一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用，所述NK滋养层细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L；所述CD19包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述CD86包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明构建的NK滋养层细胞对CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L的表达率高，各因子协同激活NK细胞的增殖能力，实现了体外诱导NK细胞分化成熟的效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是重要的免疫细胞，不仅是机体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线，而且具有免疫调节功能。临床研究发现，NK细胞过继性免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景。

现有的NK细胞培养方法主要包括因子诱导法、抗体包被法、专用NK培养基培养法和干细胞诱导法等。其中，因子诱导法为将外周血单个核细胞(PBMC)中的NK细胞培养于普通淋巴细胞培养基中，并加入细胞因子和/或饲养层细胞；抗体包被法是在抗体包被的培养瓶中用普通淋巴细胞培养基扩增培养PBMC或分选后的NK细胞；专用NK培养基培养法是采用专用的NK培养基从PBMC中特异性扩增NK细胞或分选后的NK细胞；干细胞诱导是将干细胞诱导分化成NK细胞，并进行扩增。

CN109628398A公开了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞，所述表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞经过冷冻干燥。该方法将饲养层细胞冷冻干燥后既保留了工程细胞作为饲养层细胞的刺激作用，又降低了细胞在灭活及保存过程中的成本，降低了实验室及临床使用中的成本并提高了其可使用的便利性，在12～21天的时间获得可满足临床治疗数量的NK细胞，细胞活力高，对K562及A549都有较高的杀伤效果。然而扩增和活化效率有待于进一步提高。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用，所述NK滋养层细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L，各因子协同激活NK细胞的增殖和杀伤功能，提高了NK细胞的扩增效率和体外分化成熟能力。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种NK滋养层细胞，所述NK滋养层细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L。

本发明中，膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L协同激活NK细胞的增殖能力，并使NK细胞长期稳定保持高效的扩增效率和显著的杀伤功能，实现了体外诱导NK细胞分化成熟的效果。

优选地，所述CD19包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHL。

优选地，所述CD86包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

MGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF。

优选地，所述IL-21通过与CD8α跨膜区形成IL-21-CD8α融合蛋白表达在所述NK滋养层细胞表面。

优选地，所述IL-21-CD8α包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSGSYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。

优选地，所述CD64包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4：

MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHVLFYLAVGIMFLVNTVLWVTIRKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGAT。

优选地，所述CD137L包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5：

MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE。

第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体用于制备第一方面所述的NK滋养层细胞。

优选地，所述表达载体包括：

第一表达载体，包括串联的CD19编码序列和CD86编码序列，CD19编码序列和CD86编码序列之间通过间隔序列连接；

第二表达载体，包括IL-21-CD8α编码序列；

第三表达载体，包括CD64编码序列；

第四表达载体，包括CD137L编码序列。

优选地，串联的CD19编码序列和CD86编码序列KCD19CD86如SEQ ID NO:6所示；

SEQ ID NO:6：

gccaccatgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtctcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttggaagcggagctaccaacttctccctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggccccgccaccatgggactgagtaacattctctttgtgatggccttcctgctctctggtgctgctcctctgaagattcaagcttatttcaatgagactgcagacctgccatgccaatttgcaaactctcaaaaccaaagcctgagtgagctagtagtattttggcaggaccaggaaaacttggttctgaatgaggtatacttaggcaaagagaaatttgacagtgttcattccaagtatatgggccgcacaagttttgattcggacagttggaccctgagacttcacaatcttcagatcaaggacaagggcttgtatcaatgtatcatccatcacaaaaagcccacaggaatgattcgcatccaccagatgaattctgaactgtcagtgcttgctaacttcagtcaacctgaaatagtaccaatttctaatataacagaaaatgtgtacataaatttgacctgctcatctatacacggttacccagaacctaagaagatgagtgttttgctaagaaccaagaattcaactatcgagtatgatggtattatgcagaaatctcaagataatgtcacagaactgtacgacgtttccatcagcttgtctgtttcattccctgatgttacgagcaatatgaccatcttctgtattctggaaactgacaagacgcggcttttatcttcacctttctctatagagcttgaggaccctcagcctcccccagaccacattccttggattacagctgtacttccaacagttattatatgtgtgatggttttctgtctaattctatggaaatggaagaagaagaagcggcctcgcaactcttataaatgtggaaccaacacaatggagagggaagagagtgaacagaccaagaaaagagaaaaaatccatatacctgaaagatctgatgaagcccagcgtgtttttaaaagttcgaagacatcttcatgcgacaaaagtgatacatgtttttaa。

