柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE5及其应用

摘要

本发明公开了一种柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE5及其应用，属于植物基因工程技术领域，本发明通过转录组数据库首次筛选获得DkMATE4和DkMATE5基因，并发现DkMATE5蛋白具有原花青素转运功能。通过大肠杆菌体内互补实验分析进一步证明了DkMATE5基因促进柿原花青素前体儿茶素、表儿茶素以及表儿茶素没食子酸的偏好性跨膜转运。该发明为不同脱涩类型柿品种原花青素成分和含量差异的解析以及甜柿遗传改良提供了科学依据和新的基因资源。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE5及其应用。

背景技术

柿果含有的大量原花青素(Proanthocyanidins，PAs；俗称“柿单宁”)，是决定果实成熟度和商品品质的重要指标。原花青素的生物合成包括莽草酸、公共苯丙烷、核心类黄酮-花青素和原花青素特异途径。原花青素前体物质在细胞质中合成，通过定位于液泡膜上的转运蛋白识别并转运至液泡中聚合，从而形成大分子原花青素。目前，原花青素生物合成的结构基因和调控基因都已克隆和鉴定，但原花青素前体的跨膜转运研究较少。尤其是柿原花青素前体物质的偏好性转运是否造成柿品种脱涩类型差异迄今尚不完全清楚。

多药和有毒化合物排出(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)蛋白存在于细菌、酵母、植物和动物中，在大多数原核和真核生物中执行着相对保守、基础的转运功能。拟南芥MATE家族有56个成员，其中TT12编码的MATE转运蛋白转运类黄酮进入液泡。MATE蛋白在柿原花青素前体物质跨膜转运中的作用尚不清楚。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE5及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明首次克隆了具有原花青素前体跨膜转运功能的DkMATE5基因，并发现其在柿原花青素前体跨膜转运中具有选择性，其偏好性转运儿茶素、表儿茶素以及表儿茶素没食子酸。这种偏好性转运是导致柿品种脱涩类型差异的原因，为后续的甜柿遗传改良提供了科学依据和新的基因资源。

本发明的目的之二在于提供上述柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE5在偏好性转运儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸中的应用。

本发明的目的之三在于提供上述柿原花青素前体跨膜转运基因DkMATE5在原花青素转运中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种用于扩增如上述DkMATE5基因的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

本发明的目的之五在于提供一种用于检测DkMATE5基因的荧光定量PCR特异引物，所述荧光定量PCR特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7所示。

本发明的目的之六在于提供一种表达载体，所述表达载体中包含上述DkMATE5基因。

本发明的目的之七在于提供一种遗传工程菌，所述遗传工程菌中包含上述表达载体。

本发明的目的之八在于提供上述表达载体或遗传工程菌在促进儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸跨膜转运中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过转录组数据库筛选，首次获得DkMATE4和DkMATE5基因，并发现其中DkMATE5蛋白具有原花青素前体转运功能。通过大肠杆菌体内互补实验进一步证明DkMATE5基因促进柿原花青素前体儿茶素、表儿茶素以及表儿茶素没食子酸的偏好性跨膜转运。该发明为不同脱涩类型柿品种原花青素成分和含量差异的解析以及甜柿遗传改良提供了科学依据和新的基因资源。

附图说明

图1为本发明实施例1中DkMATE4和DkMATE5在不同品种柿果实发育时期的基因表达检测结果，其中图A为DkMATE4的表达情况，图B为DkMATE5的表达情况。

图2为本发明实施例2中DkMATE4和DkMATE5在柿叶片瞬时转化后，可溶性PAs和不溶性PAs含量测定结果，其中图A为可溶性PAs的含量，图B为不溶性PAs的含量。

图3为本发明实施例3中大肠杆菌功能互补实验检测结果，其中图A为DkMATE5在添加儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸(ECG)，表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的大肠杆菌突变菌株的表达，Empty Vector表示空载体对照，DkMATE5表示转化有原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE5的大肠杆菌，其中每行的6个菌斑为初始OD

