与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记及其获取和应用

摘要

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记及其获取和应用，该SNP分子标记通过采集大白猪耳样，提取DNA并进行质量检测，进行基因分型得到SNP分型数据，获得‑种与大白猪总乳头数相关的分子标记，该SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在序列的第101位碱基处存在一个A/G的等位基因突变，引起所示序列的核苷酸产生多态性，当该核苷酸序列上的第101位核苷酸为G时，大白猪有更多的总乳头数。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物标记技术和遗传育种领域，具体涉及一种与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记及其获取和应用。

背景技术

猪乳头数数量性状是种猪繁殖性能选育的重要指标之一，与产仔数和仔猪成活率具有较强的相关性(Wiesner E，Willer S.Problems of inverted nipples in swine[J].Monatshefte fur Veterinarmedizin，1978,33(5)：189-190.)。此外，有研究表明，大白猪美系和华系乳头数的变异系数分别为4.24％、4.18％，表明乳头数具有相对稳定的遗传性(赵宗胜，杨晶，李大全，等.新疆白猪及黑猪乳头数遗传特性的研究[J].中国畜牧杂志，1999，35(6)：31-33.)，以乳头数作为辅助性状进行繁殖性状选育具有可靠性。因此，通过猪乳头数性状选育来提高猪的产仔数和成活率对于提升养猪业的经济效益意义重大。

全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)是一种综合了遗传学、统计学和计算机科学，利用全基因组范围内筛选出的高密度的分子标记，对所研究的群体进行全基因组范围内的扫描，通过统计学方法分析扫描所得的分子标记数据与表型性状之间的关联，然后结合遗传学知识对表型性状的遗传变异或影响表型性状的相关候选基因进行分析鉴定的方法。近年来在畜禽育种及生产上被广泛应用(赵谦，浦亚斌，关伟军，赵倩君，马月辉.猪重要性状全基因组关联分析的研究进展[J].畜牧兽医学报，2015，46(06)：873-881.；王文浩，张涛，张跟喜，王金玉，李国辉，王永娟.京海黄鸡γ-干扰素水平的全基因组关联分析[J].中国畜牧兽医，2015，42(02)：245-250.)。

本专利使用488头大白猪耳样，提取DNA并进行质量检测，由GeneSeek Porcine50K SNP高密度芯片进行基因分型得到基因型数据，使用R语言的MVP包(X Liu etal.Iterative Usage of Fixed and Random Effect Models for Powerful andEfficient Genome-Wide Association Studies[J].Plos Genetics，2016，12(2)：e1005767.；Yin L，Zhang H，Tang Z，et al.rmvp：A memory-efficient，visualization-enhanced，and parallel-accelerated tool for genome-wide association study[J].bioRxiv，2020.)，结合MLM、GLM和FarmCPU模型，筛选出与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记，为大白猪总乳头数的选择和提高提供新的分子标记，对猪的育种具有重要意义。本发明通过高密度芯片对大白猪的总乳头数性状进行GWAS分析，筛选得到一种与大白猪总乳头数性状相关的SNP分子标记，该SNP分子标记与大白猪总乳头数显著相关，从而为后续种猪的选育及提高繁殖性能提供参考依据。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记及其获取和应用。本发明提供的SNP分子标记Affx-115258151，为国际大白猪参考基因组Sscrofa11.1版本7号染色体103221487个核苷酸位点，该位点碱基多态性为A或G。此外，本发明提供了检测该位点的上下游引物序列，以便进行高效检测。本发明通过优选该SNP分子标记的优势等位基因及对该位点的快速检测，能够筛选与大白猪总乳头数相关的SNP，为大白猪的遗传选育提供新的分子标记资源与标记辅助选择应用基础。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：

与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为Affx-115258151，其为国际大白猪参考基因组Sscrofa11.1版本7号染色体103221487个核苷酸位点，该位点碱基是A或G，对应位于核酸序列表SEQ ID NO：1第101位核酸位点。

