香菇漆酶LeLac11及其在提高微生物耐胁迫能力中的应用

摘要

本发明公开了香菇漆酶LeLac11及其在提高微生物耐胁迫能力中的应用，所述的香菇漆酶LeLac11的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过将香菇漆酶LeLac11基因转入适合的微生物宿主体内，使宿主表达漆酶，提高宿主细胞的耐冷胁迫能力、耐热胁迫能力、耐盐胁迫能力、耐重金属铅和镉胁迫能力。本发明的香菇漆酶LeLac11来源于真菌，通过转入适合的微生物宿主中，能够提高宿主的耐胁迫能力。

说明书

技术领域

本发明属于氧化酶技术领域，涉及一种香菇漆酶LeLac11及其在提高微生物耐胁迫能力中的应用。

背景技术

香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)在分类学上属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、光茸菌科、香菇属。香菇属于木腐菌类，栽培生产需要木质素的降解提供充足的营养以供菌丝生长及子实体发育，并且属于中低温型食用菌，在30℃时菌丝生长速率显著下降(王波等.香菇菌株菌丝和子实体生长耐高温试验研究[J].吉林农业大学学报,2004,26(2):145-147)，高温直接导致香菇产量的减少和品质的下降。

漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，能催化联苯酚、多氨基苯等物质的氧化。漆酶的氨基酸序列同源性差异较大，但其催化位点的氨基酸序列较保守，参与底物识别和催化反应的核心结构类似，在DNA水平上，参与编码的核心蛋白质的序列具有相似性(季立才,胡培植.漆酶的结构、功能及其应用[J].氨基酸和生物资源,1996,18(1):25-29)。漆酶在植物中主要起到合成木质素的作用，而真菌分泌的漆酶作用相反，主要起降解木质素的作用，真菌漆酶具有更广泛的应用前景和价值(Zoppellaro G,Sakurai T,Huang H.A novel mixed valence form of Rhus vernicifera laccase and itsreaction with dioxygen to give a peroxide intermediate bound to thetrinuclear center[J].J Biochem,2001,129(6):949-953.)。漆酶在食用菌栽培中具有重要作用，与原料利用、菌体生长发育、子实体质量和产量以及抗杂菌污染等生理过程密切相关(张鹏,王延锋,潘春磊,等.食用菌漆酶生物学性质及其应用研究进展[J].生物技术通报,2014,(9):39-44；朱海潇.食用菌产漆酶能力的比较及漆酶性能的研究[D].福建农林大学,2008)。任鹏飞等通过分析香菇不同生长阶段酶活与农艺性状的相关性分析发现，漆酶活性与产量呈显著正相关(任鹏飞,任海霞,曲玲,等.香菇胞外酶活性变化及其与农艺性状的相关性分析[J].山东农业科学,2010,12:11-14.)。严培兰等发现漆酶活性高的黑木耳菌株，栽培产量高的同时，其抗霉能力也高(严培兰,高君辉,谭琦,等.黑木耳的抗霉能力、产量性状与不同胞外酶活的相关性[J].食用菌学报,1999,6(1):7-10.)。我国是食用菌产量和种类大国，具有明显的资源优势，食用菌漆酶的功能研究对于提高产量和菌种资源利用具有重要意义，同时也将为食用菌菌种的遗传改良提供参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香菇漆酶LeLac11及其在提高微生物耐胁迫能力中的应用。将该香菇漆酶LeLac11的核苷酸序列转入宿主体内，通过使宿主表达漆酶，提高宿主细胞的耐冷胁迫能力、耐热胁迫能力、耐盐胁迫能力、耐重金属铅和镉胁迫能力。

本发明的香菇漆酶LeLac11，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的香菇漆酶的编码基因LeLac11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供香菇漆酶LeLac11在提高微生物耐胁迫能力中的应用。本发明中所述的微生物可以为真菌或者细菌。在本发明具体实施方式中，采用的微生物为大肠杆菌。本发明所述的耐胁迫能力包括耐冷胁迫能力、耐热胁迫能力、耐盐胁迫能力、耐重金属铅和镉胁迫能力。