优选地，所述IL-21-CD8α编码序列KIL21CD8α包括SEQ ID NO:7所示的核酸序列；

SEQ ID NO:7：

gccaccatgagatccagtcctggcaacatggagaggattgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaagattccggatcctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgctaa。

优选地，所述CD64编码序列KCD64包括SEQ ID NO:8所示的核酸序列；

SEQ ID NO:8：

gccaccatgtggttcttgacaactctgctcctttgggttccagttgatgggcaagtggacaccacaaaggcagtgatcactttgcagcctccatgggtcagcgtgttccaagaggaaaccgtaaccttgcattgtgaggtgctccatctgcctgggagcagctctacacagtggtttctcaatggcacagccactcagacctcgacccccagctacagaatcacctctgccagtgtcaatgacagtggtgaatacaggtgccagagaggtctctcagggcgaagtgaccccatacagctggaaatccacagaggctggctactactgcaggtctccagcagagtcttcacggaaggagaacctctggccttgaggtgtcatgcgtggaaggataagctggtgtacaatgtgctttactatcgaaatggcaaagcctttaagtttttccactggaattctaacctcaccattctgaaaaccaacataagtcacaatggcacctaccattgctcaggcatgggaaagcatcgctacacatcagcaggaatatctgtcactgtgaaagagctatttccagctccagtgctgaatgcatctgtgacatccccactcctggaggggaatctggtcaccctgagctgtgaaacaaagttgctcttgcagaggcctggtttgcagctttacttctccttctacatgggcagcaagaccctgcgaggcaggaacacatcctctgaataccaaatactaactgctagaagagaagactctgggttatactggtgcgaggctgccacagaggatggaaatgtccttaagcgcagccctgagttggagcttcaagtgcttggcctccagttaccaactcctgtctggtttcatgtccttttctatctggcagtgggaataatgtttttagtgaacactgttctctgggtgacaatacgtaaagaactgaaaagaaagaaaaagtgggatttagaaatctctttggattctggtcatgagaagaaggtaatttccagccttcaagaagacagacatttagaagaagagctgaaatgtcaggaacaaaaagaagaacagctgcaggaaggggtgcaccggaaggagccccagggggccacgtag。

优选地，所述CD137L编码序列包括SEQ ID NO:9所示的核酸序列；

SEQ ID NO:9：

gcccttccaccatggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctgccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaataa。

优选地，所述表达载体的空载体为pCDH。

第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第二方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的NK滋养层细胞的制备方法，所述制备方法包括：

将第二方面所述的表达载体和/或第三方面所述的重组慢病毒导入K562细胞的步骤。

本发明中，将包含CD19、CD86、IL-21、CD64和CD137L目的基因的慢病毒载体pCDH包装成为慢病毒，利用慢病毒转导的方式将CD19、CD86、IL-21、CD64和CD137L目的基因导入K562细胞中，并整合在K562细胞基因组中，构建NK滋养层细胞应用于NK细胞扩增领域，方法简便高效，实现了NK细胞的高效扩增。

第五方面，本发明提供了一种NK细胞培养基，所述NK细胞培养基包括第一方面所述的NK滋养层细胞。

优选地，所述NK细胞培养基还包括基础培养液。

优选地，所述NK细胞培养基还包括血清和/或抗生素。

优选地，所述抗生素包括硫酸庆大霉素。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的NK滋养层细胞、第二方面所述的表达载体、第三方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的NK细胞培养基中的任意一种或至少两种的组合在培养NK细胞中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用慢病毒载体pCDH构建表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L的NK滋养层细胞，方法简单，成功率高，构建的NK滋养层细胞对CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L的表达率高；

(2)本发明的NK滋养层细胞的各因子协同激活NK细胞的增殖能力，并使NK细胞长期稳定保持高效的扩增效率和显著的杀伤功能，实现了体外诱导NK细胞分化成熟的效果，在NK细胞扩增领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为NK细胞扩增倍数曲线。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1慢病毒载体构建

全基因合成串联的CD19编码序列和CD86编码序列KCD19CD86(SEQ ID NO:6)、IL-21-CD8α编码序列KIL21CD8α(SEQ ID NO:7)、CD64编码序列KCD64(SEQ ID NO:8)、CD137L编码序列(SEQ ID NO:9)，并在两端添加酶切位点BamHI/EcoRI或BamHI/NotI；

