用于两用青贮饲料贮存的异型发酵和同型发酵的乳酸细菌物种的改良组合物

摘要

本发明涉及一种青贮接种剂，所述青贮接种剂基本上由以下各项组成：a)至少一种专性异型发酵乳酸细菌菌种或菌株和b)至少一种同型发酵细菌菌种或菌株，所述同型发酵细菌菌种或菌株(i)不降低a)的生长，以及(ii)快速地降低pH而不产生过量的乳酸。本发明进一步涉及用于生产发酵饲料产品的方法，所述方法包括用根据本发明的青贮接种剂接种植物材料。已经令人惊讶地发现即使青贮饲料仅孵育多达2天或多达4天的时期所述青贮接种剂也是有效的。

说明书

本申请是申请日为2015年8月27日、申请人为科.汉森有限公司、发明名称为“用于两用青贮饲料贮存的异型发酵和同型发酵的乳酸细菌物种的改良组合物”的中国专利申请201580047684.3的分案申请。

技术领域

本发明提供了例如可用于青贮饲料生产和保存的改良的细菌接种剂组合物。在具体的实施方案中，所述组合物包含专性异型发酵物种(或其菌株)，诸如，乳杆菌属(Lactobacillus)物种，和同型发酵物种(或其菌株)，诸如乳球菌属(Lactococcus)或肠球菌属(Enterococcus)物种(或其菌株)。所述组合物可用于生产发酵饲料产品，诸如青贮饲料。因此，本发明还提供了包括用本文所述的细菌接种剂组合物接种植物材料的方法。在一些实施方案中，接种后的材料适用于短培养期，诸如2、3、4、5、6、7或8天的孵育时间。

背景技术

青贮饲料是可用于饲养反刍动物的发酵植物产品。青贮饲料可由各种植物材料制成，所述植物材料在厌氧条件下储存以促进厌氧发酵。可以加入细菌接种剂促进发酵过程和/或改良青贮饲料产品。通过建立厌氧条件和通过快速降低pH来保存青贮饲料，所述pH快速降低与土著菌或接种的乳酸菌产生有机酸有关。低pH抑制许多腐败菌生长，否则会导致丧失大量的营养物质。

当青贮饲料暴露于空气时，诸如当青贮仓、青贮窖、青贮堆或卷开放以便接近青贮饲料进行使用时，有氧条件可导致存在于青贮饲料中的任何需养腐败菌株生长。需氧腐败菌株的生长导致温度升高，营养成分高度损失。

因此，在发酵过程开始时的腐败和在催肥时的需氧腐败两者代表了农民的重大经济损失的来源。

第一代细菌青贮接种剂包括专性同型发酵细菌物种(例如，嗜酸乳杆菌(L.acidophilius)、唾液乳杆菌(L.salivarius))和兼性异型发酵(例如，植物乳杆菌(L.plantarum))细菌物种，其旨在快速降低pH以防止植物材料中天然存在的腐败菌株生长，所述腐败菌株如革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteraceae)(例如，沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella))或革兰氏阳性梭菌属(Clostridia)(酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、肉毒杆菌(C.botulinum)、产芽孢梭菌(C.sporogenes)、丁酸梭菌(丁酸梭菌))。通过快速降低pH来防止腐败菌株减少了营养素损失并往往在一定程度上提高有氧稳定性(Jatkauskas等人(2013),Jatkauskas和Vrotniakiene(2013))。

第二代细菌青贮接种剂关注于布氏乳杆菌(L.buchneri)，一种专性异型发酵物种，发现当青贮仓/青贮堆暴露于空气时，该菌在防止催肥时由需氧腐败菌种造成的需氧腐败方面有优势。然而，使用布氏乳杆菌作为细菌青贮接种剂的缺点在于相比于其它物种其具有较长的滞后期，且与专性同型发酵或兼性异型发酵物种相比，在发酵的早期阶段其生产的乙酸和乳酸不会快速降低pH。

来自Jatkauskas和Vrotniakiene(2013)的图1图示了就有氧稳定性(即，当再次暴露于空气时对于需氧腐败菌株而言使青贮仓升温所花费的时间)而言，单独布氏乳杆菌(P0)优于其它测试产品。在保持低温持续许多小时方面第二好的产品是专性异型发酵/兼性异型发酵/同型发酵组合产品，该产品包含布氏乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、(P1)，下一个最好的产品是纯兼性异型发酵/同型发酵产品，其含有植物乳杆菌、屎肠球菌、含有苯甲酸钠的乳酸乳杆菌(L.lactis)(P2a)或不含苯甲酸钠的乳酸乳杆菌(P2b)；兼性异型发酵/同型发酵产品，其含有植物乳杆菌、屎肠球菌、乳酸乳杆菌、(P3)；和兼性异型发酵产品，其含有植物乳杆菌的两个菌株，(P4)。(未接种的青贮饲料具有最低的有氧稳定性。)

因此，仍然存在对改良的细菌青贮接种剂组合物的需求。

发明内容

提供了例如可用于青贮饲料生产和保存的改良的细菌接种剂组合物。还提供了包括用本文所述的细菌接种剂组合物接种植物材料的方法。

在一些实施方案中，提供了青贮接种剂，所述青贮接种剂基本上由以下各项组成：(a)至少一种专性异型发酵乳酸细菌物种(或其菌株)和(b)至少一种同型发酵细菌菌种(或其菌株)，所述同型发酵细菌菌种(或其菌株)(i)不降低所述至少一种专性异型发酵乳酸细菌物种或菌株(a)的生长，以及(ii)快速地降低pH而不产生过量的乳酸。在一些实施方案中，至少一种专性异型发酵乳酸细菌物种(或其菌株)是选自由下列各项组成的组的明串珠菌属物种或乳杆菌属物种：短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)(或其菌株)。在一些实施方案中，专性异型发酵乳酸细菌物种(或其菌株)是保藏编号为DSM22501的布氏乳杆菌。在一些实施方案中，至少一种同型发酵细菌物种或菌株是肠球菌属(Enterococcus)，例如，屎肠球菌(Enterococcus faecium)。在一些实施方案中，至少一种同型发酵细菌物种或菌株是乳球菌属(Lactococcus)，诸如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，诸如保藏编号为DSM 11037的菌株。在具体的实施方案中，青贮接种剂基本上由布氏乳杆菌和乳球菌属组成。