具体地，通过将含香菇漆酶LeLac11基因的表达载体转入到微生物宿主细胞中，提高微生物的耐胁迫能力。

在本发明的具体实施方式中，所述的含香菇漆酶LeLac11基因的表达载体为pET30a/LeLac11，通过将含香菇漆酶LeLac11基因的核苷酸片段与经BamH I和Hind III双酶切后的pET30a质粒连接构建得到。

在本发明的具体实施方式中，通过将含香菇漆酶LeLac11基因的表达载体pET30a/LeLac11转入到大肠杆菌中，提高大肠杆菌的耐冷胁迫能力、耐热胁迫能力、耐盐胁迫能力、耐重金属铅和镉胁迫能力。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过将香菇漆酶LeLac11基因转入适合的微生物宿主体内，使宿主表达漆酶，提高宿主细胞的耐冷胁迫能力、耐热胁迫能力、耐盐胁迫能力、耐重金属铅和镉胁迫能力。实验证明转入香菇漆酶LeLac11基因的大肠杆菌过量表达漆酶后，其耐胁迫能力得到显著提高。本发明的香菇漆酶LeLac11来源于真菌，能够转入适合的微生物宿主中，提高宿主的耐胁迫能力。

附图说明

图1为过表达载体pET30a图谱；

图2为香菇漆酶LeLac11的信号肽预测结果图；

图3为香菇漆酶LeLac11的磷酸化位点预测结果图；

图4为香菇漆酶LeLac11的跨膜结构预测结果图；

图5为香菇漆酶过表达载体pET30a/LeLac11的图谱；

图6为pET30a/LeLac11重组表达蛋白质产物的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1是蛋白质Marker；泳道2是未用IPTG诱导，含有pET30a空载体对照组大肠杆菌表达蛋白质产物的电泳图谱；泳道3是经IPTG诱导后，含有pET30a空载体对照组大肠杆菌表达蛋白质产物的电泳图谱；泳道4是未用IPTG诱导，含有pET30a/LeLac11重组质粒的大肠杆菌蛋白质的电泳图谱；泳道5是经IPTG诱导后，含有pET30a/LeLac11重组质粒的大肠杆菌蛋白质表达电泳图谱；

图7为冷胁迫(4℃)下，转入香菇漆酶LeLac11基因前后的大肠杆菌生长速率比较(注：*:P<0.05)；

图8为热胁迫(50℃)下，转入香菇漆酶LeLac11基因前后的大肠杆菌生长速率比较(注：*:P<0.05)；

图9为盐胁迫(6％NaCl)下，转入香菇漆酶LeLac11基因前后的大肠杆菌生长速率比较(注：*:P<0.05)；

图10为铅胁迫(20mg/L Pb)下，转入香菇漆酶LeLac11基因前后的大肠杆菌生长速率比较(注：*:P<0.05)；

图11为镉胁迫(1mg/L Cd)下，转入香菇漆酶LeLac11基因前后的大肠杆菌生长速率比较(注：*:P<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明以香菇菌株18为材料，通过香菇基因组构建本地数据库，经本地Blast找到香菇漆酶LeLac11基因保守序列，使用CE Design V1.04设计香菇LeLac11基因的引物，从香菇基因组DNA中扩增出LeLac11全基因片段，经PCR鉴定后，将目的片段与pET30a载体连接转化到大肠杆菌中，送交生工生物工程(上海)有限公司测序，片段长度为1596bp，如SEQ IDNO.2所示，编码531个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。

由生物信息学分析得知，香菇漆酶LeLac11氨基酸数量为531，蛋白质的分子量约为59.90kDa，等电点(pI,isoelectric point)为6.74；不稳定系数为44.35，属于不稳定蛋白质；亲水性系数(GRAVY)为-0.239，表明该蛋白质具有亲水性。利用SignalP 5.0对香菇漆酶LeLac11进行了信号肽的预测(图2)，结果表明该蛋白质信号肽的概率为0.0016，其他的概率为0.9984，初步判断此香菇漆酶LeLac11不存在信号肽，不属于分泌蛋白质。经NetPhos3.1软件预测得知(图3)，香菇漆酶LeLac11蛋白质的Ser磷酸化位点为28个，Thr磷酸化位点为14个，Tyr磷酸化位点为7个。经EMBnet Tmpred跨膜结构预测可知(图4)，TM螺旋长度在17到33之间，内侧向外侧螺旋2个跨膜结构，外侧向内侧螺旋3个跨膜结构，从预测结果可知香菇漆酶LeLac11是一个双向跨膜蛋白质，可能与膜定位和跨膜转运有关。