配制表1所示的酶切反应体系，将合成基因在30℃水浴1h、37℃水浴1.5h进行酶切处理后，连接入经相同限制性内切酶酶切的线性化慢病毒载体pCDH中；

表1

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为120V恒流电泳30min，将电泳产物切胶回收，并进行测序验证，发现成功构建pCDH-KCD19CD86、pCDH-KIL21CD8α、pCDH-KCD64和pCDH-CD137L慢病毒载体，可用于后续实验。

实施例2重组慢病毒包装和滴度检测

本实施例采用磷酸钙转染方法(Beyotime-Calcium Phosphate CellTransfection Kit，产品编号C0508)将慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒包装，并采用离心超滤方式(Millipore-Centrifugal Filter Units Amicn(R)Ultra-15，产品编号UFC910096，100kD)进行慢病毒的收集与浓缩，步骤如下：

(1)转染前24h，用0.125％胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞(细胞融合度为85～95％)，以含10％胎牛血清+1mg/mL双抗的完全培养基DMEM调整细胞密度并传代，重新接种于d15培养皿中，37℃、5％CO

(2)24h后，将细胞培养基更换为新鲜DMEM培养基；

(3)转染前1h，配制转染试剂，具体为：将约110μg DNA溶液(368μL)与1.84mLCaCl

(4)将DNA-氯化钙-BBS溶液平均并均匀滴加于293T细胞的培养液中，37℃、5％CO

(5)将收集的病毒上清滴加至无菌离心管中，冰浴10～15min，4℃、4500g离心5min，取上清用0.45μL滤器(预先用PBS浸泡2h)过滤，收集滤液进行洗涤浓缩，保存于-80℃。

本实施例进一步对重组慢病毒进行滴度检测，步骤如下：

(1’)将293T细胞接种于六孔板中，贴壁后融合度达到70％，将接种细胞计数为N(约4×10

(2’)细胞贴壁后6h，梯度加入不同体积的病毒液V(10、7.5、5、2.5μL)，流式检测各梯度病毒对细胞的侵染百分率，选择接近50％的侵染组，设侵染率为M；

(3’)根据以下公式计算病毒滴度。

T＝N×M/V×1000(TU/mL)

实施例3NK滋养层细胞的构建和鉴定

将3mL生长状态良好的K562细胞悬液接种在60mm培养皿内，按照MOI＝100:1的比例将包装好的重组慢病毒加入到K562细胞中，并加入polybrene(8μg/mL)，进行慢病毒转染，嘌呤霉素筛选得到表达CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L的K562，作为NK滋养层细胞；

取10

配制表2所示的反转录体系(20μL)，轻轻混匀后，25℃孵育10min、42℃孵育60min、85℃孵育5min终止反应，得到的cDNA进行PCR检测，引物如SEQ ID NO:10～19所示，体系如表3所示，条件如表4所示；

表2

CD19引物SEQ ID NO:10(上游)：gcggatccatgccacctcctcgcctcctctt；

SEQ ID NO:11(下游)：gcggccgctcacctggtgctccaggtgccca；

CD86引物SEQ ID NO:12(上游)：gcggatccatggacccccagt；

SEQ ID NO:13(下游)：ataagaatgcggccgcttaaaaacatgt；

IL-21引物SEQ ID NO:14(上游)：gctagcatgagatccagtcctggcaa；

SEQ ID NO:15(下游)：gcggccgcttagcagtaaagggtgataac；

CD64引物SEQ ID NO:16(上游)：ggtcagcgtgttccaagag；

SEQ ID NO:17(下游)：cagaggttctccttccgtga；

CD137L引物SEQ ID NO:18(上游)：gcccttccaccatggaatacgcctctgacgct；

SEQ ID NO:19(下游)：gcggccgcttattccgacctcggtgaagg。

表3

表4

对PCR扩增产物进行电泳检测，成功扩增出CD19、CD86、IL-21、CD64和CD137L条带。

实施例4NK滋养层细胞功能验证

(1)用生理盐水按体积比为2:1稀释脐带血，小心将稀释的7.5mL脐带血转移至15mL分离液中，1500rpm/min离心20min，离心管内出现明显的分层，吸出单个核细胞层的细胞悬液；

(2)用生理盐水洗涤单个核细胞，1700rpm/min离心10min，弃上清；

(3)加入5mL左右生理盐水，吹打混匀细胞，将多个离心管的细胞悬液转移到一个离心管内，并加入生理盐水至40mL，1000rpm/min离心10min，弃上清；

(4)将收集到的细胞用培养液悬浮，调整细胞浓度为(1～2)×10

分别于第4天、第7天、第11天、第14天、第18天、第21天、第25天、第28天取样进行计数。

NK细胞的扩增倍数曲线如图1所示，说明NK滋养层细胞促进了NK细胞的增长。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省华隆生物技术有限公司