在一些实施方案中，提供了生产发酵饲料产品的方法，包括用如本文所述的青贮接种剂接种植物材料。在一些实施方案中，所述植物材料与所述青贮接种剂孵育持续多达2天、或多达4天、或多达7天、或多达8天、或多达14天、或多达28天、或至少90天的时期。

附图说明

图1a

用组合物1(Δ)、组合物2(□)、组合物3(о)、组合物4(◇)和组合物5(X)接种的无菌青贮饲料培养基48h时间内的pH下降。起始接种为150,000CFU/ml，温度保持在30℃,n＝1。

图1b

用组合物1(Δ)、组合物2(□)、组合物3(о)、组合物4(◇)和组合物5(X)接种的无菌青贮饲料培养基48h时间内按mg/ml计的乳酸浓度。起始接种为150,000CFU/ml，温度保持在30℃,n＝1。

图1c

用组合物1(Δ)、组合物2(□)、组合物3(о)、组合物4(◇)和组合物5(X)接种的无菌青贮饲料培养基48h时间内按mg/ml计的乙酸浓度。起始接种为150,000CFU/ml，温度保持在30℃。

图2

用组合物2(□)、组合物4(◇)和组合物6

图3

在丹麦2011年收获的未接种(白色条)、用组合物4接种的(灰色条)或用组合物7接种的(黑色条)的玉米(小青贮窖1)的乙酸/乳酸比例。小青贮窖真空袋在25℃贮存直至7、28、61和88天后开放。

图4

在丹麦2012年收获的未接种

图5

具有2012年收获的玉米青贮饲料(小青贮仓2)的小青贮仓在7天的有氧刺激后的pH，包括4次观察结果的SEM。没有接种(白色条)、用组合物4接种(灰色条)或组合物5(点状条)。

图6

在丹麦2013年收获的未接种

图7

在丹麦2013年收获的未接种

图8

2013年收获的未接种

图9a

发酵7天和14天接着7天有氧刺激(分别为7+7和14+7)后未接种的(白色)、用组合物4接种(灰色)或用组合物7接种(黑色)的玉米青贮饲料(小青贮窖6a)中的有氧稳定性(小时)。

图9b

发酵2、4和8天接着7天有氧刺激(分别为2+7、4+7和8+7)后未接种的(白色)或用组合物4接种(灰色)的玉米青贮饲料(小青贮窖6b)中的有氧稳定性(小时)。

图10

发酵2、7和14天后未接种的(白色)、用组合物4接种(灰色)或用组合物7接种(黑色)的玉米青贮饲料(小青贮窖6a)中的酵母数目(cfu/g)。

图11

发酵2、7和14天后未接种的(白色)、用组合物4接种(灰色)或用组合物7接种(黑色)的玉米青贮饲料(小青贮窖6a)中的pH发展。

图12

在2014年收获的未接种(灰色正方形)或用组合物4接种的(黑色圆圈)的玉米在162小时(小青贮窖7a)内的累积气体产量。在x轴上是时间(h)，在y轴上是按ml/g新鲜饲草计的体积。

图13

对照和用组合物4接种的玉米(小青贮窖7b)之间气体产量的差异。在x轴上是时间(h)，在y轴上是按ml/g新鲜饲草计的体积。

图14

在162小时(小青贮窖7b)后的2014年收获的未接种的(白色)或用于组合物4接种(灰色)或用组合物7接种(黑色)的真空包装玉米的重量减轻百分比。

图15

2014年收获的真空包装玉米在发酵6天后气体发展的差异。没有接种(照片左手侧)或用组合物4(150,000CFU/g玉米，照片的右手侧)接种的饲草的真空包装袋。

具体实施方式

如上所述，本发明提供了例如可用于青贮饲料生产和保存的改良细菌接种剂组合物。在具体的实施方案中，所述组合物包含专性异型发酵物种(或其菌株)，诸如乳杆菌属物种，和同型发酵物种(或其菌株)，诸如乳球菌属或肠球菌属物种。所述组合物可用于生产发酵饲料产品，诸如青贮饲料。因此，还提供了包括用本文所述的细菌接种剂组合物接种植物材料的方法。在一些实施方案中，接种后的材料适合用于在短孵育期后使用。

定义

在描述本发明的上下文中(尤其是在下列权利要求的上下文中)，术语“一个”和“一种”和“该”以及类似指代物要被解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指示或与上下文明显抵触。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”要被解释为开放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)，除非另有说明。本文中数值范围的列举仅仅意在用作简略表达方法，分别指落入所述范围内的每个独立数值，除非本文中另有指示，且每个独立数值均并入本说明书中，如同它们单独列举在本文中一样。本文描述的方法的所有步骤可以以任何合适的顺序执行，除非本文另外指示或清楚地与上下文矛盾。对本文提供的任一和所有实施例，或示例性语言(例如，“诸如”)的使用，仅仅意在更好地说明本发明而不造成对本发明范围的限制，除非另外声明要求保护。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的要素作为实施本发明所必不可少的。