本发明将获得的香菇漆酶LeLac11基因序列，如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与表达载体pET30a连接构建得到原核表达载体pET30a/LeLac11，转入大肠杆菌中，经IPTG诱导进行异源表达，提取表达蛋白质经SDS-PAGE电泳分析，结果显示在55kDa-70kDa之间出现一条明显的蛋白质条带，与预期结果吻合。

本发明对过表达香菇漆酶LeLac11的大肠杆菌分别经低温胁迫(4℃)、热胁迫(50℃)、盐胁迫(6％NaCl)、重金属铅(20mg/L Pb)、重金属镉(1mg/L Cd)处理后，通过对大肠杆菌生长速率的测定，结果都表明，香菇漆酶LeLac11蛋白质的异源表达可显著提高大肠杆菌的耐冷、耐热、耐盐及耐重金属铅和镉胁迫的能力，分别如图7～图11所示。

l.试验材料

1.1大肠杆菌菌株：BL21菌株。

1.2载体

表达载体为pET30a(购买于擎科生物科技有限公司)，全长5422bp，携带有卡那霉素(Kan)抗性基因。

2.试剂

表1试剂及来源

3.仪器

表2仪器及来源

4.常用溶液的配制

4.1卡那霉素储存液：

将l g卡那霉素(Kan)溶解于10mL去离子水中，使终浓度达到100mg/mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。

4.2IPTG：

将IPTG配制成24mg/mL(100mM)的水溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。

4.3PBS缓冲液：

NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na

4.4电极缓冲液(Running Buffer)：

Tris 3.1g，甘氨酸18.8g，SDS 1g，加蒸馏水定容至1L。

实施例1香菇18中漆酶LeLac11过表达载体pET30a/LeLac11的构建

首先设计引物将目的基因LeLac11片段从原质粒上扩增下来，再通过引物两端所含无缝克隆识别位点将其重组到酶切后的过表达载体pET30a上；将连接产物转入制备好的大肠杆菌BL21的感受态细胞，对长出的单克隆菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定，比对正确的克隆序列即为构建成功的过表达质粒pET30a/LeLac11，构建成功后图谱如图5所示。

1.设计并合成引物

(1)设计PCR扩增片段引物，并在引物5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。

(2)将设计好的引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

引物序列5’to 3’如下：

LeLac11-F(SEQ ID NO.3)：

CGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCATGGACCCTTCAATTGACGAACAATCATGGGCACAAGACTGTCTGCCTGGAAATATGCAACC；

LeLac11-R(SEQ ID NO.4)：

GGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATAGTTCAACTGCTCGGACCGCTCTGTGCATTACAAGCCATTTCGCCGCAATTT。

2.载体pET30a的双酶切

(1)将含有pET30a载体的BL21菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5mL提取质粒。具体方法参考QIAGEN质粒小抽说明书。

(2)取1μg质粒，用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切。酶切体系如下：

于37℃酶切约3h。

(3)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg＝100μL来计算凝胶的体积，并加入1倍凝胶体积的Binging Solution置于65℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。

(4)将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s(重复一次)。然后弃掉管内液体，向柱内加入500μL的WA Solution，13000rpm离心30s。弃掉管内液体，再向柱内加入500μL的Wash Solution，13000rpm离心30s(重复一次)。然后空离心3min。将滤柱放置在一个新的1.5mL EP管中，室温晾干。最后在柱子内加入35μL的ddH

3.目的片段LeLac11的扩增

(1)将合成的引物稀释成终浓度为10μmol/L的储藏液。

(2)利用稀释的引物及模板进行PCR扩增。体系如下：

将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入PCR仪内，选择好合适的退火温度和延伸温度，即可开始PCR扩增。

(3)PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的基因。回收方法同上。

4.过表达载体pET30a与目的片段LeLac11的连接(无缝克隆)

