用于核酸检测的质量对照组合物和全生物体对照材料

摘要

本公开总体涉及用于评价核酸检测(NAT)的功能的质量对照组合物和全生物体对照材料，以及相关的方法、用途和试剂盒。在一些方面中，该NAT用于感测在检测物品中存在某种生物体和目标核酸序列，该质量对照组合物包括：(i)含第一核酸序列的第一受保护的核酸序列，该第一核酸序列的存在表征在检测物品中存在该生物体，所述第一核酸序列在NAT中被检测；以及(ii)含第二核酸序列的第二受保护的核酸序列，该第二核酸序列的存在表征在检测物品中存在目标核酸序列，所述第二核酸序列在NAT中被检测。

说明书

本申请要求于2018年5月18日提交的名称为“用于核酸检测的全生物体对照材料”的美国临时申请US 62/673,480的优先权，该临时申请的全部内容通过引用结合在此。相关的PCT受理局于2019年5月18日至20日(含)不办公。

技术领域

本公开总体涉及用于核酸检测(NAT)的全生物体对照材料、用于评价NAT的功能的质量对照组合物、以及用于感测被检样品(例如生物检测样品)中的感兴趣的生物体或核酸序列的方法。

背景技术

生物有机体或性状存在的分析和/或诊断检测可利用感测生物体的核酸或核酸序列的方法来进行，该方法在广义上被称为核酸检测(NAT)。核酸检测的一个子集被称为核酸扩增检测(NAAT)，因为这些检测通常涉及有助于感测的核酸扩增。例如，这种方法可基于对生物体的特征DNA或RNA序列或特定性状或特征的感测。NAT可用于识别表征存在或不存在生物体(例如细菌、病毒或病原体或其他物种)的遗传状况或者性状或特征的特定核酸序列的存在。这种例子包括感测诸如体液、血液、尿液或组织等生物样品中的抗生素抗性细菌或疟疾或呼吸道病毒(例如流感病毒)。在其他方面，NAT可用于感测抗生素抗性(例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的甲氧西林抗性)、疾病(例如疟疾或高毒流感)以及污染物或害虫(例如水中的大肠杆菌水平或土壤中的真菌孢子(例如枯草芽孢杆菌或霉菌的孔隙悬浮液))的存在。

NAT中的质量控制越来越重要，因为感测技术变得更加灵敏，结果不仅受生物变化性(例如样本或样本类型)的影响，而且受技术变化性的影响，例如样品处理过程中引入的任何差异、关键试剂的变化、检测环境中的污染控制、程序一致性、以及检测设备的正常运行。处理步骤越多，产生假阳性或假阴性的风险就越高。错误的结果可能产生非常有害的后果，这不仅体现在进行检测(或重新检测)的成本方面，而且体现在对健康和安全的危害方面——无论是对于被检测的患者还是对于环境或其他系统。鉴于许多NAT的多步骤特点，需要为整个过程使用可用作对照物的质量对照材料。

此外，还需要开发针对病原性和/或致命性和/或毒性生物体的可安全地生产、运输和处理的非病原性和/或非致命性和/或非毒性质量对照物。

已知其中存在或不存在分析物的样品、用于设计或开发检测、确定检测的正常运行(例如质疑、确认或评价与检测相关的操作、性能、设备、系统或程序，提供法规、法律或最佳实践原则所要求的证明检测的正常运行和/或结果的有效性的证据)的样品统称为“对照物”。

对照物相对于感兴趣的检测物品可以是外在的，或者可以独立于感兴趣的检测物品对其进行检测，在这种情况下，它们可称为“外部对照物”或“外在对照物”。或者，对照物可以是与感兴趣的检测物品整合或混合的，在这种情况下，它们可称为“内部对照物”。对照物可以是定性的，在此情况下它们示例性地表征分析物的存在或不存在；对照物也可以是定量的，在此情况下它们包含预定的绝对量或相对量的分析物。美国食品和药物管理局(FDA)和其他卫生主管部门已经明确了阴性和阳性NAT对照物的必要性。例如，请参考美国FDA的指导文件“第二类特殊对照物指导文件：呼吸道病毒组多重核酸检测——行业和FDA员工指南”(2009年10月)[

阴性对照物有时可作为基本上不含有作为NAT的特定目标的生物体或基因物质的缓冲液、样品基质或储存材料提供。在其他实施例中，可有包含不属于检测的目标的非目标核酸或全生物体的阴性样品对照物。一个例子是来自已知未感染的个体的患者样本、非目标生物或替代阴性对照物，例如包装RNA(或铠装RNA)。进行阴性对照的原因有很多，包括但不限于证明检测成分、设备和环境没有受到可能错误地使检测结果呈阳性的核酸的污染，以及证明检测不与无关物质交叉反应或不包括在不存在载有特定目标序列的检测物品时可能造成阳性结果的内在元素。

阳性对照物旨在模拟样本的某些方面，含有目标核酸，并可用于控制所有或部分分析过程，包括核酸提取、扩增和感测。有用的阳性分析对照材料包括患者的样品、细胞系、被通过分析感测的病原体的致病或非致病株感染的细胞系、纯化或分离的病原体、来自病原体或细胞系的核酸、以及存在于封闭生物体或结构中的核酸，这些物质中的任何一种存在于在某些方面模拟分析样品类型的适当基质中或基质上。铠装RNA和DNA是可用作阳性对照物的封闭核酸的例子。阳性对照物可作为单独的分析运行，或在某些情况下与样本同时运行。阳性对照物也可以是在其他方面与分析的特定目标无关但却是为了确定试剂(例如聚合酶、引物)的完整性、设备功能(例如热循环仪)、以及抑制剂在样品中的存在或者用于支持分析的定性或定量结果而纳入的辅助分析目标的目标核酸。这种对照物包括“内部对照物”，例如在US9328385中说明的内部对照物。另一些例子包括与流感病毒共同提取的人类核酸以及扩增人类持家基因的引物(例如RNase P、β-肌动蛋白)。

用于检测生物体的存在和/或定量的NAT可设计为感测生物体的全部或部分核酸量，因此用于这种检测的对照物可来自多种来源或生物体。

非常需要开发这样的对照物，尤其是更容易/更安全地制造或处理的对照物、以及更好地模拟从检测样品的处理到核酸感测的NAT影响的对照物。

此外，适当的对照材料的制备存在未解决的问题。其中一个问题是如何制备在许多不同的检测中广泛有用的对照物，无论是由NAT的商业机构开发的检测(包括诊断NAT)还是由个人研究或临床实验室开发的检测。例如，许多对照物仅对特定的NAT或一组NAT有用，但并非对特定生物体的所有NAT都有用。

因此，对于本领域技术人员来说众所周知的是，对于产生至少具有一部分下列特征的对照物的方法的需求仍未得到满足：(i)被许多不同设计和来源的NAT所识别的对照物(例如更通用或应用更广泛的对照物)；(ii)容易获得的对照物；(iii)容易培养或生长而没有不适当的成本或生物安全风险的对照物；以及(iv)可快速开发以满足随着感兴趣的序列的发展而提供对照物的需求的对照物。

发明内容

除了其他益处之外，本发明提供了一种满足上述一个或多个需求并提供如本文所述的对照物的其他期望特征的能力。

在本发明的多个方面中，本发明提供了一种用于评价核酸检测(NAT)的功能的质量对照组合物，其中所述NAT用于感测在检测物品中存在某种生物体和目标核酸序列，所述质量对照组合物包括：(i)包括第一核酸序列的第一受保护的核酸序列，该第一核酸序列的存在表征在检测物品中存在具有在NAT中被检测的所述第一核酸序列的生物体；以及(ii)包括第二核酸序列的第二受保护的核酸序列，该第二核酸序列的存在表征在检测物品中存在包括在NAT中被检测的所述第二核酸序列的目标核酸序列。在一些方面中，所述第一和第二受保护的核酸序列共同或分别存在于多于一种保护载体中，其中所述保护载体可以是相同或不同类型的保护载体。在另一个方面中，所述第二受保护的核酸序列不是天然存在于其保护载体中。

在多个实施例中，所述第一核酸序列的保护载体是在通过NAT处理时具有与所述生物体或包括将在检测物品中检测其存在的目标序列的生物体相同或相似的核酸序列保护特性的生物体。在一些实施例中，所述第一核酸序列的保护载体不包括目标核酸序列。

在一些其他方面中，本发明的组合物的保护载体保护其相应的核酸序列，使得该核酸序列能在NAT的核酸提取步骤中被充分和/或大量地回收。

在一些其他方面中，所述保护载体中的至少一种(例如用于第一受保护的核酸序列的保护载体)是在通过NAT处理时具有与在样品或检测物品中检测其存在的生物体相同或相似的核酸保护特性的生物体。在多个其他实施例中，所述第一受保护的核酸序列的保护载体是在NAT中被检测的没有目标核酸序列的生物体，并且所述第一核酸序列是不包括目标核酸序列的生物体或该生物体的族系中的某种生物体的天然基因组。

在本发明的多个实施例中：(i)所述包括将在NAT中检测的目标核酸序列的生物体是致命性、致病性或毒性生物体，或者，其中在所述目标核酸序列与或不与另外的序列一起存在时，该生物体被赋予致命性、致病性或毒性性状；并且(ii)所述第一受保护的核酸序列的保护载体是包括不包含目标核酸序列的天然基因组核酸序列的生物体或该生物体的族系中的某种生物体的低致命性或非致命性和/或致病性形式。在一些其他方面中，所述包括将在NAT中检测的目标核酸序列的生物体是属于生物体的种或属的特定株或一组株，其中所述第一受保护的核酸序列的保护载体是包括天然基因组核酸序列但不包括目标核酸序列的种或属的代表性株。

在本发明的一些其他方面中，在所述质量对照组合物中，第二核酸序列：(i)选自表征目标核酸序列的核酸序列的一部分，或(ii)被修饰为使得第二核酸序列不会单独或与组合物中的其他核酸序列组合地表达为使目标序列的遗传特征得到表达。

在一些其他方面和实施例中，所述质量对照组合物包括多于一个第一核酸序列，并且每个第一核酸序列是表征检测物品中的具有在NAT中被检测的至少一个但不一定全部第一核酸序列的生物体的一个不同的核酸序列(对于目标核酸序列的区域重叠或不重叠)。在一些方面中，所述第一核酸序列分别在单独的保护载体中，在多于一种保护载体中，或在一种保护载体中。

在有多于一个第一核酸序列的多个其他实施例中，在NAT中检测多于一个第一核酸序列，并且多于一个第一核酸序列的存在对于确定生物体的存在是必要的。

类似地，在所述组合物包括多于一个第二核酸序列的多个实施例中，每个第二核酸序列是表征在NAT中被检测的至少一个但不一定全部第二核酸序列中存在目标核酸序列的一个不同的核酸序列(对于目标核酸序列的区域重叠或不重叠)。在一些方面中，所述第二核酸序列分别在单独的保护载体中、在多于一种保护载体中、或在一种保护载体中。在有多于一个第二核酸序列的多个其他实施例中，在NAT中检测多于一个第二核酸序列，并且多于一个第二核酸序列的存在对于在NAT中确定检测物品的存在是必要的。

在多个实施例中，所述包括一个或多个第一核酸序列的一种或多种第一保护载体单独或共同包括将在NAT中检测的生物体的天然基因组的0.5至100％、或大于90％、或大于80％、或大于70％、或大于60％、或大于50％、或大于40％、或大于30％、或大于20％、或大于15％、或大于10％、或大于5％、或大于4％、或大于3％、或大于2％、或大于1％。

在多个实施例中，所述包括一个或多个第二核酸序列的一种或多种第二保护载体单独或共同包括将在NAT中检测的目标核酸的0.5至100％、或大于90％、或大于80％、或大于70％、或大于60％、或大于50％、或大于40％、或大于30％、或大于20％、或大于15、或大于10％、或大于5％、或大于4％、或大于3％、或大于2％、或大于1％。

在本发明的多个实施例中，所述NAT设计用于检测致病性、致命性或毒性生物体或目标核酸序列，并且本发明的质量对照组合物不包括所述致病性、致命性或毒性生物体或完整的目标核酸序列，或者，如果包括，则包括其较低或非致病性、致命性、或毒性的形式。在本发明的质量对照组合物中的核酸序列的情况下，它们不具有单独或与质量对照组合物的其他组分组合地赋予或表达致病性、致命性或毒性的风险或者这种风险较低或非常小，或者，在一些实施例中，具有比通过NAT检测的检测样品或检测物品低的致病性、致命性或毒性。在多个其他实施例中，所述第一和第二核酸序列在不同的保护载体中，第一核酸序列在包括天然核酸序列的检测物品中的致命性较低、致病性较低的生物体形式的保护载体中，第二核酸序列在作为不包括第一受保护核酸序列的核酸序列的保护载体的第二生物体中。

在使用NAT来感测在检测物品中存在一种或多种另外的生物体时可用的多个其他实施例中，本发明的质量对照组合物包括针对相同或不同生物体或NAT的目标核酸序列的一种或多种另外的对照物。可替代或附加地，本发明的质量对照组合物可包括可能疑似存在于样品或检测物品中的另外的生物体的基于非NAT的感测系统。此外，或者或另外，本发明的质量对照组合物可包括用于相同生物体的另外的对照物成分(双重或多重对照物)，例如用于具有针对疑似存在于样品(或检测物品)中的相同生物体的不同目标序列的NAT或不同的核酸检测(非NAT)、或用于基于非核酸的感测系统(例如免疫测定和抗体使用)的另外的质量对照材料。

在质量对照组合物包含一种或多种另外的对照物的一些其他实施例中，这些对照物选自下列物质中的一种或多种：(a)一种或多种如本文所述的质量对照组合物或其组合物，其中使用NAT来感测被检物品中的相同或不同的生物体或目标核酸序列；(b)一种或多种生物体或包括核酸序列的其他构建体，在NAT中检测该生物体或构建体的存在；以及(c)代表用于与NAT同时进行的检测的阳性对照检测材料的一种或多种生物体、抗体、蛋白质、脂质、多糖或核酸。

在本发明的质量对照组合物和方法的多个实施例中，所述NAT检测用于检测被检物品中存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，包括检测通常在金黄色葡萄球菌中发现的核酸序列和表征目标核酸序列的甲氧西林抗性的核酸序列，所述组合物包括第一和第二受保护的核酸，第一受保护的核酸包括不表达甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌株的天然序列，第二受保护的核酸包括表征甲氧西林抗性的序列，该序列经过修饰或未经修饰，但其本身不能单独或组合地为其保护载体赋予甲氧西林抗性。

在本发明的一些实施例中，本发明提供了一种制备本发明的质量对照组合物的方法，该方法包括用第一和第二核酸序列对保护载体进行天然或遗传修饰或者通过物理或化学手段使保护载体上或保护载体内耦合或包含该核酸序列来制备第一和第二受保护的核酸序列的步骤。在一些方面中，将所述第二核酸序列引入到其保护载体中，其中所述保护载体是在其中整合或未整合基因组序列的生物体。在一些其他方面中，所述第二核酸序列包含在媒介(vector)中，并通过瞬时转染引入到其保护载体中，通过病毒转导引入或整合到生物体的基因组中。

在一些其他实施例中，本发明提供了一种用于评价NAT的功能的方法，该方法包括对本发明的质量对照组合物进行NAT，并确定NAT是否产生与作为NAT目标的生物体的存在一致的结果，例如确定NAT是否产生与已知存在于质量对照组合物中的核苷酸序列一致的结果。在一些其他方面中，使用不同级别的预定量的质量对照组合物来确定NAT的定量结果和/或NAT的感测参数。

在多个其他方面中，本发明提供了一种使用NAT感测被检样品中的生物体或目标核酸序列的方法，该方法包括：(i)获得疑似包括感兴趣的生物体或目标核酸序列的检测样品；(ii)可选地在与检测物品的介质对应的介质中提供本发明的质量对照组合物；(iii)并行或顺序地进行[0001]44(a)和[0001]44(b)之中的每一项中的核酸检测(NAT)；并且(iv)将通过检测物品的NAT产生的结果与通过质量对照组合物的NAT产生的结果进行比较，以评价NAT的功能，并为检测物品的NAT的结果的准确性提供支持性证据。

在一些其他方面中，本发明提供了一种用于评价核酸检测(NAT)的功能的试剂盒，该试剂盒包括本发明的质量对照组合物之中的任何一种或多种组合物或组分，并且可选地包括以下说明之中的一种或多种：制备或选择质量对照组合物的材料的说明、使用NAT进行对照物检测的说明、以及关于如何评价对照物以及样品或检测物品的结果的说明。

在一些其他实施例中，本发明的质量对照组合物是用于核酸检测(NAT)的全生物体对照物，其中该全生物体对照物包括：(a)待进行样品筛选的生物体的致命性、致病性或毒性较低的版本，该版本的生物体比将在NAT中筛选的生物体的致命性、致病性或毒性较低，或危险性较低；以及(b)决定全生物体的致命性、致病性或毒株的存在的一个或多个核苷酸序列，这些核苷酸序列包含(i)提供在核酸检测(NAT)中检测的生物体的特征的至少一个核酸序列、以及(ii)提供在NAT中检测的生物体中非天然存在的特征的第二核酸序列。

在本发明的一些实施例中考虑了包括质量对照组合物的组合物，所述质量对照组合物是用于核酸检测(NAT)的扩增全生物体对照材料。这种扩增全生物体对照物可包含作为保护载体的单种生物体或多种生物体(多生物体对照物)。在多个实施例中，所述扩增全生物体对照材料包括全生物体，该全生物体包含在NAT中检测的提供该生物体的特征的至少一个核酸序列(即，内源核酸序列)，并包含在NAT中检测的在该生物体中非天然存在的第二核酸序列(即，外源核酸序列)。

所述外源核酸序列选自属于待检测的样品中的目标核酸序列(即，阳性对照物)的核酸序列。

在一些其他方面中，在所述质量对照组合物或扩增全生物体对照材料包括单种全生物体的情况下，该生物体包括至少两个在该生物体中非天然存在的天然核酸序列。

在一些其他方面中，本发明的质量对照组合物(例如扩增全生物体对照物)是选自与待检测的样品中存在的生物体相似的生物体的至少一种生物体。因而该质量对照组合物可作为NAT的样本处理步骤的对照。

因此，在一些方面中，本发明提供了一种NAT对照物，在单种全生物体对照物的情况下，该NAT对照物可作对于检测样品中的生物体和目标核酸序列的整个检测过程的阳性对照。在另一些其他方面中，本发明的质量对照组合物(例如扩增全生物体对照物)以能够最佳地模拟疑似在检测样品中存在的目标生物体/核酸序列的潜在浓度的一种浓度或一系列浓度使用，该潜在浓度可作为从待筛选/检测的样品获得的结果的已知基准。提高将作为检测对照的对照物中的特征数量(无论是生物体的数量还是目标外源核酸序列的数量)都能降低假阳性和假阴性的概率。

此外，在本发明的一些其他方面中，质量对照组合物或扩增全生物体对照组合物还可包括已知浓度的分离的或保护的核酸序列，作为阴性对照物(非目标核酸，例如对于生物体(或待检测的生物体的没有目标核酸序列的株或物种)是天然的)或阳性对照物(目标核酸序列)。

在一些其他方面中，本发明的质量对照组合物(例如扩增全生物体对照物)可用于校准NAT过程或与待检测的样品同时进行NAT。

在一些其他方面中，通过使用已通过辐射、化学暴露等手段而变得低致病性或非致病性的全生物体和/或通过使用固有低致病性或非致病性的生物体和/或致病性生物体的非致病性部分来获得将为其筛选待检测的样品的目标核酸序列，本发明的质量对照组合物(例如扩增全生物体对照组合物)具有较低的致病性或非致病性。

在一些其他方面中，本发明的质量对照组合物(例如扩增全生物体对照材料)包括两种或更多种全生物体，其中第一全生物体包含至少一个在NAT中检测的表征该生物体的核酸序列，而第二生物体包含在NAT中检测的非天然存在于第一种或第二种生物体中的第二核酸序列。在其他方面中，本发明的质量对照组合物(例如扩增全生物体对照材料)包括与游离核酸序列结合的全生物体，其中所述全生物体包含至少一个在NAT中检测的表征该生物体的核酸序列，并且所述游离核酸序列将在NAT中检测并且包括非天然存在于第一生物体中的特征。

在一些其他方面中，所述第一全载体或生物体还包括至少一个非天然存在于第一种或第二种载体或生物体中的核酸序列。在另一些方面中，所述第二载体或生物体包括至少两个非天然存在于第一种或第二种载体或生物体中的核酸序列。在某些方面中，所述载体是保护载体。

本发明提供了一种包括全生物体对照物的组合物，其中所述全生物体对照物包括全生物体，该全生物体包含(i)至少一个提供在核酸检测(NAT)中检测的生物体的特征的核酸序列；以及(ii)提供在NAT中检测的生物体中非天然存在的特征的第二核酸序列。

