖的作用，以测定该提取物在预防脱发领域中的价值。

在来源于三个不同供体的人毛囊的真皮乳头细胞中进行实验。

将细胞接种在96孔板上，并在标准培养介质中培养24小时。然后，将介质替换为含有待测混合物的测试介质(毛囊真皮乳头细胞基底(FFDPC)介质，来自于Promocell，编号C-26500)或不含有待测混合物的测试介质(对照条件)。具有相同介质并补充有5％额外介质(毛囊真皮乳头细胞生长介质补充包，来自于Promocell，编号C-39620)的组作为阳性对照。头状胡枝子提取物为根据本发明的实施例2制备的提取物，以3μg/ml和10μg/ml的两种浓度测试该提取物；其为用DMSO稀释的干燥提取物。七十二小时后，收集培养上清液并保存在-80℃。

通过比色法评估细胞的代谢活性和增殖，其中浅红色的可溶性四唑盐(WIST-1)在还原为甲瓒(由TakaRa Clontech销售的测试物，目录号MK400)后变为红色。通过MicrosoftExcel软件分析原始数据。通过用重复测量ANOVA进行的组间比较和之后的Dunnett检验进行统计分析。

结果

表3显示头状胡枝子提取物对代谢活性和细胞增殖的结果。

Mil suppl：具有补充剂的介质，允许细胞增殖；Moy：平均值；sem：平均值的标准误差；％stim：相对于对照条件的刺激％；stats：统计学；DO：光密度。

用补充介质处理真皮乳头细胞诱导了细胞增殖和/或代谢活性的显著活化。该结果验证了该模型。3μg/ml的头状胡枝子提取物诱导了细胞增殖和/或代谢活性的统计学显著增加。当头状胡枝子为10μg/ml时，这种活化达不到显著，这无疑是由于结果的可变性很大，但这至少指示提取物的作用。

因此，发明人清楚地证明头状胡枝子提取物对细胞增殖和/或代谢活性具有刺激活性。因此，这种头状胡枝子提取物通过增强和刺激毛发的生命周期和促进毛发再生，具有促进毛发生长的令人关注的活性。

JAK-STAT是用于转导调节生长、存活、分化和对病原体抗性的信号传导通路。该通路介导细胞因子、干扰素和生长因子的作用。在哺乳动物中，JAK家族由四个成员组成：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。在小鼠毛囊中进行的研究显示，JAK-STAT通路在毛发周期中是受到动态调节的；JAK-STAT通路在毛发生长中期和毛发生长静止期期间被活化，并在毛发生长初期开始时被抑制。此外，已在小鼠中证明，在毛发生长静止期用JAK-STAT通路抑制剂(包括托法替尼(JAK1/3>JAK2>TYK2)和鲁索替尼(JAK1/2>TYK2>JAK3))的局部处理导致迅速恢复到毛发生长初期的起点(Harel等人,2015Sci.Adv.1,e1500973)。在同一项研究中，还显示人毛囊中JAK-STAT的抑制增加离体毛发生长。这些数据提示，JAK-STAT信号传导通路可以成为刺激毛发生长的新靶标。

该实施例的目的是评估根据本发明的提取物是否可以抑制JAK-STAT信号传导通路。在人重组JAK1、JAK2或JAK3蛋白中评估这种抑制作用。

方法

头状胡枝子提取物是根据本发明的实施例5制备的提取物。将该提取物用DMSO稀释并在各种浓度(0.1-1000μg/ml)测试。在该测试中还评估了阳性对照(托法替尼和鲁索替尼)。

将待测产品与人重组JAK1、JAK2或JAK 3蛋白及反应缓冲液(对于JAK1反应缓冲液为Tris/HCl，对于JAK2和JAK3反应缓冲液为MOPS(3-吗啉-1-丙烷磺酸))、EDTA和特定肽底物一起孵育。然后，通过加入乙酸镁和放射性标记的ATP(对于JAK1和JAK2为45μM，对于JAK3为10μM)的混合物来引发磷酸化反应。在环境温度孵育40分钟后，通过加入磷酸来终止反应。用磷酸洗涤四次，用甲醇洗涤一次，以洗脱小分子，包括标记的ATP。最后，测量特定磷酸化底物的放射性。在三个独立的实验中测试化合物，并且每个实验进行两次。

下表4列出了测试的产品对每种重组JAK1、JAK2和JAK3蛋白的CI

用参比化合物(鲁索替尼和托法替尼)获得的结果符合预期。事实上，这两种化合物都强烈抑制JAK-STAT活性(最大抑制率为97％至100％，CI

头状胡枝子的地上部分的提取物显示对JAK1的强烈抑制(最大抑制为100％，CI

该测试证明，头状胡枝子提取物引起酪氨酸激酶活性的抑制(对JAK3具有更大的亲和力)，显示出促进毛发生长的令人关注的药理活性。

该实施例的目的是在毛囊的上皮外鞘的毛囊角化细胞模型(外根鞘(Outer RootSheath，ORS)模型)中证实头状胡枝子提取物对JAK-STAT信号传导通路的抑制活性。在该模型中，使用白细胞介素IL-6通过激活IL-6和GP130受体来活化JAK1/2-STAT3通路，所述IL-6和GP130受体均在该毛囊上皮鞘中表达。IL-6是一种细胞因子，作为毛发生长周期抑制剂。其在转基因小鼠模型中的过表达引起毛发生长延迟。此外，在雄激素性脱发中，IL-6在雄激素的影响下在真皮乳头细胞中过表达(Kwack等人,2012,J Invest Dermatology 132(1):43-9)。还报道IL-6延缓人的毛囊生长。

方法

在毛囊的上皮外鞘的毛囊角化细胞(外根鞘(ORS)模型)中进行研究。在96孔板中在合适的介质(来自CellnTech的CnT-PR)中培养角化细胞。二十四小时后，用碱性磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，并将介质替换成CnT-PR-H(用于原代人角化细胞的标准维持介质)。48小时后，将细胞用待测混合物(在DMSO中稀释的30和100μg/ml的头状胡枝子提取物)和参比化合物(在DMSO中稀释的5μM的鲁索替尼和托法替尼)处理1小时。所测试的头状胡枝子是根据本发明的实施例5制备的提取物。然后，进行100ng/ml的IL-6的刺激处理持续15分钟。

在来自n＝3个不同供体的细胞中测试所有条件。在n＝3个不同的实验中测试头状胡枝子提取物，在n＝6个实验中进行对照条件、刺激和参比化合物的测试。对于每个实验，生成三份数据。

通过评估STAT3蛋白的磷酸化程度来评估JAK活性。在检验方差的正态性和等效性后，通过参数检验进行统计分析，否则选择非参数检验。

结果

结果总结在下表5中。

Esm：平均值的标准误差；％inh：抑制的百分比。

用IL-6处理角化细胞引起STAT3磷酸化程度的显著增加。该增加达到16％，是统计学显著的(p<0.05)。参比化合物(在5μM测试的鲁索替尼和托法替尼)使STAT3磷酸化程度分别显著降低85％和104％，对于鲁索替尼p<0.05，对于托法替尼p<0.01。这些预期结果验证了此测试。

在两种浓度测试的头状胡枝子提取物均显著(对于两种浓度p<0.01)且非常明显地抑制由IL-6刺激诱导的STAT3磷酸化程度。

因此，发明人证明了头状胡枝子的地上部分的提取物在促进毛发再生中的价值。