一种抗砷双基因表达载体及其构建方法

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种抗砷双基因表达载体及其构建方法，所述抗砷双基因表达载体pCVD442KS‑AA‑HR的具体构建过程为：合成AoxAB基因和ArsM基因，克隆在pUC19载体的SalI和HindIII位点之间，构建获得pUC19‑AA质粒，然后在pUC19‑AA质粒的HindIII位点处克隆入重组手臂HR，获得质粒pUC19‑AA‑HR，pUC19‑AA‑HR质粒上的打靶片段经XbaI切割后亚克隆入革兰氏阴性菌自杀质粒pCVD442KS上，得到抗砷双基因表达载体pCVD442KS‑AA‑HR。所述抗砷双基因表达载体pCVD442KS‑AA‑HR为后续工作积累了基础条件，对A.ferrooxidan的定向育种与改良起到奠定作用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抗砷双基因表达载体及其构建方法。

背景技术

砷作为一种在地球化学循环中普遍存在的剧毒类金属元素，在自然界中分布非常广泛，Srivastava等预计每年从大陆表面经挥发进入大气中的砷含量约达到2.1×10

存在于自然界中的砷及其化合物的毒性与砷的形态有关，通常无机砷的毒性高于有机砷，亚砷酸盐的毒性要远远高于砷酸盐，而且与砷酸盐相比，亚砷酸盐在砷的地球循环中更易移动，在水体环境中更加稳定。同时研究发现亚砷酸盐能够通过转运蛋白或甘油载体进入细胞，并特异地与多种功能蛋白或酶的巯基基团结合，导致蛋白变性及酶的活性丧失，因此将亚砷酸盐氧化为弱毒性且易吸附去除的砷酸盐是解毒的有效途径之一。但砷酸盐仍被认为是一种剧毒类的化合物，小鼠经口LD50为238mg/kg，大鼠经口LD50为48mg/kg，同时砷酸盐的负电荷属性也使其在环境中容易积累，因此将砷酸盐进一步转化为甲基化产物，将从根本上弱化砷在环境中的毒性影响。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidan)作为一种重要的抗砷嗜酸微生物，在与各种砷离子的长期共存中进化出了其独特的抗砷机制，但前期研究证实，作为自然分离的原始菌株，通过驯化后虽然具备了一定的三价砷吸附和转化能力，但其作用能力非常有限，而且不具备砷的甲基化功能，严重限制和影响了A.ferrooxidan对含砷废电路板的有价金属浸出、生物冶金及在含砷废水废渣治理等领域中的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种抗砷双基因表达载体及其构建方法，为抗砷基因工程菌的构建奠定了前期基础。

本发明提供了一种抗砷双基因表达载体，所述抗砷双基因表达载体为pCVD442KS-AA-HR，所述抗砷双基因表达载体构建过程为：合成AoxAB基因和ArsM基因，克隆在pUC19载体的SalI和HindIII位点之间，构建了pUC19-AA质粒，然后在pUC19-AA质粒的HindIII位点处克隆入重组手臂HR，获得pUC19-AA-HR质粒，pUC19-AA-HR质粒上的AA-HR片段经XbaI切割后亚克隆入革兰氏阴性菌自杀质粒pCVD442KS上，得到抗砷双基因表达载体pCVD442KS-AA-HR。

本发明还提供了上述抗砷双基因表达载体的构建方法，包括如下步骤：

S1，pUC19-AA质粒的克隆：ArsM和AoxAB基因经基因合成，克隆在pUC19载体的SalI和HindIII位点之间，获得pUC19-AA质粒；

S2，重组手臂HR的扩增：以基因组A.ferrooxidan BY3的DNA为模版，以HR-F和HR-R为引物进行扩增，获得扩增产物；

所述HR-F引物的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述HR-R引物的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