本发明还考虑了一种包括全生物体对照物的组合物，其中所述全生物体对照物包括全生物体，该全生物体包含(i)至少一个提供在核酸检测(NAT)中检测的生物体中非天然存在的特征的第一核酸序列；以及(ii)提供在所述生物体中非天然存在的第二特征并且将在NAT中检测的第二核酸序列。

在多个实施例中，本公开提供了一种包括全生物体对照物的组合物，该全生物体对照物包括两种或更多种全生物体，其中所述组合物包括：(i)第一全生物体，该第一全生物体包含至少一个表征在核酸检测(NAT)中检测的该生物体的核酸序列；以及(ii)至少一个第二生物体，该第二生物体包含提供在第一种或第二生物体中非天然存在的特征的第二核酸序列并将在NAT中被检测。在一些其他方面中，所述第一或第二生物体可包括两个或更多提供在第一或第二生物体中非天然存在的特征的核酸序列。

在多个实施例中，所述非天然存在的核酸序列是通过天然或遗传修饰方法引入到全生物体中的。在某些实施例中，所述非天然存在的核酸序列不是通过整合到生物体的基因组序列中的方式引入到全生物体中的。

在多个实施例中，所述非天然存在的核酸序列是通过整合到生物基因组中而引入到本发明的质量对照材料的保护载体或生物体中的。在某些实施例中，所述非天然存在的核酸序列是通过整合媒介或通过成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)技术整合到基因组中的。

在多个实施例中，所述非天然存在的核酸序列包含在媒介中，通过瞬时转染引入、病毒转导引入或整合到保护载体或生物体的基因组中。

在多个实施例中，所述非天然存在的核酸序列对将在NAT中检测的全部或部分基因或其变体进行编码。

已经考虑到，本文所述的核酸检测(NAT)包括或利用下列技术之中的一种或多种：聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、多重PCR或RT-PCR、分支DNA分析、连接酶链反应、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、核酸测序和下一代测序(NGS)。

在多个实施例中，所述保护载体可选自生物体(例如选自由细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物、寄生菌和真核细胞组成的组)或其他保护载体(例如脂质体)。在其他实施例中，本发明的第一或第二核酸序列可存在于质粒或其他媒介内部，或者在某些条件下存在于保护载体或生物体外部。

在多个实施例中，在所述全生物体对照物包括两种或更种生物体的情况下，所述第一和第二生物体可以是生物体族系中的相同物种或不同物种。在某些实施例中，在所述全生物体对照物包括两种或更多种生物体的情况下，所述第一和第二生物体或另外的生物体可具有相同的系统发育谱系或不同的系统发育谱系。

在多个实施例中，所述第一生物体是真核生物，而所述第二生物体或另外的生物是真核生物、细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物或寄生菌。在本文所述的其他实施例中，所述第一核酸序列可存在于质粒或脂质体中。

在多个实施例中，所述第一生物体是细菌，而所述第二生物体或另外的生物是真核生物、细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物或寄生菌。在本文所述的其他实施例中，所述第一核酸序列可存在于质粒或脂质体中。

在某些实施例中，所述第一生物体是病毒，而所述第二生物体或另外的生物体是真核生物、细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物或寄生菌。在本文所述的其他实施例中，所述第一核酸序列可存在于质粒或脂质体中。

在其他实施例中，所述第一生物体是真菌，而所述第二生物体或另外的生物体是真核生物、细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物或寄生菌。在本文所述的其他实施例中，所述第一核酸序列可存在于质粒或脂质体中。

在多个实施例中，所述第一生物体是古细菌，而所述第二生物体或另外的生物体是真核生物、细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物或寄生菌。在本文所述的其他实施例中，所述第一核酸序列可存在于质粒或脂质体中。

另外还考虑到，所述第一生物体是原生生物，而所述第二生物体或另外的生物体是真核生物、细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物或寄生菌。在本文所述的其他实施例中，所述第一核酸序列可存在于质粒或脂质体中。

在多个实施例中，所述第一生物体是寄生菌，而所述第二生物体或另外的生物体是真核生物、细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物或寄生菌。在本文所述的其他实施例中，所述第一核酸序列可存在于质粒或脂质体中。

在多个实施例中，若所述生物体是细菌，则所述第一生物体和所述第二生物体或另外的生物体是相同的细菌物种或不同的细菌物种。

在多个实施例中，若所述生物体是病毒，则所述第一生物体和所述第二生物体或另外的生物体是相同的病毒物种或不同的病毒物种。

在多个实施例中，所述第一生物体是真核细胞，而所述第二生物体或另外的生物体是细菌。

在具体实施方式一节中更详细地说明了所考虑的用于所述方法的示例性生物体。

在多个实施例中，本公开提供一种包括全生物体对照物的组合物，该全生物体对照物包括：a)没有经过任何遗传修饰的野生型第一生物体、以及作为NAT的目标的一个或多个遗传序列；以及b)也将在NAT中感测的包含经过修饰的核酸序列的第二生物体。

在多个实施例中，本公开提供一种包括全生物体对照物的组合物，该全生物体对照物包括：a)没有经过任何遗传修饰的野生型第一生物体、以及作为NAT的目标的一个或多个遗传序列；以及b)也将在NAT中感测的第二生物体。

在多个实施例中，所述第二核酸序列对选自由抗生素抗性基因、耐药性基因、生物标记、抗原、病毒基因、癌基因或肿瘤抑制基因组成的组的基因进行编码。在具体实施方式一节中更详细地说明了所考虑的用于所述方法的抗生素抗性基因和其他基因。

在多个实施例中，所述第一生物体是金黄色葡萄球菌，而所述第二生物体是大肠杆菌，其中所述大肠杆菌已被修饰为包含mecA基因。

在多个实施例中，所述生物体被灭活，所述灭活可选地是利用福尔马林、醛和其他化学物质、伽马辐射、紫外线辐射、脱水、X射线、加热或清洁剂进行的。在一些方面中，可采用利用电磁辐射(包括伽马辐射)灭活用作分子对照物的病原体的方法，所述电磁辐射的水平能够灭活对照物的生物活性，同时保持样品DNA足够完整以供处理和分析。

本发明提供了一种质量对照组合物，例如包括全生物体对照物的组合物，该组合物包括(i)全生物体，该全生物体包含至少一个提供在NAT中检测的该生物体的特征的核酸序列；以及(ii)足量的游离核酸，该游离核酸提供在生物体中非天然存在的特征并在NAT中检测。

在本发明中还考虑了一种质量对照组合物，例如包括全生物体对照物的组合物，该组合物包括(i)全生物体，该全生物体包含至少一个提供在NAT中检测的该生物体中非天然存在的特征的核酸序列；以及(ii)足量的游离核酸，该游离核酸是提供在生物体中非天然存在的特征第二核酸序列并在NAT中检测。

还考虑了一种用于感测生物检测样品中的生物体或核酸序列的方法，该方法包括：(a)获得怀疑包括感兴趣的生物体或核酸序列的生物样品；(b)提供所述的全生物体对照物，该全生物体对照物包括在与检测样品的介质对应的介质中的生物体；(c)使用核酸检测(NAT)感测感兴趣的生物体或核酸序列；以及(d)将在生物样品中感测到的核酸水平与在全生物体对照物中感测到的核酸水平进行比较。

本公开还提供了一种用于感测生物检测样品中的生物体或核酸序列的方法，该方法包括：(a)获得疑似包括感兴趣的生物体或核酸序列的生物检测样品；(b)在与检测样品的介质对应的介质中提供包括两种或更多种受保护的全核酸或全生物体的多保护载体或多生物体对照物；(c)使用核酸检测(NAT)感测感兴趣的保护载体、生物体或核酸序列；以及(d)将在生物样品中感测到的核酸水平与在对照物中感测到的核酸水平进行比较。

在多个实施例中，所述用于检测样品的介质选自由全血、血清、血浆、去纤维血浆、经过稳定化的血浆池、脑脊液、尿液、唾液、精液、痰、鼻拭子和阴道拭子组成的组。

在本发明中还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括本文所述的全生物体对照物和使用说明。

在多个实施例中，所述质量对照组合物中的保护载体或全生物体对照物包括编码和表达能够在免疫测定中感测的蛋白质的核酸序列，并且其中所述保护载体或全生物体对照物可用于NAT和免疫测定。在相关实施例中，所述核酸序列对选自由抗生素抗性基因、抗药性基因、生物标志、病毒基因、癌基因或肿瘤抑制基因的基因进行编码，其中所述表达的蛋白质是在免疫测定中可感测的。

本发明还考虑了一种用于感测生物检测样品中的生物体或核酸序列的方法，该方法包括：(a)获得疑似包括感兴趣的生物体或核酸序列的生物检测样品；(b)提供如本文所述的质量对照组合物或全生物体对照物，该质量对照组合物或全生物体对照物包括在与检测样品的介质对应的介质中的生物体，还包括在对照物中非天然存在的特征或蛋白质的表达元件；(c)使用核酸检测(NAT)感测感兴趣的生物体或核酸序列和/或所述表达元件；(d)可选地在免疫测定或基于表达的测定中感测由表达元件编码的蛋白质；以及(e)将在生物样品中感测到的表达元件和/或核酸水平与在对照物中感测到的表达元件和/或核酸水平进行比较。

在多个实施例中，所述免疫测定中的蛋白质包括至少一个使用抗体感测的抗体表位。

在多个实施例中，所述质量对照或全生物体对照物是同时通过NAT和免疫测定感测的。在其他实施例中，所述质量对照或全生物体对照物是顺序地通过NAT和免疫测定感测的。

在多个实施例中，所述免疫测定包括阵列、微阵列形式、基于板的形式、基于微珠的形式或基于凝胶的形式。

在多个实施例中，所述免疫测定或基于表达的测定的对照物是以液体或固体形式提供的。

上文的概述并不旨在限定本发明的每个方面，在其他章节(例如具体实施方式一节)中还说明了其他方面。整个文档旨在关联为统一的公开内容，并且应理解，已考虑了在本文中说明的特征的所有组合，即使这些特征的组合没有在本文的同一句子、段落或章节中一起列出。此外，作为一个附加方面，本发明包括在范围上比上述具体提及的变化形式窄的本发明的所有实施例。关于用“一个”描述或提出的本发明的方面，应理解，这些术语意味着“一个或多个”，除非上下文明确要求更严格的含义。关于作为一个集合中的一个或多个元素描述的元素，应理解，已考虑了该集合中的所有组合。在本发明的方面被描述为“包括”某个特征的情况下，实施例也被认为是“由该特征组成”或“基本由该特征组成”。通过整体地理解本申请，本公开的附加特征和变化形式对于本领域技术人员来说将变得明显，并且所有这些特征都旨在作为本公开的方面。

附图说明

以下附图仅用于说明本发明的各个方面，并不意味着限制本文所述的本发明的范围。

图1A示出了对质量对照组合物(即，扩增全生物体对照物)进行检测的NAT。在该图中，使用NAT来感测包含待通过NAT检测的MRSA的样品(检测物品)中的目标核酸序列(例如mecA)以及相应的NAT对照物，该对照物是用于评价检测物品的NAT的功能和/或感测该检测物品中的目标核酸序列的质量对照组合物。在此示例中，金黄色葡萄球菌作为保护载体。它包含非天然存在的基因物质，例如源自并表征在NAT中感测的目标核酸序列基因mecA(…)的序列。所述NAT包括用于感测所述基因物质的存在的部分检测“A”，该NAT也可用于感测天然地包含相似基因物质的生物体的存在，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)(即，检测物品)。本发明的方法考虑了各种变化而没有限制，其中MRSA可以是任何生物体，并且“A”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测。所述变化包括但不限于用另一种经过修饰的细胞或病毒或其他核酸保护载体取代金黄色葡萄球菌作为NAT对照物的成分的变化。

图1B示出了用于检测全生物体(例如真核细胞)中的目标核酸序列的NAT，其中所述目标核酸序列是作为NAT的对象(检测物品)的疾病易感性或基因标记，相应的NAT对照物是用于评价检测物品的NAT的功能并感测该检测物品中的目标核酸序列的质量对照组合物。在该图所示的NAT中，用于NAT的扩增全生物体对照物包括作为保护载体的任何全生物体(例如真核细胞)，该全生物体具有包含在NAT中检测的非天然存在的核酸序列的疾病易感性或基因标记，该NAT包括用于感测疾病易感性基因或基因标记的部分检测(“A”)。所述NAT对照物示出了本发明的一些实施例，其中非天然存在的核酸序列未整合在全生物体保护载体的基因组中。

图2A示出了多目标NAT和用于该多目标NAT的质量对照组合物，在该多目标NAT中检测扩增全生物体对照物。在此例中，MRSA(检测物品)包括通常在金黄色葡萄球菌中天然存在的核酸序列和目标核酸序列。在NAT中检测的扩增全生物体对照物是大肠杆菌(一种与检测物品中的生物体不同的生物体)，它包括两个非天然存在的基因物质区域，例如来自金黄色葡萄球菌的序列(对于检测物品的生物体中是天然存在的，但对于NAT对照物中的生物体不是天然存在的)和来自mecA的序列(表征目标核酸序列)，所述NAT包括用于感测所述基因物质的部分检测“A”，该NAT也可用于感测天然包含与两个序列相似的基因物质的生物体(例如MRSA)的存在。本发明的方法考虑了各种变化而没有限制，其中MRSA可以是任何生物体，并且“A”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测。所述变化包括但不限于用另一种经过修饰的细胞或病毒取代大肠杆菌作为NAT对照物的成分的变化。图2B示出了用于检测扩增全生物体对照物的NAT，该扩增全生物体对照物包括具有疾病易感性或基因标记的全生物体对照物(例如真核细胞)，该疾病易感性或基因标记包含在多目标NAT中检测的非天然存在的核酸序列和天然核酸序列，所述NAT包括用于感测该疾病易感性或基因标记的部分检测(“A”)。

图3示出了一种多目标NAT，其中质量对照组合物是多保护载体对照物，例如多生物体对照物。在此图中，对作为多生物体对照物的扩增全生物体对照物进行检测(并用于评价检测物品(MRSA)的NAT的功能，所述MRSA包含在金黄色葡萄球菌中天然存在且常见的天然核酸序列和目标核酸序列。在此例中，在NAT中检测了NAT对照物大肠杆菌(第二核酸序列的保护载体)和金黄色葡萄球菌(第一核酸序列的第一保护载体)，所述大肠杆菌包含非天然存在的基因物质，例如来自mecA的序列(第二核酸序列，它表征目标核酸序列在检测物品中的存在)，所述金黄色葡萄球菌包括来自金黄色葡萄球菌的天然存在的序列(但不是目标序列)，所述NAT包括用于感测所述基因物质的部分检测“A”，该NAT也可用于感测天然包含与这两个序列相似的基因物质的生物体(例如MRSA)的存在。本发明的方法考虑了各种变化而没有限制，其中MRSA可以是任何生物体，并且“A”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测。所述变化包括但不限于用其他经过修饰的细胞或病毒取代大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为NAT对照物的成分的变化。

图4A示出了一种多目标NAT，其中质量对照组合物是多保护载体对照物(例如多生物体对照物)。此图示出了在NAT中检测了一种扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物是一种多生物体对照物，并且用于评价检测物品的NAT功能。在此例中，在NAT中检测了人5型腺病毒和金黄色葡萄球菌，所述人5型腺病毒包含非天然存在的基因物质，例如来自并表征mecA的序列，mecA是检测物品的目标序列(统称为5型腺病毒，所述非天然存在的基因物质是第二受保护的核酸序列(在本文中使用该术语))，所述金黄色葡萄球菌包含来自金黄色葡萄球菌的天然存在的序列(统称为第一受保护的核酸序列)，所述NAT包括用于感测所述基因物质的部分检测“A”，该NAT也可用于感测天然包含与这两个序列相似的基因物质的生物体(例如MRSA)的存在。本发明的方法考虑了各种变化而没有限制，其中MRSA可以是任何生物体，并且“A”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测。所述变化包括但不限于用其他经过修饰的细胞或病毒取代金黄色葡萄球菌和人5型腺病毒作为NAT对照物的成分的变化。图4B示出了一种多生物体对照物：扩增全生物体对照物，它包括第一生物体(例如真核细胞)和第二生物体(例如细菌)，第一生物体被修饰为包含非天然存在的核酸序列(统称为第二受保护的核酸序列)，第二生物体包含天然存在的核酸序列(统称为第一受保护的核酸序列)，这两种生物体都在多目标NAT中检测，以评价用于对检测物品进行感测的NAT的功能。在此例中，对照物的生物体(或保护载体)之一是细菌，并且检测物品中的生物体是细菌。图4C示出了一种多生物体对照物：扩增全生物体对照物，它包括第一生物体(例如真核细胞)和第二生物体(例如真核细胞)，第一生物体被修饰为包含非天然存在的核酸序列，第二生物体包含天然存在的核酸序列，这两种生物体都在多目标NAT中检测。在这些例子中，NAT对照物的生物体和检测物品的生物体都是真核细胞，但是它们不一定是相同的真核细胞。图4D示出了一种多生物体对照物：用于图中所示的检测物品(生物体，例如具有目标序列的真核细胞)的扩增全生物体对照物，该对照组合物包括第一生物体(例如病毒)和第二生物体(例如真核细胞)，第一生物体被修饰为包含非天然存在的核酸序列(第二受保护的核酸序列)，第二生物体包含天然存在的核酸序列(第一受保护的核酸序列)，这两种生物体都在多目标NAT中检测，以评价用于检测物品的NAT的功能。图4E示出了一种多生物体对照物：用于评价检测物品的NAT的功能的扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物包括第一生物体(例如细菌)和第二生物体(例如真核细胞)，第一生物体被修饰为包含非天然存在的核酸序列(表征检测物品中的目标核酸序列的核酸序列)(统称为第二受保护的核酸序列)，第二生物体包含天然存在的核酸序列(第一受保护的核酸序列)，这两种生物体都在多目标NAT中检测。图4F示出了一种多保护的核酸序列对照物，即，多生物体对照物：用于多生物体“A”和“B”(和/或多目标)检测物品的扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物包括第一生物体(例如细菌)、第二生物体(例如病毒)和第三生物体(例如病毒)，第一生物体包含天然核酸，该天然核酸的存在表征生物体A，第二生物体包含用于NAT的天然核酸，该天然核酸通常表征生物体“B”的存在，但不是生物体“B”的目标核酸序列(第一受保护的核酸序列)，第三生物体被修饰为包含非天然存在的核酸，该非天然存在的核酸表征检测物品中的生物体“B”的目标序列，每种成分均是多重NAT的对象，并可用于评价检测物品的多重NAT的功能。图4G也示出了一种多生物体对照物：扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物用于多重NAT以评价检测物品的多重NAT的功能。所示的NAT对照物包括第一生物体(例如细菌)、第二生物体(例如病毒)和第三生物体(例如真核细胞)，第一生物体包含天然核酸，第二生物体包含天然核酸(第一受保护的核酸序列)、第三生物体被修饰为包含用于多重NAT的非天然存在的核酸序列(第二受保护的核酸序列)，所有这些生物体都在NAT中检测。图4H示出了一种多生物体对照物：扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物包括第一生物体(例如细菌)、第二生物体(例如病毒)和第三生物体(例如真核细胞)，第一生物体被修饰为包含表征生物体A中的目标序列的非天然存在的核酸序列(因此细菌或另一种生物体或保护载体被修饰为包含该序列)，第二生物体包含用于NAT的通常表征生物体B的天然核酸(但不是生物体B的目标序列)，第三生物体被修饰为包含非天然存在的核酸(即，生物体B的目标序列)，该扩增全生物体对照物用于在多重NAT中进行检测，并评价检测物品的多重NAT的功能。

图5A示出了一种多目标NAT，其中对扩增全生物体对照物进行检测，该扩增全生物体对照物是与核酸序列混合的全生物体对照物。在此例中，在NAT中检测了质粒和金黄色葡萄球菌，所述质粒包含基因物质(例如来自并表征mecA的序列(第二核酸序列，未被保护))，所述金黄色葡萄球菌包括来自金黄色葡萄球菌的天然存在的序列(第一被保护的核酸序列)，所述NAT包括用于感测所述基因物质的部分检测“A”，该NAT也可用于感测天然包含与这两个序列相似的基因物质的生物体(例如MRSA)的存在。本发明的方法考虑了各种变化而没有限制，其中MRSA可以是任何生物体，并且“A”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测。所述变化包括但不限于用其他经过修饰的细胞或病毒取代金黄色葡萄球菌以及用其他形式或制备方式的核酸取代质粒作为NAT对照物的成分的变化。图5B示出了一种多生物体对照物：扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物包括第一核酸序列和生物体(例如真核细胞)，所述第一核酸序列在包含表征检测物品中的目标序列的非天然存在的核酸序列的载体中(例如质粒)，所述生物体包含天然存在的核酸序列，这两种物质都在多目标NAT中检测。图5C示出了一种多生物体对照物：扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物与图4G的扩增全生物体对照物类似，但是其中的第三生物体被质粒取代。图5C示出了一种多生物体对照物，该多生物体对照物包括包含非天然存在的核酸序列的第一载体(例如质粒)、一种包含天然存在的核酸序列的生物体(例如病毒)以及另一种包含天然存在的核酸序列的生物体(例如细菌)，所有这些物质都在多重NAT中检测。