乳酸菌包括如乳球菌属、肠球菌属、酒酒球菌属(Oenococcus spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)、粪链球菌属(Streptococcus spp.)、明串珠菌属和乳杆菌属(Lactobacillus spp.)的菌属。它们可以分成三个亚组：专性异型发酵、兼性异型发酵和同型发酵。乳杆菌属的乳酸菌可以是兼性异型发酵或同型发酵的，取决于属物种(Vandamme等人，1996)。

专性异型发酵乳酸菌通过磷酸-葡糖酸途径将己糖发酵成乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳。专性异型发酵乳酸细菌物种的实例是明串珠菌属和乳杆菌属诸如短乳杆菌、布氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌。

另外，当葡萄糖有限时，兼性异型发酵乳酸菌可以将戊糖发酵成乳酸、乙酸、甲酸和乙醇。兼性异型发酵乳酸菌的实例是片球菌属、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、清酒乳酸菌(Lactobacillus sake)。

同型发酵乳酸菌定义为主要是通过Embden-Meyerhof途径将己糖降解为乳酸的细菌。同型发酵乳酸菌的实例为乳球菌属、肠球菌属和乳杆菌属诸如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。

市场上的许多产品兼具高产乳酸兼性异型发酵/同型发酵菌株与布氏乳杆菌。然而，本发明人发现，这种组合的细菌没有实现最佳可能的有氧稳定性(即，不会促进在催肥时维持环境温度)。尽管不希望受理论的束缚，本发明人相信，这种组合的细菌减少了布氏乳杆菌的生长和/或产生大量乳酸，所述大量乳酸可被需氧腐败菌株利用，从而在暴露于空气中时启动青贮饲料变质。根据一些实施例，本文描述的接种剂通过将专性异型发酵物种(例如，布氏乳杆菌)与快速降低pH而不产生过量乳酸的细菌物种(例如，乳球菌属和肠球菌属)组合来解决了该问题。这种选择的同型发酵物种不抵消专性异型发酵物种的正效应，或至少仅很少程度地抵消。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了青贮接种剂，所述青贮接种剂基本上由至少一种专性异型发酵乳酸细菌物种和至少一种同型发酵细菌物种组成，所述至少一种同型发酵细菌物种优选地不降低专性异型发酵乳酸物种的生长并且优选地快速降低pH而不产生过量的乳酸。

“基本上由……组成”意指青贮接种剂仅包含特定的细菌作为活性成分并且不包含其他一种或多种活性成分诸如任何其他细菌、酶、有机酸、苯甲酸钠、硝酸钠或六亚甲基四胺。如本文所述的基本上由特定的细菌组成的接种剂不包含植物乳杆菌。

术语“至少一种”意指所述接种剂组合物可以包含一种、两种、三种、四种、五种或甚至更多种不同的专性异型发酵乳酸细菌物种和一种、两种、三种、四种、五种或甚至更多种不同的同型发酵细菌物种。

在具体的实施方案中，同型发酵细菌物种或菌株不降低专性异型发酵乳酸细菌物种或菌株的生长。这个特性可以通过使同型发酵菌株和专性异型发酵乳酸菌株在Mann-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基中在37℃过夜生长，将待测试的同型发酵细菌物种或菌株和专性异型发酵乳酸细菌物种或菌株两者在相同的MRS琼脂板上在基本上相同的时间划线，然后将该琼脂板在厌氧条件下在37℃孵育过夜来测试。如果专性异型发酵乳酸菌的生长被抑制至少5mm，则测试的同型发酵物种或菌株不具有此所需的特性。如果青贮接种剂包含多于一种专性异型发酵乳酸细菌物种或菌株或多于一种同型发酵物种或菌株，可以测试所有相关的组合。

通过这样的测试，已经发现同型发酵物种乳酸乳杆菌的产乳酸链球菌肽菌株诸如乳酸乳杆菌NCIMB 30117和乳酸乳杆菌ATCC 11454抑制布氏乳杆菌DSM 22501，而不产生乳酸链球菌肽的乳酸乳球菌DSM 11037和屎肠球菌DSM 16656不抑制布氏乳杆菌DSM 22501。

尽管不希望受理论的束缚，这些结果表明只有乳酸乳杆菌物种的产乳酸链球菌肽同型发酵菌株抑制专性异型发酵物种或菌株，并且不产生乳酸链球菌肽的产细菌素同型发酵物种或菌株不抑制专性异型发酵物种或菌株。因此，如果至少一种同型发酵细菌物种或菌株不产生乳酸链球菌肽，则该同型发酵细菌物种或菌株不降低至少一种专性异型发酵乳酸细菌物种的生长的要求可以被满足。因此，在具体实施方案中，同型发酵物种或菌株为不产生乳酸链球菌肽的产细菌素同型发酵物种或菌株，尽管如上所述的直接筛选可以识别表现出这种性质的其他菌株。在具体的实施方案中，本发明涉及一种青贮接种剂，其基本上由以下各项组成：至少一种专性异型发酵乳酸细菌物种(或其菌株)和至少一种同型发酵细菌物种(或其菌株)，所述同型发酵细菌物种(或其菌株)(i)不产生乳酸链球菌肽，以及(ii)快速地降低pH而不产生过量的乳酸。

在具体的实施方案中，同型发酵细菌物种或菌株快速降低pH值，而不会产生过量的乳酸。如上所述，快速降低pH可通过抑制腐败微生物诸如梭状芽孢杆菌(Clostridia)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、酵母和霉菌的生长来抑制在青贮饲料生产早期阶段中的腐败。腐败微生物可导致营养素流失，病原微生物的生长，和异味，所述异味使得青贮饲料对于用其饲养的动物，诸如反刍动物是不可口的。