(1)测定回收载体pET30a和目的片段香菇漆酶LeLac11的浓度。

(2)Hieff Clone

最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)

最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)

(3)过表达载体pET30a与目的片段LeLac11的连接。连接体系如下：

于50℃连接20min。

5.转化

(1)将感受态细胞BL21置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μL连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。

(2)之后于42℃水浴中热激90s。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。

(3)加入500μL不含抗生素的LB培养基，于37℃、225rpm振荡培养45min。

(4)在3000rpm下离心2min，弃掉900μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有100μg/mL Kan的培养皿中，用灭菌的涂布器涂匀(涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体)，于37℃恒温培养箱内倒置过夜培养。

6.送测

每个克隆挑选两个送擎科生物科技有限公司进行测序鉴定。经测序正确的菌液，按1:1的比例，向无菌的EP管加入浓度为15％的甘油和菌液，然后在-80℃的条件下保存。

实施例2香菇漆酶LeLac11基因的原核表达

1.接种含有pET30a/LeLac11的大肠杆菌BL21单菌落于100mL含有100μg/mL Kan的LB液体培养基中，在220rpm、37℃下培养至OD600达到0.6-0.8，然后使用浓度为1mM的IPTG加入到100mL液体LB中，在220rpm、37℃下继续培养4h，以达到优化诱导培养条件的目的。同时将空载体pET30a转化BL21作为对照。

2.提取原核表达蛋白质进行SDS-PAGE电泳

①蛋白质样品制备

(1)取1mL步骤1的菌液加到100mL含有100μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、220r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD 600达到0.4-0.6时，加入浓度为1mM的IPTG进行诱导；

(2)加入IPTG后，继续培养6h，将菌液转移到50mL无菌的离心管中，在4℃、5000r/min的条件下，离心10min；

(3)向无菌离心管中加入3mL的PBS，然后用枪头将菌体混匀，加入2.4μL ProteaseInhibitor Cocktail，保护蛋白质免受损伤；加入200μL裂解液，4℃静置30min；将破碎后的菌体，在4℃、8000r/min下离心10min；

(4)取离心后的上清50μL于无菌离心管中，加入12.5μL的5×蛋白质LoadingBuffer，金属水浴100℃中煮10min，放于-80℃中保存。

②SDS-PAGE凝胶电泳

(1)准备好玻璃板、电泳架、电泳槽等用清水冲洗干净，用滤纸将玻璃板擦拭干净，然后安装好电泳装置；

(2)确定凝胶的浓度，按照试剂盒配置胶，配制浓度为15％的分离胶和3％的浓缩胶；待凝固后插入梳子，置于37℃的恒温培养箱中30min，插入时应注意以免产生气泡；

(3)待浓缩胶固定后，将梳子拔出，然后用双蒸水清洗胶板，将胶板固定在电泳槽中，向上下电泳槽中注入现配制的电泳缓冲液，检验电泳槽是否有泄漏；

(4)按照次序，依次在上样孔中注入20μL的蛋白质样品；

(5)电泳时，浓缩胶电压为80V，分离胶电压为120V；

(6)电泳结束后，将胶置于干净的盒子中，加入考马斯亮蓝染液，染色60min；

(7)染色完毕后，将考马斯亮蓝染液置于回收瓶中；

(8)加入脱色液，覆盖凝胶表面，1h换次脱色液，直至凝胶透明，能够观察到清晰的蛋白质条带；

(9)对蛋白质凝胶拍照，然后进行结果分析。

电泳结果如图6所示，在55kDa-70kDa处出现一条明显的蛋白条带，其表达量显著高于空载体对照组，表明香菇LeLac11在大肠杆菌中异源表达成功。

实施例3香菇漆酶LeLac11耐冷功能的研究

1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到50mL LB(含100μg/mL Kan)液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导。

2.置于4℃的培养箱中，冷胁迫12h、24h、36h、48h、60h。

3.取冷胁迫处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。

4.以处理0h菌液OD600的吸光度作为对照，计算含pET30a/LeLac11大肠杆菌和含pET30a大肠杆菌的生长速率，制作冷胁迫后生长速率折线图(注：生长速率＝冷处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)，如图7所示。