图6A示出了一种多目标NAT，该多目标NAT与图3的多目标NAT类似，但是其中的一种保护载体是脂质体。图6示出了对一种扩增全生物体对照物进行的检测，该扩增全生物体对照物是与包含核酸序列的脂质体混合的全生物体对照物。在此例中，在NAT中检测了一种脂质体，该脂质体包括基因物质(例如来自mecA的序列)和金黄色葡萄球菌，该金黄色葡萄球菌包含来自金黄色葡萄球菌的天然存在的序列，所述NAT包括用于感测所述基因物质的部分检测“A”，该NAT也可用于感测天然含有与这两个序列相似的基因物质的生物体(例如MRSA)的存在。本发明的方法考虑了各种变化而没有限制，其中MRSA可以是任何生物体，并且“A”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测。所述变化包括但不限于用其他经过修饰的细胞或病毒取代金黄色葡萄球菌以及用其他形式或制备方式的包封核酸取代脂质体作为NAT对照物的成分的变化。图6B示出了一种多生物体对照物，该多生物体对照物与图4C、4D和4E中的多生物体对照物类似，但是其中一种保护载体是脂质体。图6B示出了包含一种扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物包括包封的第一生物体(例如脂质体)和第二生物体(例如真核细胞)，第一生物体包含非天然存在的核酸序列，第二生物体包含天然存在的核酸序列，这两种生物体都在多目标NAT中检测。图6C示出了一种多生物体对照物，该多生物体对照物与图4F和4G中的多生物体对照物类似，但是其中一种保护载体是脂质体。图6C示出了一种扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物包含包封的第一生物体(例如细菌)、第二生物体(例如病毒)和第三种生物体(例如脂质体)，第一生物体包含天然核酸，第二生物体包含用于NAT的天然核酸，第三生物体包含用于多重NAT的非天然存在的核酸。

图7示出了一种多目标NAT质量对照组合物，其中对扩增全生物体对照物(多生物体对照物)进行了检测。在此例中，在NAT中检测了新城疫病毒和流感病毒，所述新城疫病毒包含非天然存在的基因物质，例如来自PB2的序列，所述流感病毒包括天然存在的序列，所述NAT包括用于感测所述基因物质的部分检测“A”，该NAT还可用于感测天然含有与这两个序列相似的基因物质的生物体(例如高病毒性流感)的存在。本发明的方法考虑了各种变化而没有限制，其中高病毒性流感可以是任何生物体，并且“A”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测。所述变化包括但不限于用其他经过修饰的细胞或病毒取代流感病毒和新城疫病毒作为NAT对照物的成分的变化。

图8示出了一种用于天然免疫测定和NAT的质量对照组合物，该质量对照组合物包含用于免疫测定和NAT的扩增全生物体对照物，该全生物体对照物包括全生物体，该全生物体表达至少一个提供在NAT(包括部分检测(‘A’)中检测的该生物体的特征的核酸序列和一个在免疫测定中检测的抗体表位，其中所述全生物体对照物被配制为适合用于上述两种检测之中的任何一种。

图9示出了一种质量对照检测和组合物，该组合物包括用于免疫测定和NAT的扩增全生物体对照物，该全生物体对照物包括全生物体，该全生物体包含至少一个提供在NAT中检测的该生物体的特征的核酸序列，还包含(或第二生物体包含)提供在免疫测定中检测的该生物体的特征的抗体表位，其中所述全生物体对照物被配制为适合用于上述两种检测之中的任何一种。

图10示出了本发明的方法用于包括多重NAT的一般例子，所述多重NAT包括部分检测“A”和部分检测“B”，部分检测“A”是通常用于感测来自生物体“A”的天然存在的序列的NAT，部分检测“B”是通常用于感测来自生物体“B”的两个天然存在的序列的多重NAT。在此例中，扩增全生物体对照物由三种生物体组成，其中一种生物体包括在部分检测“A”中感测的序列，另外两种生物体共同包括在部分检测“B”中感测的序列，所有三个序列都在多重NAT中检测。本发明的方法考虑了各种变化而没有限制，其中A可以是任何生物体，“A”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测，B可以是任何生物体，“B”是通常可用于感测所述生物体的NAT的部分检测，并且还可进行附加的部分检测和检测相应的生物体，对此没有限制。所述变化包括但不限于用其他组合、经过修饰的细胞或病毒、或者游离或包封的核酸取代所示的物质作为NAT对照物的成分的变化。

具体实施方式

本发明公开了用作评价核酸检测(NAT)的功能的质量对照的组合物。还公开了制备和使用这样的组合物的相关方法和试剂盒。

NAT通过感测样品(例如人、兽等生物样品、空气、水或土壤等环境样品)内的检测物品(例如生物体)中的特定感兴趣的核酸序列(目标核酸序列)的方式工作。

例如，为了从患者的鼻子或伤口拭子样品(样品)中感测抗生素抗性细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)(检测物品)，所述目标核酸序列在一些实施例中可以是mecA，该mecA是被识别为赋予金黄色葡萄球菌抗生素抗性(例如导致MRSA)的基因。在一些方面中，NAT被用于提供所述检测物品存在的证据(例如MRSA等生物体)。

在一个例子中，NAT的基本特征包括：样品(或检测物品)处理步骤、核酸提取步骤(在一些实施例中包括裂解和分离)，以及通常包括的扩增步骤和感测步骤。

因此，在开发质量对照组合物和物质以评价用于感测特定目标核酸序列或检测物品(例如生物体)的NAT的功能时，需要评价核酸序列在NAT的感测步骤中存活的能力。例如，在本发明的一些方面中，本文所述的对照物可在用于评价NAT在整个过程中对核酸序列的劣化或损耗的影响的方法中使用。在本发明的一些其他方面中，本文所述的对照物可用于更好地评价阴性结果实际上是意味着阴性结果还是核酸序列在过程的劣化或其他原因的结果。在本发明的其他一些方面中，本文所述的对照物可用于更好地评价阳性结果实际上是意味着阳性结果还是感测方法(例如PCR扩增中的引物或探针或选定的目标序列)不够特异性或者任何组分的污染或其他原因的结果。类似地，对于NAT的其他组成部分，本文所述的对照物可用于评价提取(以及在一些实施例中)用于扩增和感测核酸序列的过程的能力，以及用于评价任何抑制剂的存在、试剂的质量和/或设备的正常工作。

此外，在开发或选择用于NAT的质量对照组合物的特征时，在一些方面中，要选择能最好地模拟通过多个NAT步骤处理样品或检测物品的特征。由于生物体的致病性、致命性或毒性、处理问题、以及产生对照物的生长或培育难题，使用包括作为NAT目标的生物体的对照物通常是不理想的。因此，希望开发一种用于产生质量对照组合物的系统，该质量对照组合物不包括整个天然检测物品或者至少不包括检测物品的非致病性、致命性或毒性形式，但是能表征检测物品的存在。

在另一个方面中，由于不同的检测中心可能使用针对检测物品的不同特征选择的不同NAT(包括选择不同的核酸序列来感测同一检测物品)，因此在一个方面中，希望开发可用于评价检测物品的多于一种这样的NAT的功能的质量对照组合物。

关于这一点，进一步说，例如有可能构建NAT以通过确定核酸序列(“目标序列”)的存在来识别特定物种的生物体存在，并且在大多数生物体中存在关于可能的目标序列的非常多样选择。许多对照物仅对某个特定的NAT或一组特定的NAT有用，而并非对所有的NAT都有用。例如，这种对照物可能仅包含待检物质的核酸的一部分(例如包含目标序列的序列)，但不包含待检物质的整个序列。在一些方面中，本发明提供了一种制备在特定生物体的NAT中广泛有用的对照物的方法。在本发明的一些方面中，许多可能的目标序列的全部或大部分存在于一种或多种载体内的对照组合物中。构造这种对照物的一种方法是获得生物体的典型实例，并以适当的量置于适当的样品基质中，以用作对照物。但是，获得这样的生物体来提供对照物会给对照物的生产商带来问题。这些问题包括因多种原因(运输禁令、标本位置偏远、一些生物体的危险性质导致进口障碍、拥有这些生物体的人不愿意提供这些生物体、以及其他原因)而难以获得所述生物体。此外，为了产生用于广泛分发的足量对照物，有时需要繁殖、培养或培育这种生物体。某些生物体可能具有生物危害性，因此可能需要大量且昂贵的设施、设备、人员和供应品来培养这些生物体，这可能减缓使用这种生物体进行的对照物生产，或者使这种生产变得不切实际。此外，为了生产能对快速进化的生物体(包括病原体)做出反应的对照物，需要提供包括代表新的生物体株的新基因序列的对照物，而这可能很昂贵且耗时，并且可能因上述原因而延误这种对照物的供应。在一些方面中，本发明解决了其中的一个或多个问题。

此外，在本发明的一些方面中，在NAT中感测多于一个核酸序列，以感测一个或多个目标核酸序列之中的某个核酸序列的多个区域，或者感测表征检测物品中的不具有目标核酸序列的生物体的株、种和族系的非目标特征或核酸序列。在一些实施例中，只需要在NAT中感测一个核酸序列来确定目标核酸序列在检测物品中的存在；而在其他实施例中，需要感测多于一个核酸序列来确定目标核酸序列和/或检测物品的存在。在另一个方面中，所述质量对照组合物包括目标核酸序列的多个核酸区域，以使其能够在目标核酸序列的多于一个或多个NAT中被感测到。类似地，为了控制非目标核酸序列的感测，在一些实施例中，所述非目标核酸序列可能对没有目标核酸序列的被检生物体是特异性的。因此，本发明人开发了一种质量对照组合物，该质量对照组合物可以是更通用的质量对照组合物。

本发明提供了一种开发用于NAT的质量对照材料和组合物的系统和方法、以及一种可单独使用或与其他NAT或其他感测工具(例如用于感测被检样品中的相同或不同检测物品的免疫测定)结合使用的质量对照物和组合物。本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括所述质量对照组合物和/或其组分和/或用于制备任何前述物质，并且包括制备和使用所述组合物和组分的说明。

在一些方面中，在本发明中提供的用于评价NAT的功能的质量对照组合物是一种扩增全生物体对照物，该扩增全生物体对照物包括在核酸检测(NAT)中用于评价NAT的功能和用于评价感测生物检测样品中的生物体的方法的材料。

本公开考虑了质量对照组合物的用途，例如作为用于核酸检测(NAT)的扩增全生物体对照物。在多个实施例中，本发明的质量对照组合物可用于评价NAT的功能，其中所述NAT用于感测在检测物品中存在某种生物体和目标核酸序列，所述质量对照组合物包括：(i)包括第一核酸序列的一个(或者在一些实施例中多于一个)第一受保护的核酸序列，该第一核酸序列的存在表征在检测物品中存在具有在NAT中被检测的所述第一核酸序列的生物体；以及(ii)包括第二核酸序列的一个(或者在一些实施例中多于一个)第二受保护的核酸序列，该第二核酸序列的存在表征在检测物品中存在包括在NAT中被检测的所述第二核酸序列的目标核酸序列，其中所述第一和第二受保护的核酸序列共同或分别存在于多于一种保护载体中，其中所述保护载体可以是相同或不同类型的保护载体，其中所述第二受保护的核酸序列不是天然存在于其保护载体中。

在一些实施例中，所述保护载体之中的至少一种(例如，在一些实施例中是生物体)是在通过NAT处理时具有与在检测样品中检测其存在的生物体相同或相似的核酸保护特性。

在多个实施例中，所述第一核酸序列的保护载体(例如，在一些实施例中是生物体)在通过NAT处理时具有与所述生物体或包括将在检测物品中检测其存在的目标序列的生物体相同或相似的核酸序列保护特性，其中所述保护载体不包括目标核酸序列。

在多个实施例中，在本发明的质量对照组合物中：(i)所述包括将在NAT中检测的目标核酸序列的生物体是致命性、致病性或毒性生物体，或者，其中在所述目标核酸序列与或不与另外的序列一起存在时，该生物体被赋予致命性、致病性或毒性性状；并且(ii)所述第一受保护的核酸序列的保护载体是包括不包含目标核酸序列的天然基因组核酸序列的生物体的低致命性或非致命性和/或致病性形式。

在多个其他实施例中，所述第二核酸序列：(i)选自表征目标核酸序列的核酸序列的一部分，或(ii)被修饰为使得第二核酸序列不会单独或与组合物中的其他核酸序列组合地表达为使目标序列的遗传特征得到表达。

在一些实施例中，本发明的质量对照组合物包括多于一个第一核酸序列，并且每个第一核酸序列是表征检测物品中的生物体的不同核酸序列，至少一个但不一定所有的第一核酸序列都在NAT中被检测。

在另一个实施例中，本发明的质量对照组合物是一种全生物体对照物，包括：(a)待进行样品筛选的生物体的致命性、致病性或毒性较低的版本，该版本的生物体比将在NAT中筛选的生物体的致命性、致病性或毒性较低，或危险性较低；以及(b)决定全生物体的致命性、致病性或毒株的存在的一个或多个核苷酸序列，这些核苷酸序列包含(i)提供在核酸检测(NAT)中检测的生物体的特征的至少一个核酸序列、以及(ii)提供在NAT中检测的生物体中非天然存在的特征的第二核酸序列。

在本发明的一些其他方面中，所述质量对照组合物是扩增全生物体对照物组合物/材料，其中所述扩增全生物体对照物包括全生物体，该全生物体包括至少一个提供在NAT中检测的生物体的特征的核酸序列，并且包括提供在NAT中检测的生物体中非天然存在的特征的第二核酸序列，并在NAT中被检测。在一些其他方面中，所述扩增全生物体对照物包括两种或多种全生物体，其中所述对照材料包括第一全生物体，该第一全生物体包括至少一个表征在NAT中检测的该生物体的核酸序列；以及至少一个第二生物体，该第二生物体包括提供在第一种或第二种生物体中非天然存在的特征第二核酸序列，并在NAT中检测。对于存在包括第一和第二核酸序列的天然存在的生物体的情况，这些生物体不应与本文中所用的扩增全生物体对照物相混淆。

定义

在合理的前提下，本文中的复数应同样地表示单数，而单数也应同样地表示复数。词语“例如”或“举例来说”或类似的短语应解释为与“例如但非限制”等效，因而任何例子都不应限制该例子所属的一般性。

包括

本发明可包括本发明的组分以及本文说明的其他成分或元素和/或未说明的成分或元素，或基本上由这些组分、成分和元素组成。在本文中所用的术语“包括”或该术语的其他变化形式指所列举的元素或在结构或功能上等同的元素加上未列举的任何其他元素。此外，这些术语应视为与“包含”、“含有”或“……的特征”的等同变化形式同义，按与上下文一致的最广泛且最包容的方式解释，并且是开放式的，不排除附加的未引用的元素或方法步骤。术语“具有”和“包含”也应理解为开放式的，除非在上下文中另有说明。在本文中所用的术语“基本上由……组成”指本发明还可包括除了权利要求中所述的成分之外的其他成分，但前提是这些其他成分不会实质性地改变所要求保护的发明的基本和新颖特征。

“……的特征”

“……的特征”在本文中指对于感兴趣的特性或性质(例如目标核酸序列或生物体)足够特异性从而使其能够用于指示或提供证据或将其与所述感兴趣的特征(例如所述目标核酸序列或生物体)的存在相关联的特征或性质(例如核酸序列或蛋白质或表位)。该术语在本文中经常用作“目标核酸序列的特征”或“生物体或检测物品的特征”或“任何前述物质存在的特征”。

核酸检测(NAT)

在本文中所用的术语“核酸检测”或“NAT”指一种或多种对生物有机体或性状或遗传成份的存在或不存在的检测，该检测可利用感测生物体或者生物体性状或成份的核酸或核酸序列的方法来进行。例如，NAT可基于对生物体或性状或遗传成份的DNA或RNA序列的感测。NAT可使用已知的方法来感测核酸，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、分支DNA分析、连接酶链式反应、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、核酸测序、下一代测序(NGS)、环介导等温扩增、解旋酶依赖性扩增、循环探针技术、连接酶链式反应、入侵者技术和杂交捕获。此外，还可开发新的感测方法，这些检测方法通常依赖于核酸的存在和/或序列，本发明也适用于这些方法并与之相关，并且这些方法被认为是如本文所定义和包括的NAT。

这种对生物体存在和/或定量的检测可通过感测感兴趣的生物体基因组的大部分或完整部分(例如通过限制性酶消化和凝胶电泳，或通过测序)工作，或者可通过感测感兴趣的生物体基因组的较小部分工作(例如基于外源添加的核酸寡聚体与生物体基因组的互补部分结合并引发该部分的聚合酶介导的扩增的能力，对基因组的一部分进行PCR介导的扩增)。

可出于各种原因进行NAT，包括但不限于传染病诊断、传染病监测、遗传病诊断、遗传病监测、环境科学、法医学、研究、开发、考古学、食品安全、动物健康以及解决许多其他科学和实践问题。这种检测可以是定性的，也可以是定量的，或者两者兼有。在一些其他方面中，NAT可用于感测好的、想要的或有益的生物体，或不存在坏的、不想要的、非有益的生物体，例如想要的和不想要的肠道菌群或环境水菌群。

这种检测可以较高或较低的灵敏度或特异性进行，以适应不同的要求和应用。

免疫测定

在本文中所用的术语“免疫测定”指是对生物有机体或特性或元素的存在或不存在的任何检测，该检测可利用感测方法来进行，所述检测方法包括实体的亲和力和/或互补性介导的结合，所述实体包括但不限于与生物体的元素或形状结合的抗体、免疫球蛋白、DNA寡聚体、适体、蛋白质支架、蛋白质受体或其他结合部分。例如，免疫测定可基于对生物体或性状的特定多肽或碳水化合物序列的感测。“免疫测定”也可指一种或多种检测，并且可使用已知的感测方法，包括但不限于酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫沉淀、印迹试验、表面等离子共振和许多其他方法。此外，还可开发新的感测方法，这些感测方法通常依赖于结合物种的存在，本发明也适用于这些检测方法并且与之相关，并且这些检测方法被认为是本文定义和包括的免疫测定。

这种对生物体的存在和/或定量的检测可通过感测感兴趣的生物体的成份的大部分或完整部分而工作，或者可通过感测感兴趣的生物体的成份的一小部分(例如肽片段)而工作。

可出于各种原因进行免疫测定，包括但不限于传染病诊断、传染病监测、遗传病诊断、遗传病监测、环境科学、法医学、研究、开发、考古学、食品安全、动物健康以及解决许多其他科学和实践问题。这种检测可以是定性的，也可以是定量的，或者两者兼有。这种检测可以较高或较低的灵敏度或特异性进行，以适应不同的要求和应用。

基于表达的测定

如本文所用，“基于表达的测定”指任何对生物生物体或特征或元素的存在或不存在的检测，该检测可利用使用外部提供的元素与生物体或生物体性状的元素结合的感测方法来进行。这种测定可与免疫测定或NAT结合进行，或者可通过免疫测定或NAT进行。例如，DNA适体可用于感测生物体或性状的特定多肽或碳水化合物部分。“基于表达的测定”也可指一种或多种检测，包括但不限于在本文中描述或设想为“NAT”或“免疫测定”的任何方法，并且可包括阵列或微阵列形式、基于平板的形式、基于微珠的形式、基于凝胶的形式、以及本领域技术人员已知的许多其他形式。此外，可开发新的感测方法和形式，这些感测方法和形式通常依赖于本发明也适用的类似原理或操作模式。

这种对生物体的存在和/或定量的检测可通过感测感兴趣的生物体的成份的大部分或完整部分而工作，或者可通过感测感兴趣的生物体的成份的一小部分(例如肽片段)而工作。

可出于各种原因进行基于表达的测定，包括但不限于传染病诊断、传染病监测、遗传病诊断、遗传病监测、环境科学、法医学、研究、开发、考古学、食品安全、动物健康以及解决许多其他科学和实践问题。这种检测可以是定性的，也可以是定量的，或者两者兼有。这种检测可以较高或较低的灵敏度或特异性进行，以适应不同的要求和应用。

多目标NAT

在本文中所用的术语“多目标NAT”指同时感测或测量生物体内的多于一个序列以确定一些感兴趣的协调或关联属性(即，“遗传性状”或“特征”，这些术语在本文中可互换使用)。多目标NAT可由同时或顺序执行的NAT组成，并且可在相同的反应环境或不同的反应环境中执行。举例但非限制性地说，针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌存在的多目标NAT检测可包括针对金黄色葡萄球菌存在的第一序列特征的NAT检测、以及同时或顺序进行的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的序列特征的第二NAT检测。本文所公开的所有测定(包括免疫测定)可以是多目标的。

多重NAT

在本文中所用的术语“多重NAT”指包括两个或更多NAT和/或多目标NAT的检测，这些检测同时感测或测量检测物品或生物检测样品中的两种或多种生物体和/或两种或多种不同性质。无论是否明确说明，本文公开的所有测定(包括免疫测定)以及相应的所有对照物应视为可作为多重测定或用于多重测定的对照物来操作，除非这与上下文明显不相容。图10示出了用于本发明的多重NAT的广义的全生物体对照物的一些实施例。