如本文中所使用，“快速降低pH而不产生过量的乳酸的物种或菌株”定义为在10ml无菌青贮饲料培养基中含有150,000CFU/ml所述菌株的管的30℃水浴中在接种24小时后产生不超过3mg/ml乳酸的物种或菌株，所述无菌青贮饲料培养基通过下列步骤制备：将5g/L酵母提取物(Oxoid L21)、5g/L大豆中和的蛋白胨(Oxoid LP0044C)、0.8g/L可溶性淀粉(Merck 1252)、0.08g/L二水合硫酸锰(II)(Sigma M-1114)、0.037g/L琥珀酸(assay lab)、0.069g/L柠檬酸一水合物和0.14L-苹果酸(Merck 244)在900mL Milli Q水中混合直至溶解，调整pH值至6.3，分配给奶瓶并在121℃高压灭菌15分钟，然后加入100ml含有下列的无菌过滤的糖溶液：56g/L D(-)果糖(Merck 4007)、32g/L D(+)葡萄糖一水合物(Merck8342)、20g/L D(+)木糖(Merck 8689)、20g/L L(+)阿拉伯糖(Aldrich A9,190-6)、和32g/L蔗糖(Merck 7651)。

根据一个实施方案，所述青贮接种剂包含至少一种专性异型发酵乳酸细菌物种或菌株，所述至少一种专性异型发酵乳酸细菌物种是选自由下列各项组成的组的明串珠菌属物种或乳杆菌属物种：短乳杆菌、布氏乳杆菌、发酵乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。在具体实施方案中，所述专性异型发酵乳酸细菌物种或菌株是布氏乳杆菌。被预期可用于本发明中的布氏乳杆菌的实例是布氏乳杆菌KKP.907、布氏乳杆菌DSM 22963、布氏乳杆菌NCIMB 40788、布氏乳杆菌NCIMB 30139、布氏乳杆菌DSM 16774、布氏乳杆菌DSM 22963、布氏乳杆菌DSM12856。在具体实施方案中，布氏乳杆菌是保藏编号为DSM 22501的布氏乳杆菌菌株。

在一些实施方案中，所述青贮接种剂包含至少一种快速降低pH而不产生过量乳酸的细菌物种或菌株，所述细菌菌株是肠球菌属诸如屎肠球菌。被预期可用于本发明中的肠球菌的实例是屎肠球菌NCIMB 10415、屎肠球菌CNCM I-3236、屎肠球菌BIO 34和屎肠球菌DSM 16573。

在其他实施方案中，所述青贮接种剂包含至少一种快速降低pH而不产生过量乳酸的细菌物种或菌株，所述细菌菌株是乳球菌属诸如乳酸乳球菌。在具体实施方案中，所述乳酸乳球菌是保藏编号为DSM 11037的菌株。

因此，在一些实施方案中，所述青贮接种剂基本上由布氏乳杆菌菌株和肠球菌属菌株组成，所述肠球菌属菌株不降低专性异型发酵乳酸细菌物种(或菌株)的生长并且快速降低pH而不产生过量乳酸。在其他实施方案中，所述青贮接种剂基本上由布氏乳杆菌菌株和乳球菌属菌株组成，所述乳球菌属菌株不降低专性异型发酵乳酸细菌物种(或菌株)的生长并且快速降低pH而不产生过量乳酸。

本发明还提供了用于生产发酵饲料产品，诸如青贮饲料的方法，所述方法包括用如本文所述的细菌青贮接种剂接种植物材料。已经令人惊奇地发现本文所述的青贮接种剂能够提供非常快速的效果。即，用如所述的细菌青贮接种剂接种的材料可适合于在短孵育期后使用，诸如仅2、3、4、5、6、7或8天的孵育期。因此，在一些实施方案中，所述方法包括在将青贮饲料暴露于空气之前(诸如通过打开青贮仓)，将植物材料与如本文所述的青贮接种剂孵育多达2天、或多达4天的时期。然而，植物材料还可以孵育更长时期，诸如多达7天、多达8天、多达14天或多达28天或甚至更长，诸如至少60天或至少90天的时期，后者是用于测试青贮接种剂效果的常规时期。

如上所述，在具体实施方案中，本文所述的细菌青贮接种剂可以在青贮过程的开始时实现快速的pH降低，同时维持在催肥时的高有氧稳定性。即，本文所述的细菌青贮菌剂可以表现出快速的初始发酵，所述快速的初始发酵减少干物质(DM)损失和发酵的早期阶段中的腐败，且还可以获得与利用专性异型发酵菌株诸如单独布氏乳杆菌接种相同或相当的有氧稳定性。因此，本文所述的接种剂与仅含有同型发酵或/和兼性异型发酵菌株的产品相比实现更好的有氧稳定性，尽管它们的有氧稳定性可能不如单独利用专性异型发酵布氏乳杆菌所实现的有氧稳定性那样好。

保藏的菌株

一个植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株已经由丹麦的Chr.Hansen A/S保藏在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心,Inhoffenstrasse 7B,D-38124布伦瑞克)，保藏编号为DSM 16568，保藏日为2004年7月13日。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件做出的。

一个布氏乳杆菌菌株已经由丹麦的Chr.Hansen A/S保藏在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心,Inhoffenstrasse 7B,D-38124布伦瑞克)，保藏编号为DSM 22501，保藏日为2009年4月22日。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件做出的。

一个屎肠球菌菌株已经由丹麦的Chr.Hansen A/S保藏在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心,Inhoffenstrasse 7B,D-38124布伦瑞克)，保藏编号为DSM 22502，保藏日为2009年4月22日。该保藏是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件做出的。