由图7可以看出，在冷胁迫24h、36h、48h、60h时，含有pET30a/LeLac11大肠杆菌的生长速率，比含pET30a空载体大肠杆菌的生长速率分别提高了6.59％、6.69％、12.87％、13.00％；在冷胁迫12h以后，含有pET30a/LeLac11大肠杆菌的生长速率显著高于含pET30a大肠杆菌的(P<0.05)，表明香菇漆酶LeLac11基因的导入及表达确实显著提高了大肠杆菌BL21的耐冷性。

实施例4香菇漆酶LeLac11耐热功能的研究

1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到50mL LB(100μg/mL Kan)液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测，待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导。

2.置于50℃的培养箱中，热胁迫2h、4h、6h、8h、10h。

3.取热胁迫处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。

4.以处理0h菌液OD600的吸光度作为对照组，计算含pET30a/LeLac11大肠杆菌和含pET30a大肠杆菌的生长速率，制作热胁迫后生长速率折线图，如图8所示(注：生长速率＝热处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)。

由图8可以看出，在热胁迫过程中，含有pET30a/LeLac11的大肠杆菌生长速率比含pET30a空载体大肠杆菌的生长速率分别提高了22.07％、8.51％、8.23％、12.5％、13.84％；在整个热胁迫过程中，含有pET30a/LeLac11的大肠杆菌生长速率显著高于含pET30a大肠杆菌的，表明香菇漆酶LeLac11基因的导入及表达确实提高了大肠杆菌BL21的耐热性。

实施例5香菇漆酶LeLac11耐盐功能的研究

1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到50mL NaCl浓度为6％的LB(含100μg/mL Kan)液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导。

2.置于37℃的培养箱中，培养2h、4h、6h、8h、10h。

3.取盐胁迫处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。

4.以处理0h菌液OD600的吸光度作为对照，计算含pET30a/LeLac11大肠杆菌和含pET30a大肠杆菌的生长速率，制作盐胁迫后生长速率折线图，如图9所示(注：生长速率＝NaCl处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)。

由图9可以看出，在6％NaCl盐胁迫过程中，含有pET30a/LeLac11大肠杆菌的生长速率，比含pET30a空载体大肠杆菌的生长速率分别提高了8.81％、11.34％、13.58％、14.75％、15.46％；在盐胁迫整个过程中，含有pET30a/LeLac11大肠杆菌与含pET30a大肠杆菌的生长速率差异达到了显著性水平(P<0.05)，表明香菇漆酶LeLac11基因的导入及表达确实显著提高了大肠杆菌BL21的耐盐性。

实施例6香菇漆酶LeLac11耐重金属铅功能的研究

1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到50mL铅(Pb)浓度为20mg/L的LB(含100μg/mLKan)液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导。

2.置于37℃的培养箱中，培养2h、4h、6h、8h、10h。

3.取Pb胁迫处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。

4.以处理0h菌液OD600的吸光度作为对照，计算含pET30a/LeLac11大肠杆菌和含pET30a大肠杆菌的生长速率，制作铅胁迫后生长速率折线图，如图10所示(注：生长速率＝Pb处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)。

由图10可以看出，当20mg/L Pb胁迫2h后，含有pET30a/LeLac11大肠杆菌的生长速率，比含pET30a空载体大肠杆菌的生长速率分别提高了4.23％、5.53％、8.83％、7.71％，二者之间的生长速率差异达到了显著性水平(P<0.05)，表明香菇漆酶LeLac11基因的导入及表达确实显著提高了大肠杆菌BL21的耐铅胁迫能力。

实施例7香菇漆酶LeLac11耐重金属镉功能的研究

1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到50mL镉(Cd)浓度为1mg/L的LB(含100μg/mLKan)液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导。

2.置于37℃的培养箱中，培养2h、4h、6h、8h、10h。

3.取Cd胁迫处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。

4.以处理0h菌液OD600的吸光度作为对照，计算含pET30a/LeLac11大肠杆菌和含pET30a大肠杆菌的生长速率，制作镉胁迫后生长速率折线图，如图11所示(注：生长速率＝Cd处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)。