样品和生物检测样品

在本文中所用的术语“样品”或“生物检测样品”或“检测样品”指在NAT中检测的样品，并且在本文中经常可互换使用。在某些方面中，还包括或指可从样品衍生出的“检测物品”(例如通过样品的处理衍生)。在本文中所用的术语“检测物品”指一个或多个疑似存在于样品中的物品(例如生物体)，并且该物品在NAT中进行检测。在各个实施例中，将生物检测样品与本发明的质量对照组合物(例如扩增全生物体对照材料)进行比较，以感测感兴趣的生物体或核酸。在一些实施例中，会使用本发明的质量对照组合物来确定(或确认或验证或质疑)测定的操作，以支持对样品中的生物体或核酸或其他感兴趣元素的独立或同时感测。“检测样品介质”或“样品”或“生物样品”的“介质”指源自样品或存储样品的流体或其他介质。此外，介质可与生物体介质或其他介质对应，并且包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、其他有机或无机缓冲剂、以及可模拟血液或血液成分或其他体液的一些性质或特性的工程流体、或在本文中设想的其他介质。此外，有时样品的流体是输送介质，该输送介质可包含或不包含有机成分。检测样品的示例性来源或介质包括全血、血清、血浆、去纤维血浆、经过稳定化的血浆池、脑脊液、尿液、唾液、精液、痰、鼻拭子和阴道拭子。

生物体

在本文中所用的术语“生物体”指活体的一个或多个细胞(包括病毒)，这应与上下文相符。生物体包括真核生物、真核细胞、原核生物、原核细胞、细菌、病毒、真菌、真菌细胞、古细菌、原生生物或寄生生物。举例但非限制性地说，在人类细胞的情况下，“生物体”指指细胞。进一步举例但非限制性地说，在不具有基因突变或差异的细胞群中带有基因突变或差异的细胞可被认为是与不具有所述突变或差异的细胞不同的生物体。在本文中所用的术语“生物体族系”指系统发育树的所有成员。在本文中所用的术语“生物体”指应解读为在与上下文相符的前提下广义地指生物体族系，在可能不是生物体族系成员广泛或普遍共有的特定遗传特征的上下文中更狭义地指生物体族系的株的子集。

全生物体

在本文中所用的术语“全生物体”指由来自全生物体的片段或部分或者制剂的完好的或大部分完好的细胞或病毒组成的生物体(无论其是存活的还是非存活的)。可选地可纯化全生物体，保留细胞或病毒的至少一部分但不一定是全部的总体结构。

载体

在本文中所用的术语“载体”是包含核酸的任何实体或载体，该实体或载体可包裹、包封或包含核酸，可以是生物体(例如完整的生物体)，但不一定是活的生物体，在一些方面中，所述载体包括但不一定限于脂质体(例如0.1纳米-3微米)、微球(例如0.1-100微米)、附加体、质粒(例如1-200kbp)以及其他基本完好的合成体，该合成体包括或包含用于NAT或其他测定的一个或多个核酸序列。所述载体还包括但不限于游离核酸、末端保护的核酸、质粒、噬菌体、粘粒、保护载体和生物体。

保护载体

保护载体是任何封闭或结合物质或屏障，包括但不限于：细菌、真核细胞、蛋白质衣壳或壳体(例如病毒衣壳、蛋白质衣壳或壳体)、微室、工程蛋白质壳体、病毒、病毒样颗粒、脂质体、无核细胞、囊泡、纳米囊泡、外体、胶束、固体脂质纳米颗粒、脂质包覆颗粒、纳米管、纳米晶体、聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒、电解质间复合物(多聚体)或树枝状聚合物、铠装RNA、或用于在NAT的核酸提取过程步骤之前抑制NAT中的核酸序列损耗或降解和/或使核酸序列在NAT的核酸提取步骤中能够被回收(优选基本上回收)和/或充分保护其中的核酸序列(例如本文所用的第一和第二核酸序列)以使其能够在NAT中被感测的其他适当物理边界。“保护特性”具有相似和相应的含义，指载体能够基于任何一个或多个前述特征(即，在NAT的核酸提取过程步骤之前抑制核酸序列的损耗或降解、和/或在核酸提取步骤中被回收(优选基本上回收)核酸序列、和/或充分保护其中的核酸序列(例如在本文中所用术语所表示的第一和第二核酸序列)以使其能够在核酸提取步骤中被感测)来保护其中的或与之关联的核酸序列。在一些方面中，所述核酸序列的保护可通过这些核酸序列在保护载体内的包藏或与保护载体的结合来调节。

在一些方面中，所述保护载体(例如第一保护载体中的一种或多种和第二保护载体中的一种或多种)均可独立地选自由以下物质组成的组，或者在一些其他实施例中由以下物质组成：病毒、病毒样粒子、细菌、真核细胞、无核细胞、脂质体、囊泡、蛋白质衣壳或壳体、微室、纳米囊泡、外体、胶束、固体脂质纳米颗粒、脂质包覆颗粒、纳米管、纳米晶体、聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒、电解质间复合物(多聚体)或树枝状聚合物。

在NAT的核酸提取步骤中基本上回收

在NAT的核酸提取步骤中基本上回收指在NAT的核酸提取步骤中回收的核酸足以使得该核酸在NAT的核酸感测步骤中能够被感测，在本发明的一个优选方面中，回收量是存在于原样品或检测物品(视情况而定)中的核酸的100％、90％以上、80％以上、70％以上、60％以上、50％以上、40％以上、30％以上、或20％以上，或者在更高确定性的水平上指在核酸提取步骤中回收的足以使NAT按照NAT的设计意图和/或NAT用户的要求正常进行的任何量。

完好

在本文中所用的术语“完好”指细胞或病毒的总体结构至少保留着其主要组成部分之间的一些关系，但不一定保留着全部关系。例如，完好的总体结构包括其天然组成部分之间的空间关系，包括在细胞或病毒结构的一些完整或部分残基或剩余部分中存在核酸，这些核酸的存在状态与其生存或存活状态一样，即使它们是不完整的。

灭活

在本文中所用的术语“生物体的灭活”指对生物体进行的导致其出现显著的缺陷或缺乏生殖或感染能力的处理。灭活方法包括但不限于电磁辐射、红外辐射、可见光辐射、激光辐射、由灯、灯泡、灯管、灯丝、天线、发光二极管、粒子加速器或其他装置发出的辐射、由放射性同位素产生的辐射、来自电气或电子装置的辐射、自然辐射、人工辐射、紫外线辐射、α辐射、β辐射、γ辐射或X射线辐射、溶剂处理、去污剂处理、巴氏杀菌、酸性pH灭活、碱性pH灭活、核酸的共价化学修饰、蛋白质的共价化学修饰、核酸的非共价化学修饰、蛋白质的非共价化学修饰、离液性破坏、用福尔马林、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、邻苯二甲醛、其他醛、β-丙内酯、过氧化氢、其他过氧化物、氯和氯化合物、氨和铵化合物、胺、胺反应性化合物、羧酸化合物和羧基反应性化合物、过乙酸、酚类化合物和其他化学或物理反应性或破坏性化合物处理、物理破坏、冻融破坏、热量灭活、巴氏杀菌、其他基于温度和/或基于时间的灭活、以及其他手段。在一些方面中，可采用利用电磁辐射(包括伽马辐射)灭活用作分子对照物的病原体的方法，所述电磁辐射的水平能够灭活对照物的生物活性，同时保持样品DNA足够完好以供处理和分析。

对照样品

在本文中所用的术语“对照物”可指一种或多种已知其中存在或不存在被分析物的样品，该样品可用于导致某些性质的定性或定量测量或确定的测定、检测过程或检测程序(“检测”)。对照物可用于设计或开发检测，确立适当的检测功能，质疑或确认或检测与检测相关的操作、性能、设备、系统或程序，提供正确工作和/或检测结果的有效性的证据。在某些情况下(但不是所有情况)，法规、法律或最佳实践原则可能要求使用对照物。对照物相对于感兴趣的检测物品可以是外在的，或者可以独立于感兴趣的检测物品对其进行检测，并且在本文中被称为“外部对照物”或“外在对照物”。或者，对照物可以是与感兴趣的检测物品整合或混合的，在这种情况下，它们在此被称为“内部对照物”。

全生物体对照物

在本文中所用的术语“全生物体对照物”指包含一种或多种如本文所述的全生物体的对照物。“全生物体对照物”也可与“全生物体对照材料”互换使用。

多生物体对照物

在本文中所用的术语“多种生物体对照物”指一种用于NAT的质量对照组合物，例如包含两种或多种存活、非存活或灭活的全生物体的全生物体对照物，包括全生物体的片段或部分(无论是否纯化)，或来自合成材料或生物合成材料。

分子对照物

在本文中所用的术语“分子对照物”指用于在本文中所述的NAT或其他测定或对于该NAT或其他测定有用的对照物。分子对照物可包括但不限于在测定中使用的核酸、水、溶剂或缓冲液。

全生物体分子对照物

在本文中所用的术语“全生物体分子对照物”指包含一种或多种全生物体的分子对照物。

扩增全生物体分子对照物

在本文中所用的术语“扩增全生物体分子对照物”是一种用于评价NAT的功能的质量对照组合物。“扩增全生物体分子对照物”、“扩增全生物体对照物”和“扩增分子对照物”指包括至少一个全生物体和一个或多个非天然存在的核酸序列(可从天然存在的序列构建)的全生物体分子对照物，并且表示单数或复数，按与上下文相符的最包容的方式解释。在某些实施例中，扩增全生物体对照物可在生物体基因组中包含外源核酸。在其他实施例中，扩增对照物可包含载体中的核酸，例如用于承载细胞内的核酸的质粒、微球、脂质体或游离体、或独立生物体。在其他实施例中，核酸可在全生物体的外部。

经过基因修饰的生物体(GMO)

在本文中所用的术语“经过基因修饰的生物体”指通过基因修饰方法进行修饰的生物体。由于GMO是通过基因修饰方法进行修饰的，因此它们不是天然存在的生物体，它们包含并非天然存在于作为其来源的生物体内的核酸序列。

基因修饰方法

在本文中所用的术语“基因修饰方法”指对生物体进行修饰以引入一种或多种核酸或在生物体中非天然存在的核酸序列(即，在应用基因修饰方法之前引入非生物体内源的外源核酸)。为了清楚起见，基因修饰方法包括以下方法：其中第一种生物体或第一类型的生物体被修饰，从而产生第二生物体，其中第二生物体的核酸含量不同于第一生物体的核酸含量。在本文中所用的短语“非天然存在的”或“非天然的”及其变化形式指在第一生物体中不存在的核酸或核酸序列，该核酸或核酸序列可通过基因修饰方法引入以产生第二生物体。引入的核酸可选地可对待测基因或其产物的全部或一部分进行编码。基因修饰方法(即，生物体的修饰)引入在生物体中非天然存在的一种或多种核酸。可使用本领域技术人员已知的许多方法之中的一种或多种向生物体引入核酸，包括但不限于瞬时转染(例如脂质或脂质纳米粒转染)、病毒转导(例如使用逆转录病毒、腺病毒/腺相关病毒媒介[AAV]、单纯疱疹病毒或慢病毒媒介系统)、生物体的突变和选择、定向进化、选择和繁殖、和/或导致向生物体基因组中整合的任何方法。导致向生物体基因组中整合的方法可以是有目标的(即，指向宿主基因组中的选定区域或位置)或无目标的(即，在未经专门选择或控制的区域内，例如在“随机整合”的情况下)。在一些相关方面中，也可向全生物体内引入核酸序列但不整合到生物体的基因组中。容易理解，遗传修饰方法有多种形式，并且还可继续开发和/或改进这些方法，所有这些方法的共同目标是实现生物体核酸含量的产生或改变，或者通过生物体核酸含量的改变产生源自第一生物体的第二生物体。本发明适用于通过目前已知的任何基因修饰方法获得的生物体，以及将被开发以实现类似结果的方法。

通过病毒转导或瞬时或非瞬时转染引入核酸的方法在分子生物学领域是众所周知的。

在多个实施例中，可使用整合媒介或通过一种或多种基因编辑技术将一种或多种非天然或外源核酸整合到生物体的基因组中，包括但不限于以下技术：成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关(CRISPR/CAS)系统(例如CRISPR/CAS9)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)技术。

锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)

锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)是可定制的包含DNA修饰酶的DNA结合蛋白。这两种酶都可设计并针对多种生物体中的特定序列(Esvelt and Wang,Mol Syst Biol.(2013)9:641，该文献通过整体引用结合在此)。ZFN和TALEN可用于通过诱导DNA双链断裂来引入广泛的基因修饰，该断裂刺激易出错的非同源末端结合或特定基因组位置的同源导向修复。ZFN和TALEN的多功能性源于定制DNA结合结构域以识别几乎任何序列的能力。这些DNA结合模块可与许多效应结构域结合，以影响基因组的结构和功能，包括核酸酶、转录激活剂和阻遏剂、重组酶、转座酶、DNA和组蛋白甲基转移酶以及组蛋白乙酰转移酶。因此，进行基因改变的能力很大程度上取决于设计的锌指和TALEN蛋白的DNA结合特异性和亲和性(Gaj et al.,Trends in Biotechnology,(2013)31(7):397-405)。美国授权专利US 8,685,737和US 8,697,853说明了ZFN和TALEN在哺乳动物细胞中的应用，这些文献通过引用结合在此。

在一个方面中，本发明使用ZFN或TALEN将核苷酸碱基插入到全生物体对照物的基因组中。

CRISPR

CRISPR-Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列-CRISPR相关)是一种在细菌和古细菌中发现的RNA介导的适应性免疫系统，它实现了针对外源核酸的适应性免疫(Wiedenheft et al.,Nature(2012)482:331-8；Jinek et al.,Science(2012)337:816-21)。但是，多个研究机构已经展示了如何利用该系统的生物体成分对哺乳动物细胞的基因组进行定向修饰。CRISPR-Cas系统通常由称为CRISPR阵列的基因位点定义，该CRISPR阵列是由相似长度的独特“间隔符”分隔的20-50个碱基对(bp)的直接重复序列，其前面是富含AT的“前导”序列(Wright et al.,Cell(2016)164:29-44)。

存在三种类型的CRISPR/Cas系统：I型、II型和III型。II型CRISPR-Cas系统需要单种蛋白质Cas9来催化DNA切割(Sapranauskas et al.,Nucleic Acids Res.(2011)39(21):9275-9282)。Cas9作为RNA引导的DNA内切酶。Cas9在由相关CRISPR RNA(crRNA)转录子内包含的20核苷酸引导序列限定的位点产生钝双链断裂(DSB)。Cas9既需要导引crRNA，也需要反式激活crRNA(tracrRNA)，该反式激活crRNA与crRNA部分地互补，用于位点特异性DNA识别和切割(Deltcheva et al.,Nature(2011)471(7340):602-7；Jinek et al.,Science(2012)337:816-21)。

最近的实验表明，crRNA:tracrRNA复合物可合成为包括Cas9结合和DNA目标位点识别所需的特征的单转录子(单引导RNA或sgRNA)。利用sgRNA，可将来自化脓性链球菌的Cas9编程为在由导引RNA序列限定的任何位点切割双链DNA，并且包括GG前间区序列邻近基序(PAM)(Sapranauskas et al.,Nucleic Acids Res.(2011)39(21):9275-9282；Jinek etal.,Science(2012)337:816-21)。来自其他细菌物种的Cas9利用替代的PAM序列，从而增加了CRISPR靶向位点。DSB引发非同源性末端连接(NHEJ)，这容易出错，并有利于敲除等位基因的移码突变；或者引发同源定向修复(HDR)，这可利用外源引入的双链或单链DNA修复模板敲入或纠正基因组中的突变。因此，在同源修复供体存在的情况下，CRISPR/Cas9系统可用于通过HDR过程在目标位点产生精确且既定的修饰和插入。在没有同源修复供体的情况下，由CRISPR/Cas9产生的单DSB是通过易出错的NHEJ修复的，这导致插入或删除(indel)突变。

说明CRISPR系统和Cas9的其他文献包括以下文献：Cong et al.,Science(2013)339:819-23；Jinek et al.,eLife 2013；2:e00471.(2013)2:e00471；Lei et al.,Cell(2013)152:1173-1183；Gilbert et al.,Cell(2013)154:442-51；Lei et al.,eLife(2014)3:e04766；Perez-Pinela et al.,Nat Methods(2013)10:973-976；Maider et al.,Nature Methods(2013)10,977-979，这些文献通过引用结合在此。下列美国和国际专利以及专利申请说明了CRISPR的使用方法：8,697,359；8,771,945；8,795,965；8,865,406；8,871,445；8,889,356；8,895,308；8,906,616；8,932,814；8,945,839；8,993,233；8,999,641；2014/0068797和WO 2014/197568，这些文献通过整体引用结合在此。

CRISPR相关蛋白Cas9可来自任何数量的物种，包括但不限于化脓性链球菌、无害利斯特菌和嗜热链球菌。

在一个方面中，本发明使用CRISPR-Cas系统和一个或多个导引RNA、修复模板和HDR来将核苷酸碱基插入到全生物体对照物的基因组中。

在多个实施例中，基因修饰在可引入到生物体中的第二种核酸上进行，并且对选自由抗生素抗性基因、药物抗性基因、致病性决定基因、属或种或分支或亚型决定基因、环境反应决定基因、病原体抗性决定基因、生长决定基因、免疫抗性或免疫逃逸决定基因、调节基因、决定遗传或表达对照物的基因、编码干扰RNA(IRNA)的遗传元件、非编码遗传片段或未知功能的片段、生物标记、病毒基因、癌基因或肿瘤抑制基因进行编码。

抗生素抗性

在一些实施例中，本发明的质量对照组合物是为了评价用于感测为细菌生物体赋予抗生素抗性的目标核酸序列的NAT的功能而设计的。在这种情况下，本发明的质量对照组合物包括受保护的核酸序列(在本文中称为“第二受保护的核酸序列”)，该受保护的核酸序列被基因修饰为包括基因，或更优选包括灭活的基因，或者包括已知或可疑的基因的特征部分，该基因单独或与其他基因或肽一起(例如酶或者活化或表达因子)为受保护的载体赋予抗生素抗性，所述基因能够通过NAT感测到。在一些方面中，本发明的质量对照组合物可包括多于一种类型的第二核酸序列，所述第二核酸序列具有相同或不同的抗生素抗性相关基因的特征。