对于上面标识的经保藏的微生物，适用下列附加的指示：关于各个指定国家的各个专利局，本申请人请求上面提到的保藏的微生物的样品仅可由请求人提名的专家获得直到本专利授权日或本申请已经被驳回或撤回或视为撤回之日为止。

乳酸乳杆菌菌株DSM 11037已经在1996年6月26日由丹麦的Chr.Hansen A/S保藏在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心,Inhoffenstrasse 7B,D-38124布伦瑞克)，并在已授权专利EP 928333中提到。

下面借助于非限制性实施例描述本发明的实施方案。

实施例

实施例1–无菌体外分批培养

在两个单独的试验装置中使用用来模拟草的碳水化合物组成的含有不同的碳水化合物源的无菌青贮饲料培养基来测试同型发酵菌和异型发酵乳酸菌的单一菌株和组合产品。测量随时间变化的pH和有机酸含量。所述培养基含有5g/L酵母提取物(Oxoid L21)、5g/L大豆中和的蛋白胨(Oxoid LP0044C)、0.8g/L可溶性淀粉(Merck 1252)、0.08g/L二水合硫酸锰(II)(Sigma M-1114)、0.037g/L琥珀酸(assay lab)、0.069g/L柠檬酸一水合物和0.14L-苹果酸(Merck 244)，将它们混合在900mL Milli Q水中直至溶解。将pH调整至6.3并分配至奶瓶中并在121℃高压灭菌15分钟。高压灭菌后，加入含有56g/L D(-)果糖(Merck4007)、32g/L D(+)葡萄糖一水合物(Merck 8342)、20g/L D(+)木糖(Merck 8689)、20g/L L(+)阿拉伯糖(Aldrich A9,190-6)和32g/L蔗糖(Merck 7651)的100ml无菌过滤的糖溶液以获得最终的青贮饲料培养基。在试验1和2中，均使用无菌青贮饲料培养基并用表1中概述的各种不同的接种剂组合物接种。

表1在两个体外分批培养研究中使用的菌株组合物

试验1

将10ml接种了表1中的各种接种剂组合物的青贮饲料培养基分配到11个无菌试管中的每个中并保持在30℃水浴中。在0、2、4、6、7、8、9、11、14、24和48小时后，取出样品进行挥发性有机酸(VFA)和乳酸分析和pH监测。使用手持pH计监测pH，而挥发性有机酸在HPLC(Dionex)上进行分析。

试验2

就青贮饲料培养基、接种水平和温度而言试验2类似于试验1。组合物2、4和6用作接种剂。使用自动pH-计，72h后在HPLC(Dionex)上测量乙酸、乳酸和甲酸。

结果

试验1和2的结果显示了各种接种剂组合物对pH的作用，并且在图1a、b、c和图2以及表2中提供了有机酸含量。

图1a示出了来自试验1的pH随时间的变化。组合物2非常缓慢地降低pH。组合物1和组合物3降低pH更快并且在14小时之后pH低于5.0，而组合物2仍然具有高于6.0的pH。组合物4与组合物3一样快地降低pH。组合物5产生的pH曲线非常类似于组合物1。

图1b示出来自试验1的乳酸浓度随时间的变化。24小时后，组合物1产生比组合物2、组合物3或组合物4多得多的乳酸。48小时后，组合物1的乳酸浓度大于8mg/ml，相比组合物2、组合物3或组合物4为4mg/ml或更低。组合物5产生的乳酸浓度非常类似于组合物1。

图1c示出来自试验1的乙酸浓度随时间的变化。48小时后，组合物2的乙酸浓度超过2mg/ml，组合物1和组合物3产生小于0.5mg/ml的乙酸。48小时后，组合物4产生1mg/ml的乙酸，而组合物5产生小于0.5mg/ml的浓度。

图2示出来自试验2的pH随时间的改变。再次组合物2非常慢地降低pH。组合物4降低pH则快得多，并且在15小时后pH低于4.5，而组合物6仍然具有6.0以上的pH。组合物6与组合物4相比产生稍慢的pH下降。然而，pH继续快速地降低并且在18小时后pH已经低于4.0。在72小时后，组合物2和组合物4的pH分别达到3.6和3.7，而组合物6则低至3.2。

表272小时后接种的无菌青贮饲料培养基的有机酸产量(试验2)

表2示出利用组合物6(其含有布氏乳杆菌DSM 22501和植物乳杆菌DSM16568)强烈地减少乙酸产量，与组合物4(其含有布氏乳杆菌DSM 22501和乳酸乳球菌DSM 11037)形成对照。组合物6还示出72小时后的高乳酸浓度。与组合物6相比，组合物4不仅具有高得多的乙酸浓度，还具有高浓度的甲酸。

实施例2–小青贮窖中的有氧稳定性

小青贮窖1、2和3–丹麦2011、2012和2013年收获的玉米

建立5个不同的小青贮窖试验以测试各种不同的青贮接种剂组合物。在丹麦用在2011年(小青贮窖1)、2012(小青贮窖2)和2013(小青贮窖3)从三个不同的农场收获的玉米建立三个试验，并在立陶宛在2013年使用玉米和红三叶草:梯牧草:羊茅草皮(60:30:10)(小青贮窖4和5)进行两个试验。使用的接种剂和应用比率的概述列在表3中。