本发明提供了用于扩增上述所述的SNP分子标记的引物或鉴定上述所述SNP分子标记的探针。

本发明提供了含有如上述所述引物或探针的试剂盒。

本发明提供了一种如上述所述的SNP分子标记在大白猪遗传育种中的应用。

本发明提供了一种应用上述所述的SNP分子标记选育/辅助选育高/低总乳头数性状的大白猪品种或品系的方法，所述方法是：提取大白猪的基因组DNA，检测7号染色体的第103221487位点的脱氧核苷酸，测出第103221487位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测大白猪的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的大白猪进行下一步的选种和/或育种，所述GG型基因的大白猪乳头总数远高于AA和AG型。

本发明提供了如上述所述的试剂盒在选育/辅助选育高总乳头数性状的大白猪品种或品系的用途。

本发明提供了一种获取与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记的方法，所述方法是：提取大白猪的耳组织的总DNA，对总DNA进行质量控制、分析得到基因型数据；统计大白猪的个体总乳头数数据作为表型，利用全基因组关联分析技术，获得与大白猪总乳头数性状显著关联的SNP；所述质量控制标准为：去除个体检出率≥90％，SNP检出率≥90％，最小等位基因频率≥0.05，哈迪-温伯格平衡p值≥10

其中，是第m个个体总乳头数性状原始表型值；u是群体均值；G

本发明的有益效果在于：

本发明筛选并确定影响大白猪总乳头数相关的SNP的分子标记，提供一种用于鉴定与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记以及试剂盒，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于大白母猪提高总乳头数的遗传改良中，从而可以快速准确地对大白猪进行选育，加快育种进程，提高后代大白猪的繁殖性能，提高企业利润，增加核心竞争力。

通过检测Affx-115258151标记基因型辅助选育多乳头数大白母猪，可通过选留GG纯合的核心群大白母猪，增加乳头总数，提高仔大白猪营养水平。

本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测大白猪的基因型，作为非诊断目的的评价大白猪的乳头数，与目前的PCR-RFLP等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。

附图说明

图1为本发明的曼哈顿图。附图标记说明：涉及大白猪总乳头数性状，黑色箭头指向标记的为本发明筛选的SNP分子标记Affx-115258151，该标记位于大白猪7号染色体上。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

1、表型-系谱数据采集

本实验的基础研究群体为大白母猪，来自广西股份有限公司分公司猪场。完整系谱中包含14个世代7342头大白猪，其中记录了2019-2020年间7342头大白猪左乳头数、右乳头数、脐前乳头数、小乳头数、瞎乳头数等表型数据。总乳头数计算公式：总乳头数＝左乳头数+右乳头数获得。对异常表型数据过滤后，共获得7342条总乳头数观测值用于表型与基因型关联分析。

2、基因分型与质量控制

(1)采集488头大白母猪的耳组织样品，提取DNA，并采用GGP 50k SNP(GeneSeek，US)芯片进行基因分型，获得覆盖全基因组的50697个SNP标记。

(2)对于所有位于18个常染色体上的SNP标记，利用Plink1.9软件进行质量控制，标准为：个体检出率≥90％；SNP检出率≥90％，最小等位基因频率≥0.05，哈迪-温伯格平衡p值≥10

基于以上质量控制标准，剩余482头和38823个SNP标记用于全基因组关联分析，其中482头大白猪既有总乳头数表型数据，也有基因型数据。

3、大白猪总乳头数全基因组关联分析

利用R统计环境下MVP软件包中的MLM模型、GLM模型、farmCPU进行GWAS分析,分别获取各种方法检测到的与总乳头数性状显著关联的SNP标记，取至少其中两种方法都有检测到的SNP标记作为候选SNP。