在多个实施例中，本发明的质量对照组合物中的保护载体(例如生物体)被基因修饰为包括一个或多个抗生素抗性基因，在一个实施例中，所述基因优选是灭活基因或表征该基因的核酸序列，包括但不限于AAC2IA、AAC2IB、AAC2IC、AAC2ID、AAC2I、AAC3IA、AAC3IIA、AAC3IIB、AAC3III、AAC3IV、AAC3IX、AAC3VI、AAC3VIII、AAC3VII、AAC3X、AAC6I、AAC6IA、AAC6IB、AAC6IC、AAC6IE、AAC6IF、AAC6IG、AAC6IIA、AAC6IIB、AAD9、AAD9IB、AADD、ACRA、ACRB、ADEA、ADEB、ADEC、AMRA、AMRB、ANT2IA、ANT2IB、ANT3IA、ANT4IIA、ANT6IA、APH33IA、APH33IB、APH3IA、APH3IB、APH3IC、APH3IIIA、APH3IVA、APH3VA、APH3VB、APH3VIA、APH3VIIA、APH4IB、APH6IA、APH6IB、APH6IC、APH6ID、ARNA、BACA、BCRA、BCRC、BL1_ACC、BL1_AMPC、BL1_ASBA、BL1_CEPS、BL1_CMY2、BL1_EC、BL1_FOX、BL1_MOX、BL1_OCH、BL1_PAO、BL1_PSE、BL1_SM、BL2A_1、BL2A_EXO、BL2A_III2、BL2A_III、BL2A_KCC、BL2A_NPS、BL2A_OKP、BL2A_PC、BL2BE_CTXM、BL2BE_OXY1、BL2BE_PER、BL2BE_SHV2、BL2B_ROB、BL2B_TEM1、BL2B_TEM2、BL2B_TEM、BL2B_TLE、BL2B_ULA、BL2C_BRO、BL2C_PSE1、BL2C_PSE3、BL2D_LCR1、BL2D_MOXA、BL2D_OXA10、BL2D_OXA1、BL2D_OXA2、BL2D_OXA5、BL2D_OXA9、BL2D_R39、BL2E_CBLA、BL2E_CEPA、BL2E_CFXA、BL2E_FPM、BL2E_Y56、BL2F_NMCA、BL2F_SME1、BL2_GES、BL2_KPC、BL2_LEN、BL2_VEB、BL3_CCRA、BL3_CIT、BL3_CPHA、BL3_GIM、BL3_IMP、BL3_L、BL3_SHW、BL3_SIM、BL3_VIM、BLE、BLT、BMR、CARA、CATA10、CATA11、CATA12、CATA13、CATA14、CATA15、CATA16、CATA1、CATA2、CATA3、CATA4、CATA5、CATA6、CATA7、CATA8、CATA9、CATB1、CATB2、CATB3、CATB4、CATB5、CEOA、CEOB、CML_E1、CML_E2、CML_E3、CML_E4、CML_E5、CML_E6、CML_E7、CML_E8、DFRA10、DFRA12、DFRA13、DFRA14、DFRA15、DFRA16、DFRA17、DFRA19、DFRA1、DFRA20、DFRA21、DFRA22、DFRA23、DFRA24、DFRA25、DFRA25、DFRA25、DFRA26、DFRA5、DFRA7、DFRB1、DFRB2、DFRB3、DFRB6、EMEA、EMRD、EMRE、EREA、EREB、ERMA、ERMB、ERMC、ERMD、ERME、ERMF、ERMG、ERMH、ERMN、ERMO、ERMQ、ERMR、ERMS、ERMT、ERMU、ERMV、ERMW、ERMX、ERMY、FOSA、FOSB、FOSC、FOSX、FUSB、FUSH、KSGA、LMRA、LMRB、LNUA、LNUB、LSA、MACA、MACB、MDTE、MDTF、MDTG、MDTH、MDTK、MDTL、MDTM、MDTN、MDTO、MDTP、MECA、MECR1、MEFA、MEPA、MEXA、MEXB、MEXC、MEXD、MEXE、MEXF、MEXH、MEXI、MEXW、MEXX、MEXY、MFPA、MPHA、MPHB、MPHC、MSRA、NORM、OLEB、OPCM、OPRA、OPRD、OPRJ、OPRM、OPRN、OTRA、OTRB、PBP1A、PBP1B、PBP2B、PBP2、PBP2X、PMRA、QAC、QACA、QACB、QNRA、QNRB、QNRS、ROSA、ROSB、SMEA、SMEB、SMEC、SMED、SMEE、SMEF、SRMB、STA、STR、SUL1、SUL2、SUL3、TCMA、TCR3、TET30、TET31、TET32、TET33、TET34、TET36、TET37、TET38、TET39、TET40、TETA、TETB、TETC、TETD、TETE、TETG、TETH、TETJ、TETK、TETL、TETM、TETO、TETPA、TETPB、TET、TETQ、TETS、TETT、TETU、TETV、TETW、TETX、TETY、TETZ、TLRC、TMRB、TOLC、TSNR、VANA、VANB、VANC、VAND、VANE、VANG、VANHA、VANHB、VANHD、VANRA、VANRB、VANRC、VANRD、VANRE、VANRG、VANSA、VANSB、VANSC、VANSD、VANSE、VANSG、VANT、VANTE、VANTG、VANUG、VANWB、VANWG、VANXA、VANXB、VANXD、VANXYC、VANXYE、VANXYG、VANYA、VANYB、VANYD、VANYG、VANZ、VATA、VATB、VATC、VATD、VATE、VGAA、VGAB、VGBA、VGBB、VPH、YKKC和YKKD。

灭活方法

可对在本文中使用的生物体进行灭活。灭活方法包括但不限于电磁辐射、红外辐射、可见光辐射、激光辐射、由灯、灯泡、灯管、灯丝、天线、发光二极管、粒子加速器或其他装置发出的辐射、由放射性同位素产生的辐射、由电气或电子装置产生的辐射、自然辐射、人工辐射、紫外线辐射、α辐射、β辐射、γ辐射或X射线辐射、溶剂处理、去污剂处理、巴氏杀菌、酸性pH灭活、碱性pH灭活、核酸的共价化学修饰、蛋白质的共价化学修饰、核酸的非共价化学修饰、蛋白质的非共价化学修饰、离液性破坏、用福尔马林、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、邻苯二甲醛、其他醛、β-丙内酯、过氧化氢、其他过氧化物、氯和氯化合物、氨和铵化合物、胺、胺反应性化合物、羧酸化合物和羧基反应性化合物、过乙酸、酚类化合物和其他化学或物理反应性或破坏性化合物处理、物理破坏、冻融破坏、热量灭活、巴氏杀菌、其他基于温度和/或基于时间的灭活、以及其他手段。

先前的文献说明了用于分子测定的对病毒进行灭活的方法，该病毒可能是致病性的，其中通过蛋白质的不可逆共价修饰或通过酶介导的蛋白质修饰来灭活病毒，这两种方式中的任何一种都可能导致使这种病毒变为非致病性的变化(例如参见CA 2,426,172)。CA2,426,172的方法涉及通过这种手段处理病毒，同时使它们“基本上完好”，以最大限度地减少微生物体的细胞内成分与修饰剂的接触，以充分保护核内容物(尤其是核酸内容物)免受修饰剂的劣化作用，使得核酸适合于核酸扩增技术；CA 2,426,172通过完整引入结合在此。在一些实施例中，所述方法需要使用在一定水平下可能对人类有毒和/或致癌的化学品(例如福尔马林)。在一些方面中，本发明的方法利用一种导致“基本上完好”的形式的病毒灭活程序；可选地，本领域技术人员已知的许多方法之一(如在本文的其他位置所述)是CA2,426,172的方法。

各种研究说明了如何使用辐射来灭活病原体。例如，Elliott et al.,J.Clin.Microbiol.1982,vol.16no.,4,704-708说明了使用紫外线或γ射线来灭活病毒。但是，通常认为这种辐射处理是通过损害核酸来导致灭活的。例如，Simonet et al.,Appl.Environ.Microbiol.2006,vol.72no.,127671-7677表明紫外线引起脊髓灰质炎病毒和RNA噬菌体基因组的断裂是灭活诱导的一个主要机制。类似地，G.P.Van Der Schans&J.F.Bleichrodt(1974)Int.J.Rad.Biol Relat.Stud.Phys.Chem.Med.,26:2,121-126已经表明，噬菌体PM2 DNA的γ辐射灭活中的大部分损害源自对核酸的损害。

所述辐射方法可选自下列方法中的一种或多种：电磁辐射、红外辐射、可见光辐射、激光辐射、由灯、灯泡、管、灯丝、天线、发光二极管、粒子加速器或其他装置发出的辐射、由放射性同位素产生的辐射、来自电气或电子装置的辐射、自然辐射、人工辐射、紫外线辐射、Α辐射、Β辐射、Γ辐射或X射线辐射。在一些方面中，可采用利用电磁辐射(包括伽马辐射)灭活用作分子对照物的病原体的方法，所述电磁辐射的水平能够灭活对照物的生物活性，同时保持样品DNA足够完整以供处理和分析。

全生物体对照物

在本发明的多个实施例中，所述方法可使用多种生物体，包括真核细胞、细菌、病毒、真菌、古细菌、原生生物或寄生虫，无论这些生物体是否致病，无论是天然存在的还是合成的(例如重组的)。在某些情况下，用作对照材料的生物体是致病生物体。在某些情况下，用作对照材料的生物体是非致病性的。在某些情况下，用作对照物的生物体含有对于该生物体是天然的或非天然的核酸，这些核酸将它们与同一大类或物种的其他生物体区分开来(例如与天然地或通过基因修饰而包含表征mecA基因的基因序列的大肠杆菌混合的金黄色葡萄球菌生物体、或者通过基因修饰而包含mecA基因的一部分的金黄色葡萄球菌生物体)。

在某些情况下，用作对照物的生物体包含使其区别于同一大类或物种的其他生物体的基因目标(例如带有癌症相关基因序列的人类细胞)。可按照本发明的方法处理的生物体的部分列表包括但不限于：鲍曼不动杆菌、腺病毒F40/41、星状病毒、炭疽杆菌、巴贝西虫(纳脱原虫)、百日咳博德特氏菌、包柔氏螺旋体、热带假丝酵母、白色念珠菌、近平滑假丝酵母、光滑念珠菌、基孔肯雅、克柔念珠菌、艰难梭菌、弯曲杆菌(空肠弯曲菌、大肠杆菌和普氏弯曲菌)、白色念珠菌、艰难梭菌(毒素A/B)、HKU1冠状病毒、NL63冠状病毒、229E冠状病毒、OC43冠状病毒、贝氏柯克斯体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、白色隐球菌、隐孢子虫、环孢卡耶塔尼亚、巨细胞病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、风疹病毒、肠球菌、溶组织内阿米巴、肠道病毒、大肠杆菌、大肠杆菌/、大肠杆菌K1、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠道致病大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)lt/st、志贺样产毒素大肠杆菌(STEC)stx1/stx2、大肠杆菌O157、志贺氏菌/肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、万古霉素抗性大肠杆菌(VREC)、肠杆菌、阴沟肠杆菌复合体、爱泼斯坦巴尔病毒、蓝氏贾第虫、幽门螺杆菌、单核细胞增生李斯特菌、肺炎克雷伯菌/、疟原虫(疟疾)、气生假单胞菌、土拉弗朗西斯菌、革兰氏阳性菌/、革兰氏阴性菌、流感嗜血杆菌、单纯疱疹病毒、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、人类偏肺病毒、人类鼻病毒/肠道病毒、6型人类疱疹病毒(HHV-6)、人类副肠孤病毒、人类偏肺病毒、人类乳头瘤病毒、流感嗜血杆菌、流感和呼吸道病毒、甲型流感、甲型流感/H1、甲型流感/H3、甲型流感/H1-2009、乙型流感、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、呼吸道合胞病毒、日本脑炎病毒、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯菌、利什曼原虫属、麻疹、腮腺炎、结核分枝杆菌、分枝杆菌属、生殖支原体、肺炎支原体、多重面板、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、诺如病毒GI/GII、毕赤酵母、类志贺邻单胞菌、铜绿假单胞菌、普罗透斯、轮状病毒A、酿酒酵母、萨波病毒(I、II、IV和V)、沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、葡萄球菌、链球菌、阴道毛滴虫、水痘带状疱疹病毒(VZV)、弧菌(副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌)、霍乱弧菌、寨卡病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森氏菌；人类细胞、具有感兴趣的遗传特征的人类细胞、感染致病或非致病生物的人类细胞；植物、动物、真菌、或无核原虫类细胞；植物、动物、真菌、或者被致病或非致病生物感染的无核原虫类细胞；植物、动物、真菌、或者具有感兴趣的遗传特征的无核原虫类细胞；植物、动物、真菌、或者被致病或非致病生物感染的无核原虫类细胞；包含癌基因的生物体；包含可遗传的遗传特征(包括指示疾病的特征)的生物、包含外体核酸的生物体。