表3在小青贮窖研究中使用的菌株组合物

对于小青贮窖1，玉米在日德兰半岛西南收获。到实验室的运输时间为4小时。之后，将玉米在户外储存过夜，然后在-20℃冷冻。在接种的时间，将玉米解冻1-2小时，然后保持在4-5℃的冰箱中。将接种剂悬浮在自来水中，并填充到喷雾瓶中。用于每次处理的目标剂量为150,000CFU/g玉米，并基于组合物的实际效力计算到达目标接种剂量所需的量。将1000g玉米一次一点地称入塑料袋使得接种剂可以均匀地喷洒到玉米上。然后将袋振荡以确保接种剂在袋中的均匀分布。然后对每个时间点(7、28、61和88天)，将1000g接种的玉米分配给五个Alubag，每个Alubag 200g。真空包装的Alubag储存在25℃。

每次处理在不同的时间点打开五个Alubag。然后测定样品的小有机酸。

对于小青贮窖2，从丹麦西兰中部的农场收集刚收获的玉米，并直接运输到实验室。在小青贮窖设置中测试表3中列举的5种不同的处理以及对照组。将接种剂悬浮在自来水中，并填充到喷雾瓶中。用于每次处理的目标剂量为150,000CFU/g玉米，并基于产品的实际效力计算到达目标接种剂所需的量。将1000克玉米一次一点地称入袋使得接种剂可以均匀地喷洒到玉米上。在将袋振荡以确保接种剂在袋中的进一步分布后，将所述袋真空包装。准备每次处理的4个袋，并在25℃保存用于三个月后的进一步分析。3个月后，使用已经保存在真空袋中的青贮饲料建立有氧稳定性研究。将青贮饲料分配在其中温度传感器位于中间的容器(顶部开口且在底部有孔的塑料瓶)中，所述容器置于聚苯乙烯凹穴中，用大的塑料板遮盖，并且在室温保存。监测7天的时期内暴露于空气后每个单个样品的温度。

对于小青贮窖3，从西兰东北部的农场收集刚收获的玉米。程序与对小青贮窖2所述的相同，不同之处是在仅2周后进行有氧稳定性研究。

小青贮窖1、2和3的结果

在不同时间点小青贮窖1的青贮饲料中乙酸与乳酸的比率显示在图3中。与组合物7相比在7天后和28天后未接种的对照中乙酸与乳酸的比例较高。然而，在88天后，与对照相比，组合物7具有高的乙酸与乳酸比率。从第7天开始组合物4具有高的乙酸与乳酸比率，该比率随着时间增加。所有样品的平均pH在所有时间点均低于4.0。

小青贮窖2的结果显示在图4中。可以看出在78小时后，未接种的对照青贮饲料的温度高于环境温度超过3℃，而组合物5在96小时后升温高于环境温度3℃。在测量的所有162小时期间，组合物4均保持玉米青贮饲料稳定。如图5中所示，在162小时后，对照的pH平均为6.74,而用组合物5处理的青贮饲料的平均pH为5.67，且组合物4的平均pH为4.05。

对于小青贮窖3，在储存后打开的真空包装的未接种的青贮饲料在93小时后不稳定，而用组合物2接种的青贮饲料稳定持续整个160小时，且用组合物4接种的青贮饲料稳定持续129小时(图6)。

小青贮窖4和5–玉米和草/三叶草收获物2013，立陶宛

对于小青贮窖4，玉米(Zea mays L.)在谷物成熟的蜡熟期收获。玉米的干物质(DM)浓度为38.85％，水溶性碳水化合物浓度为2.54％。在农场条件下通过饲料收割机将玉米切碎成长度为约2cm的片。

对于小青贮窖5，收获含有60％红三叶草、30％梯牧草和10％羊茅草皮的草三叶草混合物并将其干燥为32.8％的干物质。此饲草混合物被称作草/三叶草混合物。水溶性碳水化合物含量为20.3g/kg DM(2.03％新鲜饲草)。在农场条件下通过饲料收割机将草/三叶草混合物切碎成长度为2-3cm的片。

对于小青贮窖4和小青贮窖5两者，取5个代表性样品(每个>500g)用于两种饲草的营养价值分析和处理。将饲草在聚乙烯袋中运输至实验室。在从作物准备起0.5h内开始实验室实验。取枯萎和切碎的牧草的500g代表性样品进行营养价值、缓冲容量、硝酸盐和微生物组成分析。在玉米和草/三叶草饲草试验中使用相同的青贮接种剂和程序。

青贮接种剂在其应用之前即刻悬浮在蒸馏水中，目标是达到如表3中所述的剂量。对于每个处理一式五份地进行。根据表3中所述的剂量和产品的实际细菌浓度计算产品的应用率。当稀释产品时使用不含氯的水。使用相同体积的蒸馏水替代对照处理中的悬浮液(用于自然发酵)。在接种后，用1.80-1.84kg新鲜的作物将3升玻璃广口瓶相等地填充至每5升体积1kg DM。填充后15分钟将广口瓶用盖子封闭。在实验期间在发酵过程中产生的气体用排气孔释放。在玻璃广口瓶中在20℃的恒定温度储存90天后，进行化学物质和微生物分析。

为了测量青贮饲料的有氧稳定性，监测青贮饲料内部的温度持续10天。为此，将热电偶线插入到青贮饲料样品的中点，所述青贮饲料样品放置在开放的聚苯乙烯盒中。盒的顶部和底部包含2cm直径的孔以允许空气进入和CO

表4分析方法

*在喷雾后立即和在填充青贮窖时收集5个用于分析的牧草样品。

**在储存90天后对每个变化形式(包括对照)中来自每个青贮窖的青贮饲料进行取样。

***如果新鲜牧草中多于1500cfu/g梭状芽胞杆菌，则对青贮饲料进行梭状芽胞杆菌的分析。

VFA和乳酸和低级醇浓度通过对水性青贮饲料提取物的气液色谱法来测定，所述水性青贮饲料提取物由在密封容器中在150ml去离子水中在40℃浸渍30g新鲜青贮饲料持续16小时，接着通过3μm滤纸初步过滤获得。将内标溶液(在1000ml 0.15mol l-1草酸中的0.5g 3-甲基-n-戊酸)的去离子水(3ml)加入至1ml来自上面的滤液，并且所述溶液通过0.45μm聚醚砜膜过滤至色谱样品瓶用于分析。根据气相色谱和生化分析仪官方方法，气-液色谱GC-2010 SHIMADZU使用大口径毛细管柱(