S3，将S2的PCR产物经酚、氯仿处理后，异丙醇沉淀，溶于无菌去离子水中，按两侧的设计位点，使用限制性内切酶HindIII进行酶切，待载体酶切反应结束后，分离纯化，再进行连接反应，在pUC19-AA质粒的HindIII位点处克隆入HR，获得含有完整打靶片段AA-HR的质粒pUC19-AA-HR；

S4，将pUC19-AA-HR克隆转接至LB培养基进行质粒制备，其后用XbaI将AA-HR从重组质粒上切割并与相同酶切的自杀质粒pCVD442连接和转化，取产物进行二次连接反应，pUC19-AA-HR质粒上的AA-HR片段经XbaI切割后亚克隆入革兰氏阴性菌自杀质粒pCVD442KS上，得到抗砷双基因表达载体pCVD442KS-AA-HR。

进一步地，S2中，扩增反应体系为：菌液0.5μL，10×Pfu buffer5μL，25mM)dNTP(0.4μL，50pmol/μL HR-F 0.5μL，50pmol/μL HR-R 0.5μL，5U/μL Pfu DNA polymerase 0.5μL，dH

进一步地，S2中，扩增条件为：95℃预变性5min；再进行35个循环，重复2-4次，每个循环的条件为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，72℃终延伸7min。

进一步地，S3中，酶切反应体系为500ng/μL pUC19-AA 4μL，HR43μL，10×R buffer10μL，10U/μL HindIII 4μL，ddH

进一步地，S3中，连接反应体系的总体积为10μL，分别为50ng/μL pUC19-AA酶切去磷产物4μL，50ng/μL HR酶切产物4μL，10×T4 buffer1μL，5U/μL T4 DNA ligase 1μL。

进一步地，S4中，质粒pCVD442KS-AA-HR构建的连接体系总体积为50μL，各组分的体积为：250ng/μL pCVD442KS 4μL，10×Tango buffer 5μL，10U/μL XbaI 2μL，ddH

进一步地，S4中，转化体系为：500ng/μL pUC19-AA-HR 10μL，10×Tango buffer 5μL，10U/μL XbaI 2μL，ddH

进一步地，S4中，二次连接反应体系包含50ng/μL pCVD442KS酶切去磷产物4μL，ng/μL AA-HR 4μL，10×T4 buffer 1μL，5U/μL T4 DNA ligase 1μL，总体积为10μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明中AoxAB和ArsM经基因合成后克隆在pUC19载体的SalI和HindIII位点，成功构建了pUC19-AA质粒，随后在pUC19-AA质粒的HindIII位点处克隆入HR(重组手臂)，得到含有完整打靶片段的质粒pUC19-AA-HR，最后pUC19-AA-HR质粒上的打靶片段经XbaI切割后亚克隆入革兰氏阴性菌自杀质粒pCVD442KS上，得到打靶质粒pCVD442KS-AA-HR，经测序比对与实验设计一致，此质粒的成功构建为后续靶基因的插入与表达提供了重要基础。

2、本发明构建的双基因表达载体，为后续工作积累了基础条件，对A.ferrooxidan的定向育种与改良起到奠定作用。

3、本发明将有效推进抗砷工程菌的设计思路，并为砷污染治理及含砷电子垃圾中有价金属的浸出创造条件。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中重组手臂HR的克隆产物扩增结果图；

图2为本发明构建的pUC19-AA-HR质粒的扩增结果图；

图3为本发明构建的自杀质粒pCVD442KS-AA-HR的克隆鉴定电泳图谱；

图4为本发明构建的自杀质粒pCVD442KS-AA-HR的构建设计图谱；

图5为本发明中对酶切鉴定的质粒的测序结果图谱。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

材料准备：

(1)主要试剂及仪器

T4 DNA连接酶、FastAP去磷酸化酶、限制性内切酶HindIII和XbaI等，上海生物工程股份有限公司；二氨基庚二酸(MDAP)，日本TCI公司；Taq DNA聚合酶、DNA分子量Mark，美国Promega公司；