可使用本发明的方法识别或可用作全生物体对照物的示例性细菌包括但不限于：枳醋杆菌、不动杆菌属：鲍曼不动杆菌、醋酸钙不动杆菌、约翰逊不动杆菌、杜松不动杆菌、卢菲不动杆菌、放射不动杆菌、败血不动杆菌、辛德勒不动杆菌、熊氏不动杆菌；放线菌属：牛放线菌、鲍氏放线菌、犬放线菌、卡迪夫放线菌、凯图利放线菌、鞘放线菌、齿状放线菌、齿放线菌、欧洲放线菌、放克氏放线菌、乔治放线菌、灰色放线菌、格雷费尼茨放线菌、香港放线菌、大麦胚珠放线菌、豪氏放线菌、腐质放线菌、猪阴道放线菌、以色列放线菌、海洋放线菌、迈耶放线菌、奈氏放线菌、鼻放线菌、新放线菌、溶齿放线菌、奥里亚放线菌、根状放线菌、辐射放线菌、松弛放线菌、链霉菌放线菌、猪乳房炎放线菌、猪放线菌、图列茨亚放线菌、泌尿生殖放线菌、真空放线菌、粘性放线菌；放线杆菌属：伴放线放线杆菌、关节炎放线杆菌、荚膜放线杆菌、德尔菲尼科拉放线杆菌、马放线杆菌、人放线杆菌、吲哚放线杆菌、木质放线杆菌、小放线杆菌、鼠放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌、罗氏放线菌、暗放线杆菌、精放线杆菌、琥珀放线杆菌、猪放线杆菌、解脲放线杆菌；气单胞菌属：嗜糖气单胞菌、动物气单胞菌、双壳气单胞菌、墨西哥气单胞菌、肠产气单胞菌、真核气单胞菌、嗜水气单胞菌、嗜水气单胞菌、日本气单胞菌、气单胞菌培养基、软体动物气单胞菌、波波夫气单胞菌、点状气单胞菌、沙门氏菌气单胞菌、舒伯特气单胞菌、沙曼纳气单胞菌、猴气单胞菌、温和气单胞菌、维罗纳气单胞菌；猫阿菲波菌、土壤杆菌属：放射土壤杆菌、发根农杆菌、土壤杆菌、根癌土壤杆菌；农杆菌属种、产碱杆菌属：水生产碱杆菌、真养产碱杆菌、粪产碱杆菌、协腹产碱杆菌、木糖氧化产碱杆菌；阿利舍瓦内拉属、交替球菌属、无形体嗜吞噬细胞、边缘无形体、水生单胞菌属、溶血奥杆菌、蜘蛛属、砷恐惧症属、亚速尔加属、棕色固氮菌、棕色固氮菌、细菌性痢疾(志贺氏菌病)、芽孢杆菌属：流产杆菌(羊种布鲁氏菌)、炭疽杆菌(炭疽)、短芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、分枝杆菌、纳豆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、苏云金杆菌；拟杆菌属：福赛斯拟杆菌(福赛斯坦纳菌)、嗜酸拟杆菌、狄氏拟杆菌(重新分类为双歧杆菌)、牙龈类杆菌、纤细拟杆菌、脆弱拟杆菌、口拟杆菌、卵形拟杆菌、腐败拟杆菌、化脓性拟杆菌、粪类杆菌、猪拟杆菌、拟杆菌属、多形拟杆菌、外阴拟杆菌、巴尔通体菌属：阿尔萨斯巴尔通体、杆状巴尔通体、B.birtlesii、牛巴尔通体、B.capreoli、克氏巴尔通体、多希埃巴尔通体、伊丽莎白巴尔通体、格雷汉巴尔通体、汉赛巴尔通体(猫抓痒热)、克勒雷巴尔通体、穆里斯巴尔通体、B.peromysci、金塔纳巴尔通体、B.rochalimae、B.schoenbuchii、B.talpae、泰勒巴尔通体、B.tribocorum、文森巴尔通体阿鲁潘亚种、文森巴尔通体伯格霍夫亚种、文森巴尔通体文森亚种、瓦氏巴尔通体；卡介苗(BCG)、动物溃疡伯格菌(动物溃疡威克斯菌)、双歧杆菌、芽生菌属、内共生菌属、博德特氏菌属：博德特氏菌、禽波氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、欣齐博德特氏菌、霍尔梅西博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、百日咳杆菌(百日咳)、博德特氏菌、吸虫波氏杆菌；疏螺旋体属：伯氏疏螺旋体、埃氏疏螺旋体、鹅包柔氏螺旋体、伽氏疏螺旋体、瓦氏疏螺旋体、赫氏疏螺旋体、伯氏疏螺旋体、回归热疏螺旋体；包西氏菌属、慢生根瘤菌属、布伦纳里亚属、布鲁氏菌属：流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、平口布鲁氏菌；布赫纳氏菌属、布戴维约菌属、伯克霍尔德氏菌属：洋葱伯克霍尔德氏菌(洋葱假单胞菌)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽假单胞菌/鼻疽放线菌)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(假鼻疽假单胞菌)；布丘氏菌属、肉芽肿荚膜杆菌、弯曲杆菌属：大肠弯曲杆菌、简洁弯曲杆菌、屈曲弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、纤细弯曲杆菌、瑞士弯曲杆菌、人弯曲杆菌、猪肠弯曲杆菌、岛状弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、拉尼埃弯曲杆菌、拉里弯曲杆菌、粘液唾液弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、痰液弯曲杆菌、向上弯曲杆菌；犬咬嗜二氧化碳菌(2型发酵异常菌)、棒状杆菌属、人类心杆菌、西地西菌属、衣原体菌属：沙眼衣原体(性病淋巴肉芽肿)、鼠衣原体、猪衣原体；嗜衣原体属：肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体(鹦鹉热)、兽类嗜衣原体、流产衣原体、猫科衣原体、豚鼠衣原体；柠檬酸杆菌属：无芒柠檬酸杆菌、布拉基柠檬酸杆菌、法默里柠檬酸杆菌、弗劳迪柠檬酸杆菌、柠檬酸杆菌、中间柠檬酸杆菌、克氏柠檬酸杆菌(又名潜水柠檬酸杆菌)、莫林柠檬酸杆菌、竞技柠檬酸杆菌、塞氏柠檬酸杆菌、乌克曼柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌；梭菌属；肉毒梭菌、艰难梭菌、诺维梭菌、败血梭菌、破伤风梭菌(破伤风)、魏氏梭菌(产气荚膜梭菌)；棒状杆菌属；白喉棒状杆菌(白喉)、无枝棒状杆菌、水棒状杆菌、牛棒状杆菌、马棒状杆菌、苦参棒状杆菌、谷氨酸棒杆菌、溶血棒状杆菌、C.jeikeiun(JK群棒状杆菌)、微小棒状杆菌(红癣)、短小棒状杆菌(又称为痤疮丙酸杆菌)、假白喉棒状杆菌(又称为霍夫曼棒状杆菌)、假结核棒状杆菌(又称为绵羊棒状杆菌)、化脓性棒状杆菌、解脲棒状杆菌(D2群棒状杆菌)、复性棒状杆菌、纹状体棒状杆菌、细棒杆菌(棕榈毛霉病、腋毛滴虫病)、溃疡棒状杆菌、干燥棒状杆菌病；贝氏柯克斯体(Q热)、克罗诺杆菌属：阪崎克罗诺杆菌、丙二酸克罗诺杆菌、克罗诺杆菌属、莫金斯克洛诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌；酸腐霉(食酸丛毛单胞菌)、迪基亚属、爱德华氏菌属、艾肯内拉腐蚀、肠杆菌属：产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、阪崎肠杆菌；肠球菌属：鸟肠球菌、杜兰肠球菌、粪肠球菌(粪链球菌/D群链球菌)、屎肠球菌、孤独肠球菌、胆石肠球菌、褐肠球菌；查菲埃立克体、丹毒丝菌、欧文氏属、埃希氏杆菌属：非脱羧埃希菌、艾伯特埃希菌、蟑螂埃希菌、大肠埃希菌、费格森埃希菌、赫氏埃希菌、伤口埃希菌；尤因盖拉属、黄杆菌属：水生黄杆菌、鳃裂黄杆菌、柱状黄杆菌、内海黄杆菌、冈瓦纳黄杆菌、水生黄杆菌、约翰逊黄杆菌、果胶酶黄杆菌、嗜冷黄杆菌、嗜糖黄杆菌、需盐黄杆菌、比目鱼黄杆菌、琥珀黄杆菌；土拉弗朗西斯菌(土拉菌)、新凶手弗朗西丝菌、蜃楼弗朗西丝氏菌、梭杆菌属：坏死梭杆菌(勒米尔综合征/坏死球杆菌)、具核梭杆菌、多形梭杆菌、新梭杆菌、被孢霉梭杆菌、静脉梭杆菌；阴道加德纳氏菌、溶血双子星、麻疹双球菌(麻疹链球菌)、格里蒙特利亚属、嗜血杆菌属：埃及嗜血杆菌(科-维杆菌)、无营养嗜血杆菌、禽嗜血杆菌、杜克雷嗜血杆菌(软下疳)、猫科嗜血杆菌、溶血性嗜血杆菌、流感嗜血杆菌(普费弗芽孢杆菌)、副单螺旋嗜血杆菌、副溶血性嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌(无流感聚集杆菌)、百日咳嗜血杆菌、匹兹堡嗜血杆菌、宋氏嗜血杆菌、阴道嗜血杆菌；哈弗尼亚属、蜂房哈夫尼菌、螺杆菌属：幽门螺杆菌、鹅螺杆菌、H.aurati、H.bilis、毕氏螺杆菌、H.brantae、加拿大螺杆菌、犬螺杆菌、胆囊螺杆菌、同性恋螺杆菌、胃幽门螺杆菌、猫螺杆菌、粉内螺杆菌、H.ganmani、人胃螺杆菌(人胃螺旋菌)、肝螺杆菌、H.mesocricetorum、旱獭螺杆菌、H.muridarum、雪貂螺杆菌、帕梅特螺杆菌、鸡白痢杆菌、幽门螺杆菌(胃溃疡)、螺杆菌、啮齿类螺杆菌、莎乐美螺杆菌、H.trogontum、伤寒螺杆菌、翼状螺杆菌；人粒细胞埃立克体病(嗜吞噬细胞无形体/嗜吞噬细胞埃立克体)、人单核细胞趋化性埃立克体病(单核细胞埃立克体病/查菲埃立克体病)、克雷伯氏菌属：克雷伯氏肉芽肿炎(钙细菌肉芽肿炎)、运动克雷伯氏菌、鸟氨酸克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、植物克雷伯氏菌、肺炎克雷伯菌、鼻硬结克雷伯氏菌、新加坡克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌、变栖克雷伯氏菌；金格杆菌、克鲁维属、乳酸菌属：耐酸乳杆菌、酸面乳杆菌、酸鱼乳杆菌、嗜酸乳杆菌(德得来因杆菌)、敏捷乳杆菌、低温乳杆菌、消化乳杆菌、解淀粉乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、淀粉乳杆菌、淀粉乳杆菌、动物乳杆菌、安特利乳杆菌、脱乳杆菌、鸟乳杆菌、双发酵乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、山茶乳杆菌、干酪乳杆菌、链状乳杆菌、L.ceti、结肠乳杆菌、丘状乳杆菌、堆肥乳杆菌、L.concavus、棒状乳杆菌、脆裂乳杆菌、结皮乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌拉克西斯亚种、双歧乳杆菌、马乳杆菌、平等乳杆菌、法拉吉乳杆菌、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、L.formicalis、果糖乳杆菌、谷物乳杆菌、品红乳杆菌、鸡乳杆菌、加氏乳杆菌、胃乳酸杆菌、甘氏乳杆菌、小麦乳杆菌、汉密西乳杆菌、仓鼠乳杆菌、哈尔滨乳杆菌、哈氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、希氏乳杆菌、高硫乳杆菌、iners乳杆菌、英格鲁威乳杆菌、肠乳杆菌、詹氏乳杆菌、约翰逊乳杆菌、卡利克斯镇乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、克菲里乳杆菌、金氏乳杆菌、北里乳杆菌、库奇乳杆菌、莱氏乳杆菌、林氏乳杆菌、马来发酵乳杆菌、马里乳杆菌、木薯乳杆菌、明氏乳杆菌、粘膜乳杆菌、鼠乳杆菌、纳格里乳杆菌、纳穆尔乳杆菌、南特乳酸杆菌、少发酵乳杆菌、口乳杆菌、干酪乳杆菌、泛乳杆菌、副干酪乳杆菌、类布氏乳杆菌、类丘状乳杆菌、L.parafarraginis、类高加索酸奶粒乳杆菌、巴博乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、恶味乳杆菌、植物乳杆菌、庞氏乳杆菌、鹦鹉热乳杆菌、凝乳酶乳杆菌、罗伊乳酸杆菌、鼠李糖乳杆菌、龈沟乳杆菌、罗果糖乳杆菌、红乳杆菌、L.ruminis、L.saerimneri、沙克乳酸杆菌、唾液乳杆菌、旧金山乳杆菌、L.satsumensis、L.secaliphilus、沙氏乳杆菌、白面粉乳杆菌、穗状乳杆菌、羊脂乳杆菌、泰国乳杆菌、厄尔纳拉乳杆菌、瓦氏乳杆菌、阴道乳杆菌、弗氏乳杆菌、L.vini、小牛乳杆菌、玉米乳杆菌、老面乳杆菌、勒克氏菌属、军团菌属：阿德莱德军团菌、意大利军团菌、贝林登军团菌、伯明翰军团菌、博兹曼军团菌、布伦军团菌、布萨尼亚军团菌、彻氏军团菌、辛辛那提军团菌、唐纳森军团菌、德拉库尔军团杆菌、L.drozanskii、红色军团菌、费尔菲尔德军团菌、法洛尼军团菌、菲氏军团菌、吉斯蒂纳军团菌、L.genomospecies、L.gratiana、格雷坞军团菌、哈开里军团菌、L.impletisoli、以色列军团菌、詹姆斯敦军团菌、`念珠菌军团菌'、约旦军团菌、兰辛氏军团菌、隆地军团菌、长滩军团菌、L.lytica、马切尼军团菌、密达代军团菌、摩拉维采军团菌、水手军团菌、奥克里奇军团菌、巴黎军团菌、嗜肺军团菌、四季军团菌、昆里瓦尼军团菌、L.rowbothamii、红光军团菌、圣海伦军团菌、卫生十字军团菌、沙氏军团菌、斯皮里特湖军团菌、施氏军团菌、都灵军团菌、图森军团菌、瓦兹沃西军团菌、L.waltersii、沃斯利军团菌、L.yabuuchiae；勒米诺菌属、钩端螺旋体属：问号钩端螺旋体、克氏针螺旋体、诺盖奇钩端螺旋体、亚历山大钩端螺旋体、卫力钩端螺旋体、钩端螺旋体基因组1、博氏钩端螺旋体、檀香钩端螺旋体、内代钩端螺旋体、法氏钩端螺旋体、布鲁姆钩端螺旋体、李氏钩端螺旋体、双钩端螺旋体、梅耶尔钩端螺旋体、沃尔巴克氏钩端螺旋体、钩端螺旋体基因组3、钩端螺旋体基因组4、钩端螺旋体基因组5；瘤型麻风(丹尼尔森-伯克病)、犬钩端螺旋体、七日热钩端螺旋体、钩端螺旋体病(韦尔氏病/黄疸出血钩端螺旋体/问号钩端螺旋体黄疸出血血清变种)、钩端螺旋体、明串珠菌属：肉明串珠菌、柠檬黄明串珠菌、榴莲明串珠菌、欺诈明串珠菌、榕树明串珠菌、果核明串珠菌、大蒜明串珠菌、气生明串珠菌、凝胶明串珠菌、L.inhae、金氏明串珠菌、乳酸明串珠菌、肠系膜明串珠菌、假榕树明串珠菌、假肠膜明串珠菌；李斯特菌属：灰色李斯特菌、英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌、单核细胞增生李斯特菌(李氏杆菌病)、斯氏李斯特菌、威尔士李斯特菌；Methanobacterium extroquens、多形性微杆菌、微球菌属：南极微球菌、黄色微球菌、藤黄微球菌、烯丙基微球菌、微球菌粘液病、玫瑰微球菌、定居微球菌；动弯杆菌、苗勒氏菌属、莫尔甘内拉属、莫拉菌属：大西洋莫拉菌、Moraxellaboevrei、牛莫拉菌、犬莫拉菌、山羊莫拉菌、卡他莫拉菌(卡他布兰汉氏菌)、豚鼠莫拉菌、兔莫拉菌、马莫拉菌、腔隙莫拉菌、林肯莫拉菌、非液化莫拉菌、延髓莫拉菌、奥斯洛克莫拉菌、甘蔗莫拉菌；摩氏摩根菌、分枝杆菌属：脓肿分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田野分枝杆菌、艾氏分枝杆菌、肺泡分枝杆菌、M.arupense、亚洲分枝杆菌、M.aubagnense、金色分枝杆菌、南非分枝杆菌、鸟分枝杆菌(巴提病/温德米尔女士综合征)、鸟分枝杆菌副结核杆菌病(与人类克罗恩病和羊的约翰氏病有关)、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌亚种hominissuis、M.olombiense、鲍氏分支杆菌、b波西米亚分枝杆菌、博莱蒂分枝杆菌、M.botniense、牛分枝杆菌(牛结核病)、布氏分支杆菌、布氏分支杆菌、布鲁分枝杆菌、加那利分枝杆菌、山羊分枝杆菌、青皮分枝杆菌、龟分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、赤塔分枝杆菌、氯酚红分枝杆菌、楚布分枝杆菌、M.conceptionense、汇合分枝杆菌、出众分枝杆菌、库克分枝杆菌、M.cosmeticum、迪氏分枝杆菌、多里库姆分枝杆菌、杜瓦利埃分枝杆菌、象皮分枝杆菌、诡诈分枝杆菌、产鼻疽分枝杆菌、黄分枝杆菌、M.florentinum、M.fluoroanthenivorans、偶发分枝杆菌、偶发分枝杆菌Acetamidolyticum亚种、M.frederiksbergense、加地斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、古地分枝杆菌、戈登分枝杆菌(水分枝杆菌)、嗜血分枝杆菌、哈氏分枝杆菌、黑核分枝杆菌、海德堡分枝杆菌、冬眠分枝杆菌、霍德勒分枝杆菌、结核分枝杆菌、猴分枝杆菌、产免疫分枝杆菌、插入分枝杆菌、中间分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、科莫斯分枝杆菌、库比卡分枝杆菌、库马托分枝杆菌、腔隙分枝杆菌、豆状分枝杆菌、麻风分枝杆菌(导致麻风病或汉森病/汉森氏病)、麻风分枝杆菌、马达加斯加分枝杆菌、玛格丽特分枝杆菌、马尔默分枝杆菌、海洋分枝杆菌(鱼缸肉芽肿)、块状分枝杆菌、微体分枝杆菌、单胞菌分枝杆菌、孟氏分枝杆菌、莫里冈分枝杆菌、粘原性分枝杆菌、胞壁分枝杆菌、内布拉斯加分枝杆菌、新金分枝杆菌、新奥尔良分枝杆菌、非嗜铬分枝杆菌、新卡斯特分枝杆菌、结核分枝杆菌、沼泽分枝杆菌、副偶发分枝杆菌、副微生物分枝杆菌、帕曼分枝杆菌、外来分枝杆菌、草分枝杆菌、弗卡分枝杆菌、针状分枝杆菌、猪分枝杆菌、海绵分枝杆菌、M.pseudoshottsii、粉状分枝杆菌、耐冷分枝杆菌、耐热分枝杆菌、罗得西亚分枝杆菌、萨斯喀彻温分枝杆菌、淋巴结分支杆菌、塞内加尔分枝杆菌、骨分枝杆菌、败血分枝杆菌、岛状分枝杆菌、结核分枝杆菌、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、球形分枝杆菌、舒尔盖分枝杆菌、龟分枝杆菌、耐热分枝杆菌、东海分枝杆菌、三叉分枝杆菌、次要分支杆菌、结核分枝杆菌(人类结核病的主要原因)、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、山羊分枝杆菌、针状分枝杆菌'、托斯卡纳分枝杆菌、溃疡分枝杆菌(引起拜恩斯代尔溃疡/布鲁里溃疡)、母牛分枝杆菌、范巴勒尼分枝杆菌、沃林斯基分枝杆菌、异种分枝杆菌；支原体属：发酵支原体、生殖支原体、人型支原体、穿透支原体、霉形支原体、肺炎支原体、钩端螺旋体病(七日热)、奈瑟氏球菌属：淋球菌(淋球菌/淋病)、脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎球菌)、干燥奈瑟菌、灰色奈瑟菌、长奈瑟球菌、黄奈瑟氏球菌、乳酸奈瑟菌、奈瑟氏球菌粘膜、奈瑟氏球菌多糖、奈瑟菌亚熔岩；硝化细菌属、诺卡氏菌属：星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌、豚鼠诺卡氏菌；Noma(口颊坏疽/走马疳)、肥大杆菌属、寡营养属、恙虫病东方体(恙虫病)、产甲酸草酸杆菌、泛菌属：成团泛菌、菠萝泛菌、檬泛菌、分散泛菌、点状泛菌、斯氏泛菌、Pantoeaterrea；巴氏杆菌属：产气巴氏杆菌、鸭巴氏杆菌、禽巴氏杆菌、巴氏杆菌属、马巴氏杆菌、犬巴氏杆菌、达可马巴氏杆菌、鸡杀巴氏杆菌、鸡巴氏杆菌、肉芽肿曼氏杆菌、兰加巴氏杆菌、淋巴管炎巴氏杆菌、麦氏巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、嗜肺巴氏杆菌、新型病原生物巴氏杆菌、口巴氏杆菌、龟巴斯德氏菌、海藻糖巴氏杆菌、兔巴氏杆菌、尿素巴氏杆菌、禽源巴氏杆菌；片球菌属：乳酸片球菌、纤维片球菌、克劳森片球菌、有害片球菌、糊精片球菌、耐乙醇片球菌、意外片球菌、细小片球菌、戊糖片球菌、细片球菌；消化链球菌属：厌氧消化链球菌、不解糖消化链球菌、P.harei、氢化消化链球菌、P.indoliticus、艾弗消化链球菌、泪液消化链球菌、解乳消化链球菌、大消化链球菌、微小消化链球菌、八叠消化链球菌、普氏消化链球菌、四联消化链球菌、阴道毛滴虫；发光杆菌属、光根瘤菌属、类志贺邻单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、布拉格菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属：痤疮丙酸杆菌、丙酸丙酸盐杆菌；变形杆菌属：奇异变形杆菌、摩氏变形杆菌、彭氏变形杆菌、雷氏变形杆菌、普通变形杆菌；普罗维登西亚属：弗氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌；假单胞菌属：铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、病鳝假单胞菌、阿根廷假单胞菌、P.borbori、香茅醇假单胞菌、变黄假单胞菌、门多萨假单胞菌、硝基还原假单胞菌、油质假单胞菌、假产碱假单胞菌、树脂假单胞菌、稻草假单胞菌、桔橙假单胞菌、致金色假单胞菌、绿针假单胞菌、莓实假单胞菌、隆德假单胞菌、腐臭假单胞菌、南极假单胞菌、偶氮假单胞菌、十字花科假单胞菌、布伦南假单胞菌、雪松假单胞菌、波纹假单胞菌、荧光假单胞菌、格氏假单胞菌、李氏假单胞菌、曼德利假单胞菌、莴苣叶斑病假单胞菌、地中海假单胞菌、美国假单胞菌、米氏假单胞菌、粘蛋白假单胞菌、东方假单胞菌、西洋参假单胞菌、蛋白水解假单胞菌、罗得西亚假单胞菌、产黄假单胞菌、赛维瓦尔假单胞菌、蘑菇褐斑病假单胞菌、维罗纳假单胞菌、脱氮假单胞菌、百日咳假单胞菌、克雷伯氏假单胞菌、富尔瓦假单胞菌、蒙氏假单胞菌、苔藓假单胞菌、稻皮假单胞菌、副富瓦假单胞菌、香鱼假单胞菌、恶臭假单胞菌、巴利阿里假单胞菌、绿脓假单胞菌、施氏假单胞菌、扁桃假单胞菌、丁香假单胞菌、加勒比假单胞菌、菊苣假单胞菌、燕麦晕斑病假单胞菌、天仙果假单胞菌、苦楝假单胞菌、萨瓦斯坦假单胞菌、丁香假单胞菌、绿黄假单胞菌、松香假单胞菌、嗜酸假单胞菌、琼胶假单胞菌、碱性假单胞菌、链烷醇假单胞菌、淀粉降解假单胞菌、铁角蕨假单胞菌、固氮假单胞菌、大麻假单胞菌、辅酶假单胞菌、同源假单胞菌、肋状假单胞菌、铜绿假单胞菌、德尔希假单胞菌、激基假单胞菌、极端东方假单胞菌、弗雷德里克森假单胞菌、褐阴道假单胞菌、石花菜假单胞菌、格林假单胞菌、籼稻假单胞菌、耶森假单胞菌、金爵假单胞菌、基尔假单胞菌、克氏假单胞菌、P.koreensis、亚麻假单胞菌、P.lutea、莫拉氏假单胞菌、奥蒂假单胞菌、海绵假单胞菌、帕勒隆尼氏假单胞菌、巴氏假单胞菌、烂泥假单胞菌、腐卵假单胞菌、草假单胞菌、P.pohangensis、嗜冷假单胞菌、耐冷假单胞菌、老鼠假单胞菌、爬虫假单胞菌、P.resiniphila、根际假单胞菌、冬凌草假单胞菌、萨氏假单胞菌、P.segitis、病蜂假单胞菌、猴假单胞菌、猪假单胞菌、耐热假单胞菌、丁香假单胞菌、平凡假单胞菌、涡虫假单胞菌、P.tuticorinensis、阴城假单胞菌、温哥华假单胞菌、弗村假单胞菌、黄色海假单胞菌；拉恩氏菌属、罗尔斯通菌属：巴西雷氏菌属、R.campinensis、真氧产碱杆菌、Ralstoniagilardii、危险罗尔斯通氏菌、甘露醇罗尔斯通氏菌、R.metallidurans、少见罗尔斯顿菌、皮氏罗尔斯顿菌、呼吸道拉尔夫氏菌、青枯雷尔氏菌、罗尔斯顿菌属、台湾罗氏菌；拉乌尔菌属、红芽生菌属、红假单胞菌属、鼻硬结杆菌、放射型根瘤菌、马红球菌、立克次体属：非洲热立克次体、痘立克次体、澳大利亚热立克次体、牙形立克次体、猫科立克次体、日本热立克次体、穆塞利立克次体、普氏立克次体(斑疹伤寒)、落矶山热立克次体、西贝瑞克立克次体、伤寒立克次体、牙形立克次体、非洲热立克次体、鹦鹉热立克次体、五日热立克次体、落矶山热立克体、沙眼立克次体；龋齿罗氏菌、沙门氏菌属：亚利桑那沙门氏菌、邦戈沙门氏菌、肠道沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌(伤寒)、鼠伤寒沙门氏菌、萨拉姆沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、双亚利桑那沙门氏菌、霍特南沙门氏菌、籼米沙门氏菌；桑松亚属、沙雷氏菌属：嗜虫沙雷氏菌、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、灰沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、臭沙雷氏菌、普城沙雷氏菌、变形斑沙雷氏菌、奎宁沙雷氏菌、深红沙雷氏菌、解脲沙雷菌；腐败希瓦氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、索达利斯属、螺旋菌属：螺旋菌-鼠咬热、葡萄球菌属：金黄色葡萄球菌、耳状葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、猫葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、卢格登葡萄球菌、佩氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、施氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌、小牛葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌；寡养单胞菌属：嗜酸寡养单胞菌、独岛寡养单胞菌、朝鲜寡养单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、还原亚硝酸盐单胞菌、嗜根寡养单胞菌；链杆菌属：串珠状链杆菌(链杆菌鼠咬热)；链球菌属：甲型链球菌、乙型链球菌、无乳链球菌、胶质链球菌、鸟链球菌、牛链球菌、犬链球菌、环状链球菌、面部链球菌、粪链球菌、野鼠链球菌、鸡链球菌、乳酸链球菌、米氏链球菌、轻型链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、穿孔链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、鼠链球菌、唾液链球菌、血链球菌、远缘链球菌、副鳗链球菌、猪链球菌、嗜热链球菌、前庭链球菌、绿色链球菌、结核链球菌、兽疫链球菌；痰塔特姆菌属、特拉布斯氏菌属、密螺旋体属：品他病密螺旋体(Pinta)、齿密螺旋体、皮下密螺旋体(Bejel)、梅毒螺旋体(梅毒)、细弱密螺旋体(Yaws)；滋养层造口病(造口病)、结核菌样麻风病、解脲脲原体、韦荣球菌属、弧菌属：产气弧菌、普通弧菌、琼脂弧菌、阿尔贝弧菌、溶藻弧菌、巴西弧菌、卡尔维弧菌、坎贝尔弧菌、查加斯弧菌、霍乱弧菌(霍乱)、辛辛那提弧菌、霍乱弧菌、珊瑚弧菌、牡蛎弧菌、环状弧菌、恶魔弧菌、重氮弧菌、埃祖拉弧菌、费氏弧菌、河流弧菌、富氏弧菌、弗尼斯弧菌、鸡弧菌、产气弧菌、巨大弧菌、鲍鱼肠弧菌、哈维氏弧菌、肝弧菌、西班牙弧菌、鱼类弧菌、卡那洛弧菌、迟缓弧菌、海岸噬菌弧菌、火神弧菌、地中海弧菌、梅氏弧菌、拟态弧菌、贻贝弧菌、需钠弧菌、霍乱弧菌、新纳氏弧菌、尼普图纽斯弧菌、沙蚕弧菌、黑色弧菌、奥德利弧菌、东方弧菌、太平洋弧菌、副溶血弧菌、果胶弧菌、对虾弧菌、博美氏弧菌、杜氏弧菌、溶蛋白弧菌、轮虫弧菌、风疹弧菌、鲁木弧菌、杀鲑弧菌、霍乱弧菌、灿烂弧菌、超级弧菌、绦虫弧菌、塔斯马尼亚弧菌、图比亚希弧菌、创伤弧菌、沃达尼弧菌、徐氏弧菌；产靛福格斯氏菌、威格斯沃氏属、沃尔巴克氏体属、异短杆菌属、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌、和预研菌属。