小青贮窖4和5的结果

来自玉米小青贮窖4的结果显示在表5中。所有三种接种的玉米青贮饲料在3天的厌氧发酵后与对照相比具有显著(P>0.05)较低的pH。组合物4和组合物7与组合物2和对照相比具有显著较少的DM损失(％/kg)，显著(P<0.05)较少的N-NH

如图7中所见，10天的有氧暴露导致未接种的对照青贮饲料在66小时后温度升高高于环境温度大于3℃，而组合物7在178小时后升温至高于环境温度大于3℃，与对照相比这是显著(P<0.05)较长的时间以及与组合物2和4相比是显著(P<0.05)较短的时间。在有氧暴露240小时后，对照的pH高至8.29，而组合物7的pH为5.66，与对照相比这是显著(P<0.05)较低的。

表5各种组合物对发酵变量和青贮的玉米的微生物组成的作用

行中的不同字母显示统计学显著差异(P<0.05)

在开放后青贮窖中不存在流出物

来自使用草/三叶草混合物的小青贮窖5的结果显示在表6中。所有3种接种的草/三叶草青贮饲料在3天的厌氧发酵后与对照相比具有显著(P>0.05)较低的pH。组合物4和组合物7具有显著(P<0.05)较少的DM损失(％/kg)。尽管所有接种的草/三叶草青贮饲料与对照相比具有显著(P<0.05)较少的N-NH

如图8中所见，10天的有氧暴露导致未接种的对照青贮饲料在91小时后的温度升高高于环境温度大于3℃，而组合物7在169小时后升温至高于环境温度大于3℃。组合物4在191小时后温度升高大于3℃，组合物2在214小时后达到相同的增加。在有氧暴露240小时后，对照的pH高至7.93，而组合物7的pH为5.41，组合物4的pH为5.35，组合物2的pH为最低，为4.93。

表6

各种组合物对发酵变量和青贮的红三叶草:梯牧草:羊茅的微生物组成的作用

行中的不同字母显示统计学显著差异(P<0.05)

在开放后青贮窖中不存在流出物

小青贮窖6a-玉米收获物2014，美国

对于小青贮窖6a，在美国特拉华州收获玉米，处于大致35％全株DM含量。组合物4和7溶解在去离子水中并每次处理施用于5个20kg堆的新鲜切碎的玉米饲草以获得准确重复。来自每堆的饲草青贮在7.6L桶式青贮窖中并用带有O形圈密封的塑料盖子密封。

对每个发酵间隔(2天、7天和14天)每次处理准备总计5个处于第0天的样品(新鲜材料)和5个桶。桶装填有大约6kg新鲜饲草以达到0.208-0.266kg DM/L的最终堆积密度。将筒在(22±1℃)保存并在2天、7天和14天青贮后打开。

对于有氧稳定性的测定，2kg来自每个青贮窖的代表性样品进入清洁的筒(没有填料)中并将数据记录器放置在饲草块的几何中心。所述记录器被设定成每10分钟记录温度并按小时平均。用粗棉布覆盖在桶的顶部上方以防止过度干燥并且允许在房间内在22±1℃孵育。测量并同时记录房间中的环境温度。有氧稳定性定义为在青贮饲料块在暴露于空气后在稳定基线上增加3℃之前的时间长度。

小青贮窖6a的结果

小青贮窖6a的结果显示在图10和11以及表7a中。

表7a

各种组合物对各个发酵期后打开时的pH和酵母计数的作用以及对7天有氧刺激期内的有氧稳定性的作用

小青贮窖6b-玉米收获物2014,立陶宛

对于小青贮窖6b，在立陶宛收获玉米，处于大致35％全株DM含量。组合物4溶解在去离子水中并以150,000cfu/g饲草施用于一堆新鲜切碎的玉米饲草以获得准确重复。来自此堆的饲草以及一堆未处理的对照青贮在3L带有O形圈的玻璃广口瓶中。

对每个发酵间隔(2天、4天和8天)每次处理准备总计5个处于第0天的样品(新鲜材料)和5个玻璃广口瓶。广口瓶装填有大约1kg新鲜饲草以达到0.208-0.266kg DM/L的最终堆积密度。将玻璃广口瓶在(20±1℃)保存并在2天、4天和8天厌氧发酵后打开。

有氧稳定性

通过监测在隔热的PVC管(1300ml)中在20±1℃环境温度(实验期间记录的室温)保存的青贮饲料中的温度增加来测定有氧稳定性。(图9a)

有氧变质表示为青贮饲料温度达到环境温度之上3℃的小时数(表7b和图9b)。

小青贮窖6b的结果

表7b组合物4对有氧稳定性的作用

增加厌氧发酵的时间增加了对照青贮饲料和用组合物4接种的玉米青贮饲料两者的稳定性。然而，值得注意的是在仅厌氧发酵2天后，用组合物4接种能够保持玉米青贮饲料稳定比对照多18小时，并且当在有氧刺激之前发酵4天或8天时对照和组合物4之间的差异仍然是相当大的(分别为10和29个小时)。