由图11可以看出，当1mg/L Cd胁迫过程中，含有pET30a/LeLac11大肠杆菌的生长速率，比含pET30a空载体大肠杆菌的生长速率分别提高了18.61％、23.12％、24.43％、33.42％、36.80％，二者之间的生长速率差异达到了显著性水平(P<0.05)，表明香菇漆酶LeLac11基因的导入及表达确实显著提高了大肠杆菌BL21的耐镉胁迫能力。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 香菇漆酶LeLac11及其在提高微生物耐胁迫能力中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 531

<212> PRT

<213> 香菇(Lentinula edodes )

<400> 1

Met Asp Pro Ser Ile Asp Glu Gln Ser Trp Ala Gln Asp Cys Leu Pro

1 5 10 15

Gly Asn Met Gln Pro Tyr Gln Leu Cys Leu Leu Phe Ile Arg Gly Ser

20 25 30

Leu Lys Ile Ser Ser Val Ser Ile Lys His Pro Ala Gly Asn Asn Ser

35 40 45

Gln Asp Gly Ala Ala Gly Val Thr Gln Cys Pro Ile Pro Pro Gly Ala

50 55 60

Asn His Thr Tyr Arg Val Tyr Leu Ser Ser Glu Gln Tyr Gly Thr Phe

65 70 75 80

Trp Tyr His Ser His Gln Ser Thr Gln Leu Ser Asp Gly Leu Phe Gly

85 90 95

Ala Leu Ile Ile His Pro Pro Ala Ser Leu Ala Glu Lys Ala Arg Pro

100 105 110

His Gln Asp Glu Leu Arg Ser Glu Arg Ser Leu Arg Tyr Arg Arg Thr

115 120 125

Ser Gln Ser Ser Ser Val Leu Asp Gln Val Met Leu Val Gly Asp Trp

130 135 140

Tyr His Arg Ser Gly Lys Glu Val Leu Asp Trp Tyr Gln Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser His Gly Asn Glu Pro Val Pro Asp Ala Ile Leu Asn Asn Gly Leu

