一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法

摘要

本发明公开了一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法，包括以下步骤：步骤一，设计；步骤二，制备；步骤三，优化；其中在上述步骤一中，设计不同浓度植物激素，优化愈伤组织分化培养基，暗培养后为获得高效诱导愈伤组织，通过调整不同TDZ激素的浓度，选出出芽率最高的最适WPM愈伤组织诱导培养基；光培养，约15d继代一次，最后观察生长状况并统计出芽率；该发明，在传统杨树再生体系的基础上，筛选了相应激素浓度，优化了其再生体系，并根据生长情况，增添了把成熟的鱼雷胚状体专门挑出培养这一操作手法，实现了对杨树高效的不定芽培育；同时设计不同浓度梯度的TDZ进行测试，得出浓度为0.02mg/L的TDZ为最适工作浓度，更具有高效性和实用性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物种植技术领域，具体为一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法。

背景技术

植物组织培养是运用细胞再生原理，对植物细胞、组织等进行离体培养的技术。组织培养是快速扩繁的基本手段之一，也是基因功能研究和转基因的重要基础。Parson等在1986年首次证实杨树可以进行遗传转化和表达外源基因，随后杨树组织培养基技术日趋成熟，其基因工程进展也成为研究热点。

杨树是我国重要的造林树种，由于它适应性强、速生、材质好而成为我国最为主要的短周期速生丰产工业用材林树种，在生态环境治理和解决木材短缺等方面占有重要位置。杨树具有基因组构成精简、核基因组相对较小、生长周期短、易于无性繁殖、遗传转化容易等优点，又是根癌农杆菌的天然宿主，因此成为公认的木本植物生物学基础研究的模式树种。无性系84K(Populus alba×Populus glandulosa)杨树为最新一代白杨派杨树新品种。生根容易、苗期与幼树生长快、材质好、抗风能力及抗性强、适应性广。在改善生态和城市绿化上，发挥着重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法，包括以下步骤：步骤一，设计；步骤二，制备；步骤三，优化；

其中在上述步骤一中，设计不同浓度植物激素，优化愈伤组织分化培养基，暗培养后为获得高效诱导愈伤组织，通过调整不同TDZ激素的浓度，选出出芽率最高的最适WPM愈伤组织诱导培养基；光培养，约15d继代一次，最后观察生长状况并统计出芽率；

其中在上述步骤二中，选取一定量的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水备用，然后将选取的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水混合制备得到WPM；

其中在上述步骤三中，出芽后对其进行操作手法的优化，在分化培养基上轻轻拣出类似鱼雷性状的胚状体，尖朝上底朝下移至生根培养基中，在光照培养环境中诱导其生根，分化培养基为步骤二中得到的WPM，且分化培养基中加入了不同浓度TDZ，生根培养基为步骤二中得到的WPM，在分化培养基中长出鱼雷性质的胚状体后轻轻地用镊子将其夹出置于生根培养基，避免胚状体在愈伤组织上推积出现玻璃化现象，从而达到提高不定芽的成苗率，形成高效的再生体系。

根据上述技术方案，所述步骤二中，WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水的重量比为2.58∶0.1∶20∶0.5∶0.65∶7.8∶1000。

根据上述技术方案，所述步骤三中，光照培养环境温度为23-25℃，时间为16/8h。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：该发明，在传统杨树再生体系的基础上，筛选了相应激素浓度，优化了其再生体系，并根据生长情况，增添了把成熟的鱼雷胚状体专门挑出培养这一操作手法，实现了对杨树高效的不定芽培育；同时设计不同浓度梯度的TDZ，经过筛选获得不同出芽率的愈伤组织，与其他植物激素和浓度比较，进而得出浓度为0.02mg/L的TDZ为最适工作浓度，更具有高效性和实用性，对杨树再生体系及后续遗传转化工作开展意义重大，同时改进了愈伤组织出芽后的操作流程，既提高了不定芽的存活率，又节约了实验时间，进一步提高了杨树再生体系过程中应用的效率。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的方法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明提供一种技术方案：

实施例1：

一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法，包括以下步骤：步骤一，设计；步骤二，制备；步骤三，优化；

其中在上述步骤一中，设计不同浓度植物激素，优化愈伤组织分化培养基，暗培养后为获得高效诱导愈伤组织，通过调整不同TDZ激素的浓度，选出出芽率最高的最适WPM愈伤组织诱导培养基；光培养，约15d继代一次，最后观察生长状况并统计出芽率；