<120> 一种表达细胞因子组合物的NK滋养层细胞及其制备方法和应用

<130> 20210121

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu

305 310

<210> 2

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu

20 25 30

Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val

35 40 45

Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu

50 55 60

Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr

65 70 75 80

Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile

85 90 95

Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr

100 105 110

Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala

115 120 125

Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn

130 135 140

Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro

145 150 155 160

Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr

165 170 175

Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp

180 185 190

Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met

195 200 205

Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile

225 230 235 240

Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val

245 250 255

Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn

260 265 270

Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln

275 280 285

Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala

290 295 300

Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp Lys Ser Asp

305 310 315 320

Thr Cys Phe

<210> 3

<211> 187

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met

1 5 10 15

Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln

20 25 30

Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln

35 40 45

Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro

50 55 60

Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln

65 70 75 80

Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile

85 90 95

Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala

100 105 110

Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr

115 120 125

Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu

130 135 140

Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asp Ser Gly Ser Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

165 170 175

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

180 185

<210> 4

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln

1 5 10 15

Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser

20 25 30

Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu

35 40 45

Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln

50 55 60

Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile

85 90 95

Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg

100 105 110

Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys

115 120 125

Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe

130 135 140

Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile

145 150 155 160

Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr

165 170 175

Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro

180 185 190

Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val

195 200 205

Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln

210 215 220

Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn

225 230 235 240

Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly

245 250 255

Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg

260 265 270

Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro

275 280 285

Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu

290 295 300

Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys

305 310 315 320

Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys

325 330 335

Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys

340 345 350

Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys

355 360 365

Glu Pro Gln Gly Ala Thr

370

<210> 5

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 6

<211> 1989

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccaccatgc cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc 60

aggcccgagg aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc 120

ctcaagggga cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt 180

aaacccttct taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg 240

gccatctggc ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag 300

ccggggcccc cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc 360

ggggagctgt tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac 420

aggtcctcag agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg 480

tgggccaaag accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac 540

agcctgaacc agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg 600

tcctgtgggg taccccctga ctctgtgtcc aggggccccc tctcctggac ccatgtgcac 660

cccaaggggc ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat 720

atgtgggtaa tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag 780

tattattgtc accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcca 840

gtactatggc actggctgct gaggactggt ggctggaagg tctcagctgt gactttggct 900

tatctgatct tctgcctgtg ttcccttgtg ggcattcttc atcttggaag cggagctacc 960

aacttctccc tgctgaagca ggccggcgac gtggaggaga accccggccc cgccaccatg 1020

ggactgagta acattctctt tgtgatggcc ttcctgctct ctggtgctgc tcctctgaag 1080

attcaagctt atttcaatga gactgcagac ctgccatgcc aatttgcaaa ctctcaaaac 1140

caaagcctga gtgagctagt agtattttgg caggaccagg aaaacttggt tctgaatgag 1200

gtatacttag gcaaagagaa atttgacagt gttcattcca agtatatggg ccgcacaagt 1260

tttgattcgg acagttggac cctgagactt cacaatcttc agatcaagga caagggcttg 1320

tatcaatgta tcatccatca caaaaagccc acaggaatga ttcgcatcca ccagatgaat 1380

tctgaactgt cagtgcttgc taacttcagt caacctgaaa tagtaccaat ttctaatata 1440

acagaaaatg tgtacataaa tttgacctgc tcatctatac acggttaccc agaacctaag 1500

aagatgagtg ttttgctaag aaccaagaat tcaactatcg agtatgatgg tattatgcag 1560

aaatctcaag ataatgtcac agaactgtac gacgtttcca tcagcttgtc tgtttcattc 1620

cctgatgtta cgagcaatat gaccatcttc tgtattctgg aaactgacaa gacgcggctt 1680

ttatcttcac ctttctctat agagcttgag gaccctcagc ctcccccaga ccacattcct 1740

tggattacag ctgtacttcc aacagttatt atatgtgtga tggttttctg tctaattcta 1800

tggaaatgga agaagaagaa gcggcctcgc aactcttata aatgtggaac caacacaatg 1860

gagagggaag agagtgaaca gaccaagaaa agagaaaaaa tccatatacc tgaaagatct 1920

gatgaagccc agcgtgtttt taaaagttcg aagacatctt catgcgacaa aagtgataca 1980

tgtttttaa 1989

<210> 7

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gccaccatga gatccagtcc tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc 60