对于所有标记的p值，取-log10画曼哈顿图(图1)，结合MLM、GLM和farmCPU模型等三种分析方法，展示和筛选显著关联的SNP标记。

如图1所示，在大白猪中，第7号染色体中存在显著影响有效总乳头数的位点。

4、Affx-115258151分子标记分型结果与总乳头数关联分析

使用混合线性模型(MLM)进行Affx-115258151分子标记与美系大白猪总乳头数的关联分析。具体模型如下：

Y

其中，是第m个个体总乳头数性状原始表型值；u是群体均值；G

表1 Affx-115258151标记不同基因型对大白猪总乳头数的影响

表1说明：P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异极显著。

由表1可知，分子标记的第7号染色体上的Affx-115258151标记位点，GG型比AA型、AG型的平均总乳头数高，说明纯合子GG型对平均总乳头数是有利的。GG型较AA型、GG型较AG型均极显著，说明等位基因G对总乳头数是有利的。总乳头数是衡量大白猪繁殖性能的重要指标，总乳头数更高说明大白猪的繁殖性能更好。因此，淘汰AA基因型的大白猪可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰AA型的大白母猪，保留GG型、大白母猪，以逐代提高该位点的等位基因G的频率。

序列表SEQ ID NO：1是本发明筛选的与筛选与大白猪总乳头数关联的SNP分子标记Affx-115258151的上下游100bp核苷酸序列，核苷酸序列长度为201bp，在该序列的第101位碱基处的R处存在一个A/G的等位基因突变。该突变能引起SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列产生多态性。

实施例2：

根据上述实施例1筛选得到的基因结果，显示与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记Affx-115258151，该分子遗传标记位于大白猪的第7号染色体的第103221487核酸位点，该位置为一个G>A突变，对应位于核酸序列表SEQ ID N0.1的第101位核酸位点。

实施例3：

本领域技术人员很容易可参考根据本发明的分子遗传标记设计出用于扩增该分子标记的引物或鉴定所述分子标记的探针，从而用于该遗传标记的检测，例如通过PCR扩增得到所述分子遗传标记，再通过克隆测序得到相应的序列，或者通过Bsm-RFLP多态性进行检测。因此，本发明还包括用于扩增所述分子遗传标记的引物或鉴定所述分子遗传标记的探针，以及含有所述引物或探针的试剂盒。

实施例4：

可应用本申请的分子遗传标记辅助进行大白猪的育种或辅助育种工作，具体方法为：提取大白猪的基因组DNA，检测7号染色体的第103221487位点的脱氧核苷酸，测出第103221487位点的脱氧核苷酸为A或G；根据该位点基因型判断待测大白猪的基因型是AA型、AG或GG型；根据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的大白猪进行下一步的选种和/或育种。纯合子GG型的大白猪总乳头数高于AA型，因此，淘汰AA基因型的大白猪可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰AA型的大白母猪，保留GG型的大白母猪，以逐代提高该位点的等位基因G的频率。

由表1可知，平均每头GG型大白猪总乳头数比AA型高0.7个，若是10000头能繁殖的大白母猪每胎就能多哺乳7000头仔大白猪，这些仔猪直接育肥到100kg上市计算，按照85％的屠宰率估算，则一万头大白母猪就能够多提供595吨的长白猪肉，这将给企业带来巨大的经济收入和效应，增加了企业的核心竞争力。

上述说明是针对本发明较佳可行试验例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

序列表

<110> 广西扬翔农牧有限责任公司

广西扬翔猪基因科技有限公司

广西贵港秀博基因科技股份有限公司

贵港瑞康饲料有限公司

<120> 与大白猪总乳头数相关的SNP分子标记及其获取和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 猪属(Sus scrofa)

<220>

<221> misc_feature

<222> (101 )..( 101)

<223> r is a or g

<400> 1

tgaaaagaag caggaaatac caagaaacct tttttttttc ctccaaaaga tttcctggcc 60

acattgccag atttgactct aaaagtaaat tgtccacttc rgtgaaatat ttaaacgttt 120

tgtcttccct tccttcaaag gcaaactaag ctggtgaaga agcaagggta gggaagcttt 180

gcttggggta gggcacgaag g 201