(2)菌种及培养基

嗜酸氧化亚铁硫杆菌BY3(A.ferrooxidans BY3)，所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌BY3的保藏号为CCTCC-M203071，大肠杆菌DH5α(E.coli DH5α)、β2155(E.coliβ2155)均由实验室保存提供；

所用培养基包括LB培养基、SOC液体培养基，均由碧云天生物技术有限公司提供；

固体培养基成分包括以下四个部分：

A：2g硫酸亚铁溶于20mL蒸馏水中，调pH值至2.0；B：2g硫代硫酸钠溶于20mL蒸馏水中；C：氯化钾0.15g，硫酸铵4.50g，硫酸镁0.75g，加入500mL蒸馏水中充分溶解，用浓硫酸调pH值至4.5；D：6g琼脂粉加入460mL蒸馏水并磁力搅拌溶解；

倒平板前将A、B溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，溶液C与D在1×10

实施例2

一种抗砷双基因表达载体AoxAB-ArsM的构建过程具体如下：

(一)pUC19-AA-HR质粒的构建

(1)pUC19-AA质粒的克隆

合成ArsM和AoxAB基因，然后克隆在pUC19载体的SalI和HindIII位点之间，所述ArsM基因靠近SalI位点，所述AoxAB基因靠近HindIII位点，获得pUC19-AA质粒。

(2)重组手臂(HR)的扩增

以基因组A.ferrooxidan BY3的DNA为模版，利用Primer primer 6软件设计并合成相关引物，所述引物包括HR-F引物和HR-R引物；

所述HR-F引物的基因序列如SEQ ID NO.1所示：

HR-F：5′-TATAAGCTTTGGACGTCAGCAATTTTCATATTGATCAC-3′

所述HR-R引物的基因序列如SEQ ID NO.2所示：

HR-R：5′-TATAAGCTTCTAGAATGTCCTCGATACCGTCGC-3′

利用上述合成引物，对目的基因片段进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为：菌液0.5μL，10×Pfu buffer5μL，dNTP(25mM)0.4μL，HR-F(50pmol/μL)0.5μL，HR-R(50pmol/μL)0.5μL，Pfu DNA polymerase(5U/μL)0.5μL，dH

(3)PCR产物的纯化回收

将60mL无水乙醇加入15mL漂洗液中，12000r/min、25℃下离心1min；加入PCR反应液5倍体积的结合液，充分混合均匀；混合液转入吸附柱(置于收集管)，在12000r/min室温下离心1min，弃废液；加入700μL漂洗液在相同条件下离心30s，弃废液后再加入500μL漂洗液离心30s，弃掉废液；将吸附柱转移至收集管，在12000r/min室温下离心2min，除去漂洗液；洗脱缓冲液置于65-70℃水浴，备用；将吸附柱取出后置于灭菌处理的离心管中，加入预热的洗脱缓冲液，25℃下静止2-3min，12000r/min室温下离心1min；回收的PCR产物置于-20℃下保存；

采用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测重组手臂HR的扩增结果(如图1所示)结果表明，扩增产物大小为954bp，条带清晰，扩增片段大小与与实验设计相符。

(4)重组手臂的酶切和克隆

重组手臂PCR产物经酚、氯仿处理后，异丙醇沉淀，溶于43μL无菌去离子水中，按两侧的设计位点，使用限制性内切酶HindIII进行酶切反应，酶切反应体系为pUC19-AA(500ng/μL)4μL，HR43μL，10×R buffer(MBI)10μL，HindIII(10U/μL，MBI)4μL，ddH

在37℃下反应2h，待载体酶切反应结束后，加入3μL FastAP去磷酸化酶(1U/μL，MBI)，于37℃反应1h后，将两管产物直接进行电泳分离和凝胶纯化，分别洗脱于50μL无菌去离子水，获得pUC19-AA酶切去磷产物，记为pUC19-AA/HindIII/FastAP，取部分产物进行连接反应，连接反应体系的总体积为10μL，分别为pUC19-AA/HindIII/FastAP(50ng/μL)4μL，HR/HindIII(50ng/μL)4μL，10×T4 buffer1μL，T4 DNA ligase(5U/μL，MBI)1μL，反应结束后在16℃下过夜保存；