ttcttgggga cactggtcca caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga 120

atgcgtcaac ttatagatat tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct 180

gaatttctgc cagctccaga agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgt 240

tttcagaagg cccaactaaa gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta 300

tcaattaaaa agctgaagag gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac 360

agactaacat gcccttcatg tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa 420

agattcaaat cacttctcca aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga 480

agtgaagatt ccggatccta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 540

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgctaa 570

<210> 8

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gccaccatgt ggttcttgac aactctgctc ctttgggttc cagttgatgg gcaagtggac 60

accacaaagg cagtgatcac tttgcagcct ccatgggtca gcgtgttcca agaggaaacc 120

gtaaccttgc attgtgaggt gctccatctg cctgggagca gctctacaca gtggtttctc 180

aatggcacag ccactcagac ctcgaccccc agctacagaa tcacctctgc cagtgtcaat 240

gacagtggtg aatacaggtg ccagagaggt ctctcagggc gaagtgaccc catacagctg 300

gaaatccaca gaggctggct actactgcag gtctccagca gagtcttcac ggaaggagaa 360

cctctggcct tgaggtgtca tgcgtggaag gataagctgg tgtacaatgt gctttactat 420

cgaaatggca aagcctttaa gtttttccac tggaattcta acctcaccat tctgaaaacc 480

aacataagtc acaatggcac ctaccattgc tcaggcatgg gaaagcatcg ctacacatca 540

gcaggaatat ctgtcactgt gaaagagcta tttccagctc cagtgctgaa tgcatctgtg 600

acatccccac tcctggaggg gaatctggtc accctgagct gtgaaacaaa gttgctcttg 660

cagaggcctg gtttgcagct ttacttctcc ttctacatgg gcagcaagac cctgcgaggc 720

aggaacacat cctctgaata ccaaatacta actgctagaa gagaagactc tgggttatac 780

tggtgcgagg ctgccacaga ggatggaaat gtccttaagc gcagccctga gttggagctt 840

caagtgcttg gcctccagtt accaactcct gtctggtttc atgtcctttt ctatctggca 900

gtgggaataa tgtttttagt gaacactgtt ctctgggtga caatacgtaa agaactgaaa 960

agaaagaaaa agtgggattt agaaatctct ttggattctg gtcatgagaa gaaggtaatt 1020

tccagccttc aagaagacag acatttagaa gaagagctga aatgtcagga acaaaaagaa 1080

gaacagctgc aggaaggggt gcaccggaag gagccccagg gggccacgta g 1131

<210> 9

<211> 776

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcccttccac catggaatac gcctctgacg cttcactgga ccccgaagcc ccgtggcctc 60

ccgcgccccg cgctcgcgcc tgccgcgtac tgccttgggc cctggtcgcg gggctgctgc 120

tgctgctgct gctcgctgcc gcctgcgccg tcttcctcgc ctgcccctgg gccgtgtccg 180

gggctcgcgc ctcgcccggc tccgcggcca gcccgagact ccgcgagggt cccgagcttt 240

cgcccgacga tcccgccggc ctcttggacc tgcggcaggg catgtttgcg cagctggtgg 300

cccaaaatgt tctgctgatc gatgggcccc tgagctggta cagtgaccca ggcctggcag 360

gcgtgtccct gacggggggc ctgagctaca aagaggacac gaaggagctg gtggtggcca 420

aggctggagt ctactatgtc ttctttcaac tagagctgcg gcgcgtggtg gccggcgagg 480

gctcaggctc cgtttcactt gcgctgcacc tgcagccact gcgctctgct gctggggccg 540

ccgccctggc tttgaccgtg gacctgccac ccgcctcctc cgaggctcgg aactcggcct 600

tcggtttcca gggccgcttg ctgcacctga gtgccggcca gcgcctgggc gtccatcttc 660

acactgaggc cagggcacgc catgcctggc agcttaccca gggcgccaca gtcttgggac 720

tcttccgggt gacccccgaa atcccagccg gactcccttc accgaggtcg gaataa 776

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcggatccat gccacctcct cgcctcctct t 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcggccgctc acctggtgct ccaggtgccc a 31

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcggatccat ggacccccag t 21

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ataagaatgc ggccgcttaa aaacatgt 28

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctagcatga gatccagtcc tggcaa 26

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcggccgctt agcagtaaag ggtgataac 29

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggtcagcgtg ttccaagag 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagaggttct ccttccgtga 20

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcccttccac catggaatac gcctctgacg ct 32

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gcggccgctt attccgacct cggtgaagg 29