小青贮窖7a、7b和7c–玉米收获物2014,丹麦

对于小青贮窖7a，从丹麦西兰北部农场收集新鲜收获的玉米(28.6％DM)，并直接运输至实验室。玉米用来测试组合物4相对对照的作用，使用1.8-L带有自动排气口的玻璃广口瓶(www.ANKOM.com)。玻璃广口瓶填充了平均746g刚收获的玉米，所述玉米接种以150,000CFU/g组合物4(n＝5)或接种以相同量的自来水(n＝5)作为对照。将广口瓶保持在大约21℃的室温。以10分钟的间隔自动测量气体产量并当达到1.5psi时还自动地释放气体。将累积的气体转换成ml/g新鲜饲草(体积＝P(以psi计的压力)×C(广口瓶的体积)/从0至162小时记录的平均大气压×饲料的全部样品(鲜重))。测量气体产量持续162小时(图12)，对照和用组合物4处理的玉米之间的差异显示在图13中。

对于小青贮窖7b，在同一天使用1kg与小青贮窖7a中相同的玉米并通过移除90％空气并密封来进行真空包装。利用未接种(白色条)、组合物4(150,000CFU/g玉米，灰色条)或组合物7(150,000CFU/g玉米，点状条)使用每次处理5个袋。162小时后，打开袋子，释放气体并测量重量减轻(图14)。

对于小青贮窖c，使用在冰箱中在-18℃保存后的与小青贮窖7a中相同的玉米。之后，将饲草复温，通过移除90％空气并密封来对1kg样品进行真空包装。将不含接种剂或含有组合物4(150,000CFU/g玉米)的饲草的真空包装袋置于户外环境温度下以模拟“真实户外条件”并确认发酵6天后的气体产生(图15)。

小青贮窖7a、7b和7c的结果

青贮饲料中非常早期(前48小时)的气体产生与来自肠杆菌科(例如，大肠杆菌、沙门氏菌、克雷白氏杆菌属等)的附生植物需氧微生物相关。气体产生与青贮饲料的营养素损失有关。与未接种玉米相比，用组合物4接种玉米导致较少的气体产生(图12)。气体产生的差异从10小时增加至116小时，其峰值为0.17ml气体/g玉米的差异(图13)。

在真空包装的玉米中，营养素损失可以通过对袋子称重来评估。与对照相比，且还与组合物7相比，组合物4的重量减轻较少(图14)。

在理想条件下，许多农民有这样的经历，即他们的青贮仓往往在密封后“膨胀”。如图15中所示，在未接种(左侧)和用组合物4接种(右侧)之间气体产生的差异可以容易地用肉眼检测到。

讨论

由布氏乳杆菌产生的乙酸已知是对抗催肥时需氧腐败菌株生长的重要酸，在催肥时青贮饲料暴露于氧。然而，布氏乳杆菌的生长具有很长的滞后时间，并且使用布氏乳杆菌导致的pH降低非常缓慢。为了解决此问题，已经将布氏乳杆菌与高产乳酸的细菌物种,诸如植物乳杆菌组合。然而，高产乳酸菌株的组合可能抵消布氏乳杆菌对有氧稳定性的效率。这个现象显示在小青贮窖2中，其中与组合物4相比，含有70％布氏乳杆菌DSM 22501和10％植物乳杆菌DSM 16568、20％乳酸乳球菌DSM 11037的组合物5导致很不稳定的青贮饲料，所述组合物4仅包含低产乳酸菌株(50％乳酸乳球菌DSM 11037)与布氏乳杆菌DSM 22501(50％)的组合。(图4)

和与高产乳酸物种的其他组合相比，组合物4实现了快速的且高的终末pH水平。尽管不希望受任何理论约束，但据信在组合物4中，布氏乳杆菌DSM 22501仍然能够继续生长和/或是有代谢活性的，如高乙酸水平所指示(图1c)。组合物4的高乙酸/乳酸产量还见于小青贮窖1(图3)中。另外，在厌氧发酵的早期阶段时的高乙酸/乳酸比率显然对小青贮窖3中的有氧稳定性具有积极作用，所述小青贮窖3仅在短时期(2周)的厌氧发酵后开放。

这些结果还显示组合物4的DM损失(重要的饲草质量参数)与含有高产乳酸菌株的产品(参见小青贮窖4和小青贮窖5)一样低，而组合物4还实现了高乙酸产量。高乙酸水平产生非常稳定的青贮饲料(图4、5、6和7)，在利用小青贮窖的所有三种情况下(实施例2)其优于含有布氏乳杆菌DSM 22501的其他组合物(组合物5和7)，所述其他组合物包含植物乳杆菌DSM 16568、高产乳酸菌株。

如图9a中所示，与未处理的对照相比，在7天或14天的短发酵期后，组合物4增加有氧稳定性。另外，且非常令人惊讶地是，组合物4还证明在两个时间点有氧稳定性均好于阳性对照(组合物7)。

如图9b中所示，与未处理的对照相比，在8天的发酵接着7天的有氧刺激后，组合物4增加有氧稳定性。另外，且非常令人惊讶地，与未处理的对照相比，甚至在仅2天或4天的非常短的发酵期后，组合物4仍增加有氧稳定性。

如图10中所示，观察到随着发酵时间增加酵母计数减少的公认模式。然而，令人惊讶的是，在2天和14天发酵两者后，使用组合物4与阴性对照和阳性对照(组合物7)两者相比酵母计数减少更多。

令人惊讶地，如图11中所示，当使用组合物4时pH水平降低至与阳性对照(组合物7)相同的水平，尽管组合物4中缺少植物乳杆菌。

所以这些实验表明基本上由兼性异型发酵布氏乳杆菌和仅同型发酵菌株组成的青贮接种剂实现了良好的饲草质量，并具有改善的有氧稳定性，甚至对于在仅短期的厌氧发酵后开放的青贮饲料也是如此。

参考文献

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