将连接反应产物直接通过常规化学转化方法(CaCl

(二)感受态细胞的制备与转化

(1)将E.coli接种至LB液体培养基，37℃、180rpm下过夜培养；

(2)将0.5mL菌液转入50mL新鲜LB培养基，在37℃、180rpm培养2-3h，通过分光光度法检测菌液生长，至对数期(OD600≈0.6)后停止培养；

(3)菌液转移到预先冷却的50mL EP管内，冰浴10min；

(4)在4℃、8000rpm下离心10min，除去上清并倒置于无菌滤纸上去除残余液体；

(5)用10mL冰浴的0.1moL/LCaCl2重悬菌体沉淀，冰浴5min；

(6)重复步骤4；

(7)加入10mL含20％甘油的0.1moL/LCaCl2溶液(冰浴)再次重悬沉淀，冰浴10min；

(8)按体积比1：1将菌液与50％甘油混匀，迅速分装至冷却的EP管中，置-80℃保存备用。

大肠杆菌的转化：

(1)在100μL感受态细胞悬液中加入5μL连接产物，混匀后冰浴30min；

(2)在42℃水浴热激90s后置冰浴2min；

(3)混合液中加入200μLSOC液体培养基，充分混合均匀，转至37℃、180rpm下复苏45min；

(4)将100μL转化细胞液涂布至LB固体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，转入37℃下倒置培养至单克隆形成。

(三)自杀质粒pCVD442KS-AA-HR的构建

pCVD442KS为pCVD442的衍生质粒，含卡那霉素抗性基因；

首先将pUC19-AA-HR克隆转接至LB培养基进行质粒制备，其后用XbaI将AA-HR从重组质粒上切割并与相同酶切的自杀质粒pCVD442连接和转化；质粒pCVD442KS-AA-HR构建的连接体系总体积为50μL，各组分的体积为：pCVD442KS(250ng/μL)4μL，10×Tango buffer(MBI)5μL，XbaI(10U/μL,MBI)2μL，ddH

质粒pCVD442KS-AA-HR构建的连接与转化体系在37℃下反应2h，待载体酶切反应结束后，加入3μL 1U/μL FastAP去磷酸化酶(MBI)，继续于37℃反应1h，然后将两管产物直接进行电泳分离和凝胶纯化，分别洗脱于50μL无菌去离子水，获得pCVD442KS酶切去磷产物，记为pCVD442KS/XbaI/FastAP，取部分产物再次进行连接反应(二次连接反应)，二次连接反应体系包含pCVD442KS/XbaI/FastAP(50ng/μL)4μL，AA-HR(50ng/μL)4μL，10×T4buffer1μL，T4 DNA ligase(5U/μL,MBI)1μL，总体积为10μL，在16℃下反应过夜。

连接反应产物转化入E.coli DH5αλπ感受态细胞，在含100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的LB平板上于37℃培养，至单克隆菌落形成。随机挑选16个克隆，用pCVD442KS质粒XbaI位点两侧引物进行PCR鉴定，鉴定结果如图3所示，第1-15号克隆均含有大小符合的插入片段(4400bp)，完成自杀质粒pCVD442KS-AA-HR的构建，即获得抗砷双基因表达载体。

ArsM和AoxAB基因经基因合成，克隆在pUC19载体的SalI和HindIII位点，称为pUC19-AA，质粒载体的构建采用Clone Manager 8进行质粒拼接，然后用Snap View软件展示和输出，如图4所示；

对酶切鉴定的质粒进行测序(由上海生物工程股份有限公司完成)；根据测序结果经BLAST分析比对，显示结果与NCBI查询信息一致，如图5所示。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120> 一种抗砷双基因表达载体及其构建方法

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<160> 2

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

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<400> 1

tataagcttt ggacgtcagc aattttcata ttgatcac 38 <>

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<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

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<400> 2

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