165 170 175

Gln Val Phe Asn Cys Ser Lys Ser Ile Ala Lys Ile Ile Cys Asp Pro

180 185 190

Lys Gln Gly Arg Thr Pro Thr Phe Arg Leu His Pro Gln His Gln Asn

195 200 205

Ile Ile Arg Leu Ile Asn Pro Gly Ser Ile Ala Glu Ile His Ile Ser

210 215 220

Leu Asp Ser His Leu Phe Arg Val Ile Glu Ala Asp Gly Thr Pro Ile

225 230 235 240

Gln Pro Val Ile Val Lys Glu Ile Thr Ile Ala Pro Gly Gln Arg Tyr

245 250 255

Ala Leu Glu Val Val Arg Ala Asp Glu Gly Lys Tyr Asp Gly Phe Trp

260 265 270

Leu Arg Gln Arg Val Asn Tyr Glu Asp Phe Lys Tyr Pro Asn Val Ala

275 280 285

Leu Asp Leu Glu Ser Lys Ser Ile Val Thr Tyr Gly Pro Arg Arg Asp

290 295 300

Leu Asn Leu Pro Ser Ser Gln Ser Trp Ser Asp Ile Lys Ala Glu Glu

305 310 315 320

Arg Leu Asp Pro Leu Ser Leu Gln Pro Leu Asp Gln Ile Ala Arg Val

325 330 335

Leu Pro Pro Ala Asp Glu Thr Leu Met Met Tyr Val Thr Thr Met Ile

340 345 350

Arg Thr Ala Thr Gly Asn Arg Pro Phe Gly Tyr Ile Asn Gln Thr Thr

355 360 365

Trp Lys Pro Asn Leu Thr Asn Pro Ile Leu Ala Arg Asn Glu Phe Val

370 375 380

Ser Ser Ser Lys Glu Leu Ile Val Pro Val Asn Val Gly Asn Thr Ser

385 390 395 400

Asn Ser Ile Val Leu Asp Ile Ile Val Asn Asn Leu Glu Asp Gly Pro

405 410 415

His Pro Phe His Leu His Gly His His Phe Trp Pro Leu Tyr Thr Tyr

420 425 430

Glu Ala Val Met Gly Ala Gly Ser Tyr Lys Trp Glu Arg Pro Pro Thr

435 440 445

Leu Pro Thr Thr Ala Pro Ala Leu Arg Asp Thr Phe Val Ile Pro Ala

450 455 460

Lys Gly His Ala Ile Phe Arg Val Arg Phe Asp Thr Pro Gly Met Trp

465 470 475 480

Leu Phe His Cys His Val Leu Val His Leu Gln Ser Gly Met Ala Met

485 490 495

Ile Phe Asp Val Leu Ser Asp Leu Val Tyr Phe Phe Cys Val Ala Gly

500 505 510

Leu Gln Ile Ala Ala Lys Trp Leu Val Met His Arg Ala Val Arg Ala

515 520 525

Val Glu Leu

530

<210> 2

<211> 1596

<212> DNA

<213> 香菇(Lentinula edodes )

<400> 2

atggaccctt caattgacga acaatcatgg gcacaagact gtctgcctgg aaatatgcaa 60

ccataccagc tttgccttct tttcatcaga ggaagcctca agatttcatc tgtctccatc 120

aaacatccag ctggaaacaa ctcgcaagat ggggccgcgg gcgtaacaca atgtccaata 180

cctcctggtg caaatcacac ctatcgtgta tacctttcgt cggaacaata tggaaccttt 240

tggtatcact cccaccagtc tactcaatta tcagacggac ttttcggagc attgattatt 300

cacccacctg cttctcttgc cgaaaaagca cgacctcatc aggatgagct cagaagtgaa 360

cgatctctca gataccgtag aacgtctcag tcatccagtg tcttggacca agtcatgctt 420

gttggtgatt ggtaccatcg ctcagggaag gaagttttgg attggtatca aagtctgcgc 480

tcgcatggca atgagccagt cccggatgcc attctcaaca acgggcttca agttttcaac 540

tgctctaaga gtatcgccaa aatcatctgc gatcccaagc aaggtcgtac cccaacgttc 600

cgtttacacc ctcagcacca aaacatcata cgtctcatca atcccggctc tatagcagaa 660

attcacatat ctctcgattc ccatcttttc cgtgtgattg aagctgatgg gaccccaatt 720

cagcctgtga tcgtcaagga aataaccatc gcccctggtc agcgatacgc gctcgaagtt 780

gtccgcgctg atgagggcaa gtatgatgga ttttggctga gacaacgggt gaactacgag 840

gatttcaagt atccgaatgt tgctttggac ctcgagtcga agtccatcgt gacgtacggc 900

cctcgtcggg acttgaactt acctagcagc caaagttggt ccgatatcaa ggctgaagaa 960

cgtctcgatc cattatcact ccaacctctg gatcagatag ctcgcgtgct ccctcctgcg 1020

gacgagacct tgatgatgta tgtgacgaca atgattcgaa ctgcgacggg gaatagaccc 1080

tttggataca ttaaccaaac cacatggaaa ccaaatctaa caaatcccat tttggcaaga 1140

aacgagttcg tttcttcctc aaaagaactc atcgttcctg tcaatgtcgg aaatacgtcg 1200

aactccattg ttctggacat catcgtgaac aacctcgaag acggccccca tccttttcac 1260

ttgcacggac accatttctg gcctttgtac acatatgaag cggtaatggg ggcgggttcg 1320

tacaaatggg aacgaccgcc tactttacct acgactgctc cagctttgag ggatactttc 1380

gtcatcccag ccaaaggaca tgcaatattc agggtgagat tcgatacccc tgggatgtgg 1440

ttgttccatt gtcatgtgct ggtgcactta cagtcaggta tggctatgat atttgatgtt 1500

ctcagcgatc ttgtctactt cttttgtgtc gcgggcctcc aaattgcggc gaaatggctt 1560

gtaatgcaca gagcggtccg agcagttgaa ctatga 1596

<210> 3

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacaaggcc atggctgata tcggatccat ggacccttca attgacgaac aatcatgggc 60

acaagactgt ctgcctggaa atatgcaacc 90

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagctttc atagttcaac tgctcggacc gctctgtgca 60

ttacaagcca tttcgccgca attt 84