可使用本发明的方法识别或可用作全生物体对照物的示例性病毒包括但不限于：腺相关病毒、爱知病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、BK多瘤病毒、杆状病毒、版纳病毒、巴尔马森林病毒、布尼奥罗病毒、拉克罗斯布尼亚病毒、北美野兔布尼亚病毒、尾猿疱疹病毒、昌迪普拉病毒、基孔肯雅病毒、A型微小核糖核酸病毒、牛痘病毒、柯萨奇病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、登革热病毒、多里病毒、杜贝病毒、杜文黑基病毒、东方马脑炎病毒、埃博拉病毒、回声病毒、脑心肌炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒、GB C型/庚型肝炎病毒、汉坦病毒、亨德拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、三角洲肝炎病毒、马痘病毒、人类腺病毒、人类星状病毒、人类冠状病毒、人类巨细胞病毒、人类肠道病毒68型、70型、1型人类疱疹病毒、2型人类疱疹病毒、6型人类疱疹病毒、7型人类疱疹病毒、8型人类疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、1型人类免疫缺陷病毒、2型人类免疫缺陷病毒、1型人乳头瘤病毒、2型人乳头瘤病毒、16、18型人乳头瘤病毒、人类副流感、人类细小病毒B19、人类呼吸道合胞病毒、人类鼻病毒、人类SARS冠状病毒、人类逆转录病毒、人类嗜T淋巴细胞病毒、人类圆环病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、伊斯法罕病毒、JC多瘤病毒、日本脑炎病毒、呼宁砂粒样病毒、KI多瘤病毒、昆金病毒、拉各斯蝙蝠病毒、维多利亚湖马伯格病毒、兰加特病毒、拉萨病毒、洛德代尔病毒、娄平病病毒、淋巴细胞性绒毛膜脑膜炎病毒、马楚波病毒、马亚罗病毒、MERS冠状病毒、麻疹病毒、蒙戈脑心肌炎病毒、默克尔细胞多瘤病毒、莫科拉病毒、传染性软疣病毒、猴痘病毒、腮腺炎病毒、默里谷脑炎病毒、纽约病毒、尼帕病毒、诺沃克病毒、奥尼尔病毒、奥尔夫病毒、奥罗普切病毒、细小病毒、皮辛德病毒、脊髓灰质炎病毒、庞塔托鲁静脉病毒、普马拉病毒、狂犬病病毒、裂谷热病毒、A型Rosa病毒、罗斯河病毒、A型轮状病毒、B型轮状病毒、C型轮状病毒、风疹病毒、萨基亚马病毒、A型唾液病毒、白蛉热西西里病毒、札幌病毒、塞姆利基森林病毒、首尔病毒、猿猴泡沫病毒、5型猿猴病毒、辛德比斯病毒、南安普顿病毒、圣路易脑炎病毒、蜱传波瓦森病毒、扭转特诺病毒、托斯卡纳病毒、尤库尼米病毒、痘苗病毒、水痘-带状疱疹病毒、天花病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西方马脑炎病毒、吴多瘤病毒、西尼罗河病毒、雅巴猴肿瘤病毒、雅巴样疾病病毒、黄热病病毒、寨卡病毒。

可使用本发明的方法识别或可用作全生物体对照物的示例性真菌包括但不限于念珠菌属、烟曲霉属和新型隐球菌属、非烟曲霉属、接合菌属、镰孢菌属和博氏假杆菌属。

可使用本发明的方法识别或可用作全生物体对照物的示例性古生菌包括但不限于：广古菌、泉古菌、纳古菌、奇古菌、曙古菌、嗜泉古菌、初古菌、嗜热金属球菌、热自养甲烷杆菌、日本甲烷球菌、日本甲烷球菌、阿卜耶西焦球菌ST549、强烈炽热球菌、激烈火球菌、强烈火球菌、焦球菌、芝田硫化叶菌、Gθ硫磺矿硫化叶菌、MT4硫磺矿硫化叶菌、嗜热高温球菌、海滨嗜热球菌。

可使用本发明的方法识别或可用作全生物体对照物的示例性原生生物包括但不限于：棘阿米巴虫、变形阿米巴虫、巴拉姆希阿米巴虫、溶组织内阿米巴虫、纤细眼虫、蓝氏贾第虫、黄花草履虫、恶性疟原虫、葡萄原虫、致病疫霉菌、浮游植物属、短棘盘星藻、布氏锥虫、克氏锥虫。

可使用本发明的方法识别或可用作全生物体对照物的示例性寄生生物包括但不限于：体外寄生虫、体内寄生虫、中层寄生虫、拟寄生虫、重寄生虫、社会寄生虫、阿德福-寄生虫。

可在本发明的方法中使用的示例性原核细胞或真核细胞包括但不限于：中国仓鼠卵巢细胞(CHO、CHO-K1、CHO PRO-3、DUKX-X11、DG44)、人胚胎肾细胞293(HEK 293、HEK293T)、马丁·达比犬肾细胞(MDCK)、小鼠骨髓瘤细胞(NS0、SP2/0)、MEL、非洲绿猴肾(COS)细胞、昆虫细胞(草地贪夜蛾、SF9、SF21、粉纹夜蛾)、酵母细胞(毕赤酵母、酿酒酵母)。

感测方法

在多个实施例中，本公开设想了一种用于提供包含一个或多个受保护的核酸序列的样品(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)的方法，该样品在使用NAT处理时会提供期望的结果，并且可用于评价NAT的功能。在多个实施例中，所述方法包括：(a)修饰至少一种保护载体(例如生物细胞和/或病毒)，使其包含在该保护载体中非天然存在的核酸或核酸序列；(b)在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中提供所述一种或多种保护载体(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)，该保护载体包括非天然存在的核酸序列(第二核酸序列)以及疑似是将在NAT中检测的样品的生物体的天然存在的附加核酸序列(第一核酸序列)，从而该NAT的期望结果是感测第二核酸序列和第一核酸序列的核酸。

在一个替代实施例中，所述方法包括：(A)修饰至少一种保护载体(例如生物细胞和/或病毒)，使其包含在该保护载体中非天然存在的核酸或核酸序列，(B)在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中提供一种或多种保护载体(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)，其中所述至少一种保护载体(例如细胞和/或病毒)包含非天然存在的核酸序列(第二个核酸序列)，并且其中该保护载体(例如细胞或病毒或附加的细胞或病毒)包含在将通过NAT检测的样品中的细胞或生物体内天然存在的核酸序列(第一核酸序列)，从而该NAT的期望结果是感测第一核酸序列和第二核酸序列的核酸。

在本发明的多个实施例中，本发明的质量对照组合物包括一个或多个受保护的核酸序列，其中所述核酸序列单独或共同表征处于一种或多种保护载体中的将在NAT中检测的目标核酸序列或天然生物体(不具有目标核酸序列且属于同一族系的生物体)。在多个实施例中，所述包括一个或多个核酸序列的保护载体单独或共同包括将在NAT中检测的对于生物体是天然的目标核酸或基因组(根据具体情况)的0.5至100％、或大于90％、或大于80％、或大于70％、或大于60％、或大于50％、或大于40％、或大于30％、或大于20％、或大于15％、或大于10％、或大于5％、或大于4％、或大于3％、或大于2％、或大于1％。应说明的是，在一些实施例中，所述天然生物体的核酸的保护载体不是疑似存在于样品中的天然生物体，而可以是另一种保护载体。在多个其他实施例中，本发明的质量对照组合物包括在NAT中类似地处理的生物体，但是该生物体不同于疑似存在于将通过NAT检测的样品中的天然生物体，并且该生物体的天然基因序列或基因组序列将在NAT中被检测，作为关于系统或系统的某些方面如何处理所述类别的生物体的对照物。

在多个实施例中，所述方法包括：(a)修饰至少一种保护载体(例如生物细胞和/或病毒)，使其包含非天然存在的核酸或核酸序列，(b)在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中提供所述保护载体(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)，该保护载体包含非天然存在的核酸(第二核酸序列)，以及另一种附加的保护载体(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)，该附加的保护载体包含天然存在的核酸序列(第一核酸序列)，从而NAT的期望结果是感测第一和第二核酸序列的核酸(这是在对包含第一和第二核酸序列的单种天然存在的生物体进行NAT的情况下的通常结果)。

在其他实施例中，本公开提供了一种用于提供包括保护载体(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)的样品的方法，该样品在通过NAT处理时会提供所期望的结果，这种结果是使用处于未经修饰的状态的所述保护载体(例如生物细胞和/或病毒)所不能实现的，但是能够使用另一种不同的保护载体(例如天然存在的细胞或病毒)实现。在多个实施例中，所述方法包括：(a)修饰所述保护载体(例如生物细胞和/或病毒)，使其包含非天然存在的核酸或核酸序列，(b)在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中提供所述保护载体(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)，该保护载体包括非天然存在的核酸(第二核酸序列)和天然存在的核酸序列(第一核酸序列)，从而NAT的期望结果是感测第一核酸序列的核酸和来自第二序列的核酸(这是在对包含第一和第二核酸序列的单种天然存在的生物体进行NAT的情况下的通常结果)。

在其他实施例中，本公开提供了一种用于提供包括多于一个受保护的核酸序列的检测样品的方法，该检测样品例如是可在NAT中感测的基本上完好的生物细胞和/或病毒。在多个实施例中，所述方法包括：(a)修饰两种或更多种保护载体中的至少一种(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)，以使其包括非天然存在的核酸或核酸序列，(b)在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中组合地提供所述包含非天然存在的核酸(第二核酸序列)的保护载体(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)以及一个包括天然存在或天然的核酸序列(第一核酸序列)的受保护的核酸序列(例如基本上完好的生物细胞和/或病毒)，从而NAT的期望结果是感测第一和第二核酸序列的核酸(这是在对包含第一和第二核酸序列的单种天然存在的生物体进行NAT的情况下的通常结果)。

在多个实施例中，本公开提供了一种用于提供对照物的方法，该对照物用于使用NAT感测生物检测样品中的生物体，其中所述生物体是具有或不具有特定的第一遗传性状或特征的物种或属的成员，所述第一遗传性状或特征与一些但非全部成员的基因物质中的核酸序列相关，并且其中所述生物体包括不是其物种或属的所有成员共有的第二遗传性状或特征，并且其中所述NAT感测由所述第一基因序列表征的遗传性状或特征以及与不是所述属或种的成员共有的第二基因序列相关的第二性状或特征。在多个实施例中，所述方法包括：(a)如本文所述在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中提供包括受保护的核酸序列的对照材料(例如基本上完好的细胞和/或病毒)，其中所述受保护的核酸序列之一(例如完好的细胞或病毒)包括第一基因序列，并且所述完好的细胞或病毒之一包括第二基因序列；(b)使用NAT感测第一性状或特性；并且(c)使用NAT感测第二性状或特征，从而NAT的结果与为具有第一和第二性状的单种生物体获得的结果类似。

在多个实施例中，本公开提供了一种用于提供对照物的方法，该对照物用于使用NAT感测生物检测样品中的生物体。在多个实施例中，所述方法包括：(a)获得疑似包括感兴趣的生物体或核酸的生物检测样品；(b)如本文所述在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中提供包括一种或多种保护载体的对照材料(例如基本上完好的细胞和/或病毒)；(c)使用NAT感测生物体；并且(d)使用NAT感测对照材料。在相关的实施例中，所述保护载体或基本上完好的细胞和/或病毒或对照物可以是单种保护载体或生物体或者两种或更多种保护载体或生物体(多生物体)。在一些实施例中，一种保护载体或生物体可包含提供在保护载体或生物体中非天然存在的特征的核酸序列(例如重组核酸序列)。在一些实施例中，所述对照物可用于确认NAT的正确工作，从而对生物检测样本进行的NAT的结果被确认(或验证或信任或支持或控制)，或被确定为是有用的。在一些实施例中，所述对照材料会在NAT中提供肯定或确认性的结果，换句话说，是定性的结果。在一些实施例中，所述对照物会在NAT中提供已知或预期的量值或与某种先前或同时的结果一致或相当的量值，换句话说，是定量的结果。

在多个实施例中，本公开提供了一种提供检测样本的方法，该检测样本用于通过NAT感测生物检测样品中的生物体，所述方法包括：(a)如本文所述在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中提供包括受保护的核酸序列的对照材料(例如基本上完好的细胞和/或病毒)；并且(b)使用NAT感测对照材料。在相关实施例中，所述受保护的核酸序列(例如对照物的基本完好的细胞和/或病毒)可在单种保护载体(例如生物体)中或两种或更多种保护载体(例如生物体)中(多生物体)。在一些实施例中，一种保护载体或生物体可包含提供在保护载体或生物体中非天然存在的特征的核酸序列(例如重组核酸序列)。在一些实施例中，所述对照物可用于确认NAT的正确工作，从而对生物检测样本进行的NAT的结果被确认(或验证或信任或支持或控制)，或被确定为是有用的。在一些实施例中，所述对照材料会在NAT中提供肯定或确认性的结果，换句话说，是定性的结果。在一些实施例中，所述对照物会在NAT中提供已知或预期的量值或与某种先前或同时的标准一致或相当的量值，换句话说，是定量的结果。在一些实施例中，所述对照材料将用于检测、证明、验证、确认或评价NAT和/或执行NAT的实验室、设施或机构的能力；换句话说，所述对照材料可用于能力测试或实验室间比较，包括但不限于由政府或行业指定的能力测试计划、认证计划、质量保证计划或类似的测试方案，无论这些计划或方案是否是法律或标准所要求的。

在多个实施例中，本公开提供了一种提供检测样品的方法，该检测样品用于开发、测试、确认或认证NAT，或者用于进行培训，以实现提供和执行NAT的目的。所述方法包括：(a)如本文所述在液体(或作为将重构成液体形式的固体)中提供包括受保护的核酸序列的对照材料(例如基本上完好的细胞和/或病毒)；并且(b)使用NAT感测对照材料。在相关实施例中，所述受保护的核酸序列(例如对照物的基本完好的细胞和/或病毒)可在单种保护载体(例如生物体)中或两种或更多种保护载体(例如生物体)中(多载体或多生物体)。在一些实施例中，一种保护载体(例如生物体)可包含提供在保护载体或生物体中非天然存在的特征的核酸序列(例如重组核酸序列)。在一些实施例中，所述对照物可用于开发、改进、考验或测试NAT，以评价NAT的正确功能，以便在生物检测样品或检测样品组或类别的检测中起到效用或未来效用。在一些实施例中，所述对照材料会在NAT中提供肯定或确认性的结果，换句话说，是定性的结果。在一些实施例中，所述对照物会在NAT中提供已知或预期的量值或与某种先前或同时的结果一致或相当的量值，换句话说，是定量的结果。在一些实施例中，所述对照材料用于支持NAT的开发。在其他实施例中，所述对照材料用于支持NAT的安装和/或采用和/或操作资格认证，例如但不限于在以前未使用过NAT的场所进行。在其他实施例中，所述对照材料用于支持在NAT的使用中进行操作员和/或管理或质量保证系统的培训或资格认证。在一些实施例中，所述对照材料可称为验证和/或确认对照物，或者称为其他相关或类似的术语。

在多个实施例中，本公开提供了一种按照本文所述的方法提供检测样品的方法，其中设有检测样品的介质(可以是为了重构成液体形式的目的而提供的固体)包括但不限于液体，所述液体是、类似于或以某种方式模拟生物液体，或者在其与NAT的执行的相容性方面具有类似于生物介质的表现。示例性介质包括生物液体，例如全血、血清、血浆、去纤维血浆、经过稳定化的血浆池、脑脊液、尿液、唾液、精液、痰、汗液、眼分泌物、鼻分泌物和阴道分泌物。在多个实施例中，所述检测样品可按照能够提供生物样品的形式的设置在基质、容器或表面之内或之上，包括血液收集管、其他样品收集管、与收集装置相关联的防腐液体、拭子、纸、或者其他收集、保存或运输容器或介质。

在多个实施例中，本发明提供了一种用于评价某种NAT以及可选地评价多于一种NAT和/或另外的感测系统(例如核酸、非核酸感测系统/检测)的功能的质量对照组合物。因此，在一些方面中，本发明包括本发明的组合物之中的任何一种，其中，所述NAT用于感测在检测物品中存在一种或多种另外的生物体，所述组合物还包括针对相同或不同生物体或NAT的目标核酸序列的一种或多种另外的对照物，其中的每种物质均在NAT中检测。例如，请参考图4F、4G、4H、5C或6C、10，它们示出了多重NAT，其中所述质量对照组合物除了包括针对生物体“B”的质量对照组分之外，还包括针对检测物品中的第二种生物体“A”的另外的质量对照组分。或者或另外，本发明的质量对照组合物可包括可能疑似存在于样品或检测物品中的另外的生物体的基于非NAT的感测系统。此外，或者或另外，本发明的质量对照组合物可包括用于相同生物体的另外的对照物成分(双重或多重对照物)，例如用于具有针对疑似存在于样品(或检测物品)中的相同生物体的不同目标序列的NAT或不同的核酸检测(非NAT)、或用于基于非核酸的感测系统(例如免疫测定和抗体使用)的另外的质量对照物(例如参见图8或图9)。因此，本发明还提供了一种使用所述组合物进行对照检测的方法，其中所述NAT同时、并行或独立地(i)对样品或检测物品执行相同的检测；或者(ii)同时、并行或独立地执行(即，执行另一种检测，无论是该检测是附加的NAT还是另一个感测系统)。

在多个实施例中，所述对照物可包括通过两种或更多种NAT组合和评价的两种或更多种不同的生物体，其中两种或更多种NAT的结果的组合可从单种天然存在的生物体获得，该生物体天然地包括通过两种或更多种NAT识别的序列。在其他实施例中，所述两种或更多种不同的生物体在两种或更多种NAT检测的组合中给出的结果不同于可从单种天然存在的生物体获得的结果，其中从两种或更多种生物体的组合获得的结果可用作针对NAT的正确工作的对照物，使得NAT得到确认、验证、信任、支持或控制、或者被确定为是有用的。

在多个实施例中，所述对照物可包括通过两种或更多种NAT组合和评价的两种或更多种不同的生物体，其中两种或更多种NAT的结果的组合可从单种天然存在的生物体获得，该生物体天然地包括通过两种或更多种NAT识别的序列；并且其中所述单种天然存在的生物体在其存活状态下可能更危险和/或对生物体更危险。在其他实施例中，能够以比天然存在的生物体低的生物安全水平或对参与生产和/或使用的人员的风险较低的人员风险水平生产所述检测样品。

在多个实施例中，本发明的对照物包括通过NAT识别的与天然存在的生物体中的序列类似的序列，其中这些序列是从天然存在的序列修饰而来的。举例但非限制性地说，可对序列进行裁截，或者通过对序列的更改来改变该序列，或者通过某些核酸的翻译后修饰来改变该序列。作为另一个非限制性的例子，序列可结合改变基因转录或翻译的变化，例如引入终止密码子、稀有密码子，改变该序列所编码的氨基酸、改变控制、促进或抑制转录或翻译的遗传元件，或进行其他变化。本领域技术人员应认识到，能够在基因序列中引入不会使该基因序列在针对类似序列设计的NAT中不能再被识别的变化。此外，还应认识到，在很多情况下，对与NAT的组成部分(例如基于PCR的检测中的引物和探针)相互作用的序列部分和这些序列中的不相互作用的部分进行更改不会使这种检测中的识别失效。

在多个实施例中，本公开提供了一种用于提供对照物的方法，该对照物用于使用免疫测定或基于表达的测定来感测生物检测样品中的生物体。在多个实施例中，所述方法包括：(a)获得疑似包括感兴趣的生物体或核酸的生物检测样品；(b)提供对照材料，该对照材料包括如本文所述的液体形式的材料(或作为将重构成液体形式的固体)；(c)使用免疫测定或基于表达的测定感测生物体；并且(d)使用免疫测定或基于表达的测定感测对照材料。

虽然在NAT或免疫测定或其他检测的背景下多种生物体或多于一种生物体有可能像单种生物体那样使用，但是本公开在某些方面还考虑了检测材料在代表多种生物体的对照物中的用途；在某些情况下，并不是所有包含在这种多生物体中的检测材料都需要通过在本文中提供的方法来制备，但是在本公开中不考虑不是通过这些方法制备的检测材料，除非它们是相容的并且可与在本公开中提供的检测材料一起包含在多生物体对照物中。举例但非限制性地说，可为能够感测天然存在的生物体“A”和天然存在的生物体“B”的NAT提供对照材料，其中生物体“A”是抗药性生物体。由NAT识别的用于感测生物体“A”的对照物部分可如本文所述从包含至少一个由NAT识别的非天然序列的一种或多种生物体构建，而由NAT识别的用于感测生物体“B”的对照物部分可通过本公开之外的方法构建。

本公开设想了一种构建全生物体对照物的方法，其中使用这种对照物的一个关键优点是，全生物体对照物可经历与天然获得的生物样品相同的整个过程，包括但不限于样品浓缩和/或核酸纯化的步骤。但是，在本文还考虑到了可构建在NAT中有用的对照物，其中可向对照物制剂中添加足量的游离核酸(在全生物体对照物外部)，以使其在通常去除少量游离核酸的浓缩和/或纯化过程中存活。本公开提出，向全生物体对照物中添加一定量的游离核酸可替代携带在NAT中被识别的第一种生物体中非天然或内源的序列的第二种全生物体。

试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括质量对照组合物或其组分，可用于评价NAT的功能。在本发明的一些方面中，所述试剂盒包括全生物体对照物或多生物体对照物，可用于通过NAT感测生物检测样品中的生物体或核酸。所述试剂盒还可包括使用该试剂盒和使用质量对照组合物和/或其组分进行NAT的说明，例如全生物体或多生物体对照物及其配方或组成。