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 DkMATE5和DkMATE4基因序列的获得与分析

1、‘鄂柿1号’果实中DkMATE5和DkMATE4基因序列的获得

(1)首先通过Pfam数据库(http://pfam.xfam.org)下载MATE基因家族HMM信息，利用HMMER软件比对油柿基因组(http://www.kakiwi.zju.edu.cn/cgi-bin/persimmon/index.cgi)，获取候选MATE蛋白序列，取候选蛋白序列比对Pfam数据库，保留存在保守结构域的MATE基因为DkMATE家族基因成员，利用转录组数据库查找DkMATE差异表达基因，确定其中DkMATE4和DkMATE5基因差异表达；

(2)利用Primer Premier 5.0软件分别在其间设计RACE引物，其中用于扩增DkMATE4基因的RACE引物如SEQ ID NO.13-14所示，用于扩增DkMATE5基因的RACE引物如SEQID NO.2-3所示。并以‘鄂柿1号’为模板，利用SMARTer RACE cDNAAmplification Kit试剂盒(Clontech,USA)扩增获取目的基因序列。

(3)采用RNAplant Plus Kit试剂盒(Tiangen Biotech Ltd.,Beijing,China)进行‘鄂柿1号’柿果肉RNA的提取，并使用PrimeScript

(4)设计用于扩增DkMATE4基因全长的引物(如SEQ ID NO.15-16所示)以及用于扩增DkMATE5基因全长的引物(如SEQ ID NO.4-5所示)，使用PrimeSTAR Max Premix(2x)(TaKaRa,Japan)高保真酶，以上述反转录获得的‘鄂柿1号’cDNA为模板进行PCR扩增，分别得到包含完整DkMATE4基因编码区和DkMATE5基因编码区序列的PCR片段，测序后得到如SEQID NO.1所示的DkMATE5基因序列以及如SEQ ID NO.12所示的DkMATE4基因序列。

2、DkMATE4和DkMATE5在不同品种和果实发育时期的基因表达模式：

(1)选取‘鄂柿1号’和‘磨盘柿’为试材，分别于开花后2.5周、5周、10周、15周、20周和27.5周采取果肉，-80℃保存待用。

(2)采集不同品种不同发育时期的柿果实，采用RNAplant Plus Kit试剂盒(Tiangen Biotech Ltd.,Beijing,China)提取RNA，并参照PrimeScript

(3)分别设计用于定量检测DkMATE4基因和DkMATE5基因的荧光定量PCR特异引物，其中用于定量检测DkMATE4基因的荧光定量PCR特异引物如SEQ ID NO.17-18所示，用于定量检测DkMATE5基因的荧光定量PCR特异引物如SEQ ID NO.6-7所示。

利用

定量PCR反应体系：5μL的

定量PCR反应条件：95℃30s，接着95℃15s，58℃30s，72℃20s，运行40个循环，然后95℃15s，40℃30s。

每个样品设置四个重复，并以Diospyros kaki Thunb.Actin(GenBank AccessionNo.AB219402)作为内参基因，默认条件下读取Ct值。所有结果显示为具有相应标准误差的均值(SE)。

实时荧光定量PCR检测结果如图1所示，其中图A为DkMATE4的表达情况，图B为DkMATE5的表达情况。结果显示，在果实发育前期，DkMATE4和DkMATE5的表达量均逐渐降低，在果实发育的中后期大量表达，并且在完全甜柿(鄂柿1号)中表达量均高于非完全甜柿(磨盘柿)。而同一基因家族的两个基因DkMATE4和DkMATE5在不同品种不同时期果实中的表达模式呈现出较大差异。