下述实施例示出了本公开的方法的代表性示例。根据这些实施例的说明，可基于下文提供的说明来实现和/或实践本发明的其他方面。这些方法涉及在方法学论文中所述的免疫学和分子生物学技术的使用，例如由美国纽约的JOHN WILEY&SONS出版的COLIGAN等人的著作《免疫学实验指南》。在以下论文中详细说明了分子生物学技术：由纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社于2001年出版的SAMBROOK等人的著作《分子克隆：实验室手册》第二版1-3卷；以及由美国纽约的GREENE PUBLISHING和WILEY-INTERSCIENCE出版的AUSUBEL等人的著作《分子生物学实验指南》。在以下文献中说明了医疗的一般方法：由MCGRAW-HILLMEDICAL于2010年出版的MCPHEE AND PAPADAKIS的著作《现代疾病诊断与治疗》(2010年第49版)；以及由MCGRAW-HILL PROFESSIONAL于2008年出版的FAUCI等人的著作《哈里逊内科学》(第17版)。

实施例

以下实施例仅仅是示例性的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围或内容。图1B、2B、4B-4H、5B-5C和6B-6C示出了在下面的“详细说明和实施例”一节中论述的方法的变化形式。

例1：可用于评价感测MRSA的NAT的功能的质量对照组合物(扩增全生物体对照物)

金黄色葡萄球菌株(包括耐甲氧西林和许多其他抗生素的株)是全球医源性感染的主要原因(DIEKEMA ET AL.,CLIN INFECT DIS.2001；32:S114-32)。甲氧西林耐药性由对低亲和力青霉素结合蛋白PBP 2A进行编码的MECA基因决定(BECK ET AL.,JBACTERIOL.1986；165(2):373-8)。将包括全生物体对照物的单种扩增分子对照物用于NAT，以感测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在。

例如，该全生物体对照物包括含有提供对于无甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌株非天然存在的特征的核酸(例如mecA基因)的金黄色葡萄球菌。通过使用质粒或媒介(在其中利用本领域技术人员已知的常规分子生物学方法引入了mecA基因)进行转染，对金黄色葡萄球菌进行基因修饰，使其含有mecA基因或该基因的一部分(图1A)。修饰后的全生物体对照物随后在NAT中用作扩增分子对照物。金黄色葡萄球菌的直接基因修饰可通过多种手段之中的任何一种来实现(包括本文所述的方法)，也可通过为此目的而开发的新方法来实现，可考虑使用其遗传修饰产物构建本文所述的对照物。

或者，所述全生物体对照物包括含有提供在大肠杆菌中非天然存在的一个或多个特征的两个核酸的大肠杆菌。通过使用一种或多种质粒或媒介(在其中利用本领域技术人员已知的常规分子生物学方法引入了来自金黄色葡萄球菌的核酸和mecA基因)进行转染，对大肠杆菌进行基因修饰，使其含有来自金黄色葡萄球菌的外源核酸和mecA基因或所述核酸和mecA基因的一部分。修饰后的全生物体对照物随后在多目标NAT中用作扩增分子对照物(图2A)。

或者，所述全生物体对照物包括含有提供对于无甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌株非天然存在的特征的核酸(例如mecA基因)的金黄色葡萄球菌。所述全生物体对照物还包括经过基因修饰而含有mecA基因或该基因的一部分的大肠杆菌，所述基因修饰是通过使用质粒或媒介(在其中利用本领域技术人员已知的常规分子生物学方法引入了mecA基因)进行转染而实现的。所述全生物体对照物随后在NAT中用作对照物，包括但不限于感测金黄色葡萄球菌的NAT、感测mecA的NAT和/或感测MRSA的NAT。该对照物可广泛用于由不同的NAT厂家和设计者设计的NAT，因为它可被构建为包括许多、大多数或所有典型的MRSA和/或mecA和/或金黄色葡萄球菌的序列。在此说明的本发明为广泛适用的(即，涵盖与MRSA相关的许多不同的NAT)对照物的构建提供了一种有用的新方案，该方案能快速、灵活地应用于对照物的构建，并且能以更安全的生产和处理的方式构建、制造和交付针对有生物危险的生物体(MRSA)的对照物，因为对照物的成分不像MRSA那样危险。

在每种情况下，可构建全生物体对照物以在设计用于感测MRSA的NAT中产生阳性信号，包括用于检测金黄色葡萄球菌(第一核酸序列)的存在的部分NAT和检测mecA(第二核酸序列)的存在的部分NAT。确定样品含有金黄色葡萄球菌和mecA，和/或确定样品表明MRSA的存在。

在本发明的一些其他方面中，本发明的另一个非常有用的特征是，可能因彼此相似而相关但可能存在于不同物种的生物体中的序列可与载体、受保护的载体或全生物体或它们的组合快速组装以产生用于不同NAT的对照物，或者在一些优选和有用的实施例中，该序列可来自至少一种受保护的载体和/或全生物体，或者在一些其他优选实施例中，本发明的对照物包括至少一种生物体。举例但非限制性地说，大肠杆菌O157:H7的mutS-rpoS位点与痢疾杆菌的mutS-rpoS位点的性质几乎相同(LeClerc et al.,Journal ofBacteriology,Dec.1999,p.7614-7617)。通常可以理解的是，mutS-rpoS位点可在质粒中分离，并且可通过本领域技术人员已知的方法进一步转化为无害的核酸序列，并在本文的其他地方对其进行了一定程度的论述，并且这种质粒可被纯化并置于保护载体(例如脂质体)中。本发明的方法教导了可将这种受保护的质粒与普通的非致病性大肠杆菌生物体混合，以在感测大肠杆菌和mutS-rpoS的序列的NAT中提供针对致病性大肠杆菌O157:H7的对照物。此外，在一些其他方面中，本发明教导了可将相同的脂质体保护的质粒与细菌株ECOR24等混合(该株是志贺氏菌属物种的近亲但没有大多数此类物种的致病性)(Pupo et al.,Infection and Immunity,July 1997,p.2685-2692)，以在感测志贺氏菌和mutS-rpoS的序列的NAT中提供对照物。通过这种方式可简化用于NAT的对照物的制造，因为可在两种对照物的制造中使用同一种受保护的核酸(保护在脂质体中的mutS-rpoS)，这简化并加速了这种对照物的开发和交付。此外，在给出的示例中，如此产生的对照物对致病性生物体是有用的，但在制造和交付过程中避免了制造危险材料的复杂性。

显而易见的是，本发明的教导可推广到通过NAT感测多于一个序列的其他情况下的对照物的构建，从而多生物体对照物可在独立的保护载体中提供所述序列，这具有易于构建、在构建后就能将各个受保护的序列用于多种用途、以及提高这种对照物的提供者和潜在用户的安全性的优点。

例2：可用于评价感测MRSA的NAT的功能的质量对照组合物(扩增多生物体对照物)

使用包括不同生物体的混合物的多生物体分子对照物作为NAT的全生物体对照物，以感测MRSA的存在。

在一个示例中，所述全生物体对照物包括与经过基因修饰而含有mecA基因或该基因的一部分的大肠杆菌混合的金黄色葡萄球菌生物体，所述基因修饰是通过使用质粒或媒介(在其中利用本领域技术人员熟知的多种重组质粒构建方法中的任何一种引入了整个mecA基因或该基因的一部分)进行转染而实现的(图3)。或者，通过使用适当改造的病毒媒介(例如噬菌体)进行转导(在该病毒载体中利用本领域技术人员熟知的用于构建重组病毒媒介的多种方法中的任何一种引入了整个mecA基因或该基因的一部分)，可将整个mecA基因或该基因的一部分引入到大肠杆菌中。存在用于将基因物质引入到大肠杆菌中的其他方法，还可开发用于向大肠杆菌中引入外源基因物质的未知方法，可按照本公开的教导使用这些方法之中的任何一种来构建经过修饰的大肠杆菌生物体，以用作全生物体对照物的组分。

可构建全生物体对照物以在设计用于感测MRSA的多目标NAT中产生阳性信号，包括用于检测金黄色葡萄球菌(第一核酸序列)的存在的部分NAT和检测mecA(第二核酸序列)的存在的部分NAT。

根据多目标NAT中的具体限制，确定样品含有金黄色葡萄球菌和mecA，和/或确定样品表明MRSA的存在。所述方法不局限于两种生物体或性状，也可根据需要扩展到更多生物体或性状的组合，以产生用于NAT的对照物。

例3：可用于评价感测MRSA的NAT的功能的质量对照组合物(扩增多生物体对照物)

使用包括不同生物体的混合物(例如来自不同的物种或来源)的多生物体分子对照物作为NAT的全生物体对照材料，以感测MRSA的存在。

在一个示例中，所述全生物体对照物包含与经过基因修饰而包含mecA基因或该基因的一部分的5型人类腺病毒混合的金黄色葡萄球菌生物体，所述基因修饰是通过使用本领域技术人员熟知的多种重组腺病毒构建方法之中的任何一种实现的(图4A)。还可通过本领域技术人员熟知的方法向其他病毒中引入基因物质，包括但不限于腺相关病毒、1型人类疱疹病毒和2型人类疱疹病毒(又称为1型单纯疱疹病毒和2型单纯疱疹病毒)、杆状病毒、马铃薯病毒X、烟草花叶病毒、疫苗病毒、禽痘病毒、人类巨细胞病毒、昆虫痘病毒、α病毒、水泡性口炎病毒，和许多其他病毒，可通过本领域已知的或开发的方法引入外源基因物质来对这些病毒进行基因修饰，可按照本公开的教导使用这些方法之中的任何一种来构建用作全生物体对照物的组分的经过修饰的病毒。

可构建全生物体对照材料以在设计用于感测MRSA的多目标NAT中产生阳性信号，包括用于检测金黄色葡萄球菌(第一核酸序列)的存在的部分NAT和检测mecA(第二核酸)的存在的部分NAT。

根据多目标NAT中的具体限制，确定样品含有金黄色葡萄球菌和mecA，和/或确定样品表明MRSA的存在。所述方法不局限于两种生物体或特征，也可根据需要扩展到更多生物体或特征的组合，以产生用于NAT的对照材料。图4B-4H示出了使用多生物体对照物的方法的变化形式。

例4：可用于评价感测MRSA的NAT的功能的质量对照组合物(扩增全生物体对照物)

使用包括生物体和非生物体相关核酸的混合物的全分子对照物作为用于NAT的全生物体质量对照物，以感测MRSA的存在。

在一个示例中，所述全生物体对照物包含与经过修饰而包含mecA基因或该基因的一部分的纯化质粒核酸混合的金黄色葡萄球菌生物体，所述修饰是通过使用本领域技术人员熟知的多种重组腺质粒构建方法之中的任何一种实现的(图5A)。在一个示例中，所述质粒可源自大肠杆菌，但是还可考虑可在其中使用适当方法产生和/或繁殖经过修饰或重组的核酸质粒或构建体的任何其他细菌株，包括本公开的方法和尚未设想的方法。图5B-5C示出了使用上述多生物体对照物的方法的变化形式。

或者，所述全生物体对照物包括第一生物体(例如金黄色葡萄球菌)以及被改造为包含整个mecA基因或该基因的一部分的第二生物体(例如脂质体)(图6A)。可构建全生物体对照物以在设计用于感测MRSA的多目标NAT中产生阳性信号，包括用于检测金黄色葡萄球菌(第一核酸)的存在的部分NAT和检测mecA(第二核酸)的存在的部分NAT。图6B-6C示出了使用上述多生物体对照物的方法的变化形式。

还存在本领域技术人员熟知的用于提供载有包含整个mecA基因或该基因的一部分的基因序列的生物体外基因物质的其他方法，包括但不限于从适当修饰的重组或天然病毒分离、从适当修饰的真核或真菌或古菌细胞分离、或化学或生物化学合成，以及以后开发的技术，可按照本公开的教导考虑使用这些方法来提供所需的核酸序列，作为扩增生物体对照物的一部分。在其他实施例中，所述全生物体对照物包括与源自经过修饰而包含mecA基因或该基因的一部分的生物体的核酸混合的金黄色葡萄球菌生物体。

在本文所述的方法的一些变化形式中，所添加的核酸是游离或可溶的，或者没有进一步的衍生或物理构建。

在其他实施例中，所添加的核酸具有一些附加的修饰，例如附着或结合至物理粒子或包含在粒子中。举例但非限制性地说，所述粒子可以是塑料、玻璃、金属、陶瓷、聚合化合物、脂质、蛋白质或由另一种材料或材料的组合构成的颗粒。所述附着可通过化学方法或非共价方法实现。在其他实施例中，所添加的核酸提供在一些非生物容器或基质内或遍及其中，包括但不限于脂质体或纳米载体、明胶、海藻酸钠、乙基纤维素、聚乙烯醇或其他能够容纳核酸的物质或容器。在其他实施例中，所述核酸可经过化学修饰，例如通过甲基化或通过与核酸结合蛋白结合，或通过引入硫代磷酸酯键、2’-O-甲基化、添加2’-氟碱基、反向dT或磷酸化、或任何其他修饰方法进行。本领域技术人员应理解，按照本文所述的方法(或通过已知的类似效果的方法或未知的相关方法)修饰核酸的一个优点是能够稳定核酸以使其在NAT中能被识别，或者以更易于在样品处理步骤中保留的形式提供核酸，所述样品处理步骤可构成与NAT结合的整体程序或过程或检测的一部分。

可构建所述扩增全生物体对照材料以在设计用于感测MRSA的多目标NAT中产生阳性信号，包括用于检测金黄色葡萄球菌(第一核酸)的存在的部分NAT和检测mecA(第二核酸)的存在的部分NAT。

根据多目标NAT中的具体限制，确定样品含有金黄色葡萄球菌和mecA，和/或确定样品表明MRSA的存在。所述方法不局限于两种生物体或性状，也可根据需要扩展到更多生物体或性状的组合，以产生用于NAT的对照材料。

虽然在上文中说明了一些示例性实施例的细节，但是应理解，可通过向未经修饰的金黄色葡萄球菌添加除了细菌、病毒或游离核酸之外的材料来构建针对MRSA的分子对照物。例如，可按照本发明的方法向金黄色葡萄球菌添加经过基因修饰的真核细胞、古菌或真菌，以产生分子对照物。

例5：人流感血清分型中的质量对照组合物(扩增全生物体对照物)

已经说明了人类流感病毒的高毒性和大流行株。对于这种疾病，NAT的开发者可能无法获得或处理这些株，例如，NAT的开发者可能无法按照生物安全规则和规定安全地操控这种生物材料。在这种情况下，流感病毒制剂具有较低毒力，但是混有包含外源毒力编码流感基因或其部分(例如源自对毒性形式的PB2蛋白进行编码的序列)的重组病毒，例如新城疫病毒(图7)。使用为了感测强毒流感而设计的多重NAT，可构建对照材料以在NAT中产生表征流感病毒(第一核酸)的存在的阳性信号和表征毒力编码PB2序列(第二核酸)的存在的阳性信号。

还考虑了所述方法的许多其他变化形式。例如，所述NAT可能在存在完全或部分地破裂的流感病毒的情况下执行。所述毒力序列可在任何有用的病毒媒介中提供，或者在非病毒媒介系统中提供，或者在完整质粒中提供，或者作为裸核苷酸提供。可在不同的NAT中对不同的毒力因子进行分析。

在另一些变化形式中，可按照所述方法在NAT中评估任何数量的强毒性人类病毒。

在另一些变化形式中，可按照本公开在NAT中评估非病毒病原体。

例6：用于动物健康应用的质量对照组合物(扩增全生物体对照物)

已经说明了动物病原体的强毒株。对于特定的动物疾病，NAT的开发者可能无法获得或处理这些株，例如，NAT的开发者可能无法按照生物安全规则和规定安全地操控这种生物材料。在这种情况下，可结合与病原体毒力因子对应的外源性核苷酸序列来提供给定病原体的无毒株，作为NAT对照物。

在一个示例中，无毒的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与含有外源BVDV毒力编码裂解NS23基因的重组杆状病毒混合。使用为了感测强毒性BVDV而设计的多重NAT，可构建对照材料以在NAT中产生表征BVDV(第一核酸)的存在的阳性信号和表征裂解NS23(第二核酸)的存在的阳性信号。

还考虑了所述方法的其他变化形式。例如，NAT可能在存在完全或部分地破裂的BVDV的情况下执行。在其他实施例中，裂解NS23基因可在除杆状病毒之外的病毒媒介中提供，或者在非病毒媒介系统中提供，或者作为完整质粒或裸核苷酸提供。

在另一些实施例中，可在本发明的NAT中评估任何毒性病毒，例如仙台病毒、口蹄疫病毒(FMDV)、东方马脑炎(EEE)或鸡流感。

在另一些实施例中，可按照本发明在NAT中评估非病毒病原体。

在其他实施例中，可在本发明的NAT中评估人类和动物病原体。

例7：用于评价针对关键疾病基因的NAT的功能的质量对照组合物(扩增全生物体对照物)

在许多由基因决定的人类疾病中，囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因的多种变体之一决定的。将包括全生物体对照物的单种扩增分子对照物用于NAT，以感测CFTR在人类细胞中的存在。

例如，所述全生物体对照物包括含有提供对于MRC-5非天然存在的特征(例如CFTR基因的变体)的核酸的MRC-5细胞。通过CRISPR-Cas9、病毒转导或使用本领域技术人员已知的其他常规分子生物学方法对MRC-5进行基因修饰，以使其包含CFTR基因变体或该基因变体的一部分。修饰后的全生物体对照物随后在NAT中用作扩增分子对照物。MRC-5的直接基因修饰可通过多种手段之中的任何一种来实现(包括本文所述的方法)，也可通过为此目的而开发的新方法来实现，可考虑使用其遗传修饰产物构建本文所述的对照物。

MRC-5不是永生细胞系，在某些情况下，使用永生化细胞系能有利地实现永生化细胞系的基因修饰和/或繁殖和保存。任何适于此目的的人类细胞系都可替代MRC-5，无论其是否经过永生化。

或者，所述全生物体对照物包括非人类细胞，例如酵母细胞(例如酿酒酵母)，该细胞包含提供在非人类细胞中非天然存在的一个或多个特征的两个核酸序列。可使用本领域技术人员已知的分子生物学方法对所述非人类细胞进行基因修饰，以使其包含来自人类基因组的外源核酸序列以及CFTR基因变体或该基因变体的一部分。然后使用经过修饰后的全生物体对照物作为多目标NAT中的扩增分子对照物，该目标NAT通常感测这两个序列以确定CFTR基因的存在和第二个人类遗传序列的存在(CFTR的多目标NAT)。

本领域的技术人员应理解，使用在本文中说明的方法可为CFTR的多目标NAT构建多生物体对照物，其中一种生物体是包含在NAT中感测的序列的人类细胞或其他生物体，可将该序列作为NAT的一个部分来感测，以确认人类DNA的存在；第二种生物体是包含来自CFTR基因变体的核酸序列的一部分的人类细胞或其他生物体。

在上述的每种情况下，可构建全生物体对照物以在设计用于感测CFTR的NAT中产生阳性信号，包括用于检测人类细胞(第一核酸序列)的存在的部分NAT和检测CFTR变种(第二核酸序列)的存在的部分NAT。确定样品含有人类细胞和CFTR，和/或确定样品表明CFTR在人类细胞中的存在。

例8：组合应用的NAT质量对照组合物：

用于NAT和免疫测定的多功能扩增全生物体对照物

已经说明了动物病原体的高毒株。对于特定的动物疾病，检测试验的开发者可能无法获得或处理这些株，例如，NAT的开发者可能无法按照生物安全规则和规定安全地操控这种生物材料。它们也可能不可用，或者在免疫测定形式中没有用。在这种情况下，可结合与病原体毒力因子对应的外源提供且表达的核苷酸序列来提供给定病原体的无毒株，作为对照物。可将没有这种高病毒因子的病原体指定为正常病原体。

在一个实施例中，包含核酸序列‘X’的正常病毒与含有毒力因子编码基因的表达元件‘Y’的重组细菌混合。使用为了感测病毒和毒力因子或其部分的存在而设计的多重NAT，可构建对照材料以在NAT中产生表征X(第一核酸)的存在的阳性信号和表征Y(第二核酸)的存在的阳性信号。使用同一种全生物体对照物可进行同期的免疫测定来感测Y的表达蛋白产物(图8和图9)。

还考虑了所述方法的其他变化形式。例如，NAT可能在存在完全或部分地破裂的X的情况下执行。在其他实施例中，Y基因可在除了细菌之外的多种媒介中提供，或者作为裸核苷酸提供。

在另一种变化形式中，可检测包括单个全生物体和表达至少一个表征该生物体的特征的核酸序列的单种配方的全生物体对照物，以用于NAT和免疫测定。

在所述方法的另一些变化形式中，可根据本发明评价任何强病毒或非病毒病原体。

在所述方法的其他变化形式中，可根据本发明评价人类以及动物病原体。

在其他实施例中，其他基于表达的检测(包括但不限于通过核酸适体技术进行的沉淀)可代替如本发明所述的免疫测定。

虽然在上文中为了清楚和便于理解的目的对本发明进行了一些详细的说明，但是通过阅读本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离所附权利要求中的本发明的实际范围的情况下，可在形式和细节上做出各种修改、变化和改变。

在本说明书中提及的所有文献、专利和专利申请均通过整体引用结合到本说明书中，如同各个文献、专利或专利申请被具体并单独地指明通过整体引用结合在此一样。