实施例2 DkMATE4和DkMATE5在柿叶片瞬时转化分析

(1)根据实施例1获得的如SEQ ID NO.1所示的DkMATE5基因序列以及如SEQ IDNO.12所示的DkMATE4基因序列，分别设计如SEQ ID NO.8-9所示的MATE5-OEF和MATE5-OER以及如SEQ ID NO.19-20所示的MATE4-OEF和MATE4-OER，并根据说明书，使用Gateway方法将DkMATE5基因和DkMATE4基因分别导入入门载体pDONR207，再通过LR反应导入超表达载体pK2GW7中，分别构建得到超表达重组质粒，并采用常规方法将超表达重组质粒转入到农杆菌(GV3101)中。

(2)将上述转染后的农杆菌采用常规的注射渗透法瞬时转化到‘鄂柿1号’叶片中，并于注射10d后收集农杆菌侵染的叶片，液氮速冻后-80℃保存使用。根据Folin-Ciocalteau法(Oshida et al.,1996)测定瞬时转化叶片的可溶性、不溶性原花青素(PAs)的含量，并以空载体作为对照组。测定结果如图2所示，其中图A为可溶性PAs的含量，图B为不溶性PAs的含量。

根据图2的检测结果，DkMATE4超表达重组质粒转化至柿叶片后，其与空载体对照组(Control)相比，‘鄂柿1号’叶片中可溶性、不溶性PAs含量均没有显著变化，表明DkMATE4不参与PAs的转运。而对转化超表达重组质粒pK2GW7-DkMATE5与空载体对照组叶片中的PAs含量进行测定分析发现，DkMATE5超表达重组质粒转化后，叶片可溶性、不溶性PAs含量相比于空载体对照组均极显著升高(p＜0.01)，该结果表明在完全甜柿中DkMATE5参与PAs的转运，而为同一基因家族的DkMATE4则不参与PAs的转运。

实施例3大肠杆菌功能互补实验确定DkMATE5转运偏好性

1、PGEX-6P-1-DkMATE5表达载体的构建

(1)使用PrimeSTAR Max Premix(2x)高保真酶(TaKaRa,Japan)，以DkMATE5基因全长质粒为模板，用包含BamH I和Not I限制性酶切位点的引物(如SEQ ID NO.10-11所示)，进行扩增并克隆到原核表达载体PGEX-6P-1上，以构建原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE5。

2、大肠杆菌功能互补实验

将上述构建好的原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE5按照常规方法转化到缺乏药物外排能力的大肠杆菌突变菌株acrB中。挑取成功转化的单菌落至5mL LB液体培养基，37℃，200r/min摇12h左右。取500μL菌液至50mL LB液体培养基中，37℃，200r/min摇菌。测定菌液的OD

另外，挑取成功转化的单菌落，于37℃培养，并测定菌液的OD

根据图3A的大肠杆菌功能互补实验结果显示，在没有添加底物的情况下，含有PGEX-6P-1-DkMATE5的菌株与含空载体PGEX-6P-1的菌株对照组，其菌斑生长状况一致。添加底物儿茶素(C)或底物表儿茶素(EC)或表儿茶素没食子酸(ECG)时，含有PGEX-6P-1-DkMATE5的菌株，即表达DkMATE5的菌株生长状况显著优于对照组，而添加底物表没食子儿茶素(EGC)或表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)时，含有PGEX-6P-1-DkMATE5的菌株的生长情况与对照组生长之间无差异。

进一步在没有添加底物的情况下，含有原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE5的菌株与含空载体PGEX-6P-1的菌株对照组，其生长曲线之间无差异。而添加底物儿茶素(C)或底物表儿茶素(EC)或表儿茶素没食子酸(ECG)时，含有原核表达质粒PGEX-6P-1-DkMATE5的菌株，即表达DkMATE5的菌株生长状况显著优于对照组。该结果证明了DkMATE5的表达补充了缺乏药物外排能力的大肠杆菌突变菌株acrB的功能，即DkMATE5转运蛋白偏好转运儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸，而不转运表没食子儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

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<212> DNA

<213> 柿(Diospyros kaki)

<400> 1

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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