其中在上述步骤二中，选取一定量的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水备用，然后将选取的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水混合制备得到WPM，其中WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水的重量比为2.58∶0.1∶20∶0.5∶0.65∶7.8∶1000；

其中在上述步骤三中，出芽后对其进行操作手法的优化，在分化培养基上轻轻拣出类似鱼雷性状的胚状体，尖朝上底朝下移至生根培养基中，在光照培养环境中诱导其生根，其中光照培养环境温度为23-25℃，时间为16/8h，分化培养基为步骤二中得到的WPM，且分化培养基中加入了0.01mg/L浓度的TDZ，生根培养基为步骤二中得到的WPM，在分化培养基中长出鱼雷性质的胚状体后轻轻地用镊子将其夹出置于生根培养基，避免胚状体在愈伤组织上推积出现玻璃化现象，从而达到提高不定芽的成苗率，形成高效的再生体系。

实施例2：

一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法，包括以下步骤：步骤一，设计；步骤二，制备；步骤三，优化；

其中在上述步骤一中，设计不同浓度植物激素，优化愈伤组织分化培养基，暗培养后为获得高效诱导愈伤组织，通过调整不同TDZ激素的浓度，选出出芽率最高的最适WPM愈伤组织诱导培养基；光培养，约15d继代一次，最后观察生长状况并统计出芽率；

其中在上述步骤二中，选取一定量的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水备用，然后将选取的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水混合制备得到WPM，其中WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水的重量比为2.58∶0.1∶20∶0.5∶0.65∶7.8∶1000；

其中在上述步骤三中，出芽后对其进行操作手法的优化，在分化培养基上轻轻拣出类似鱼雷性状的胚状体，尖朝上底朝下移至生根培养基中，在光照培养环境中诱导其生根，其中光照培养环境温度为23-25℃，时间为16/8h，分化培养基为步骤二中得到的WPM，且分化培养基中加入了0.02mg/L浓度的TDZ，生根培养基为步骤二中得到的WPM，在分化培养基中长出鱼雷性质的胚状体后轻轻地用镊子将其夹出置于生根培养基，避免胚状体在愈伤组织上推积出现玻璃化现象，从而达到提高不定芽的成苗率，形成高效的再生体系。

实施例3：

一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法，包括以下步骤：步骤一，设计；步骤二，制备；步骤三，优化；

其中在上述步骤一中，设计不同浓度植物激素，优化愈伤组织分化培养基，暗培养后为获得高效诱导愈伤组织，通过调整不同TDZ激素的浓度，选出出芽率最高的最适WPM愈伤组织诱导培养基；光培养，约15d继代一次，最后观察生长状况并统计出芽率；

其中在上述步骤二中，选取一定量的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水备用，然后将选取的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水混合制备得到WPM，其中WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水的重量比为2.58∶0.1∶20∶0.5∶0.65∶7.8∶1000；

其中在上述步骤三中，出芽后对其进行操作手法的优化，在分化培养基上轻轻拣出类似鱼雷性状的胚状体，尖朝上底朝下移至生根培养基中，在光照培养环境中诱导其生根，其中光照培养环境温度为23-25℃，时间为16/8h，分化培养基为步骤二中得到的WPM，且分化培养基中加入了0.03mg/L浓度的TDZ，生根培养基为步骤二中得到的WPM，在分化培养基中长出鱼雷性质的胚状体后轻轻地用镊子将其夹出置于生根培养基，避免胚状体在愈伤组织上推积出现玻璃化现象，从而达到提高不定芽的成苗率，形成高效的再生体系。

对比例：

一种杨树愈伤组织出芽再生体系的优化方法，包括以下步骤：步骤一，设计；步骤二，制备；步骤三，优化；

其中在上述步骤一中，设计不同浓度植物激素，优化愈伤组织分化培养基，暗培养后为获得高效诱导愈伤组织，通过调整不同TDZ激素的浓度，选出出芽率最高的最适WPM愈伤组织诱导培养基；光培养，约15d继代一次，最后观察生长状况并统计出芽率；

其中在上述步骤二中，选取一定量的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水备用，然后将选取的WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水混合制备得到WPM，其中WPM粉、肌醇、蔗糖、MES、葡萄糖酸钙、琼脂和水的重量比为2.58∶0.1∶20∶0.5∶0.65∶7.8∶1000；

其中在上述步骤三中，出芽后对其进行操作手法的优化，在分化培养基上轻轻拣出类似鱼雷性状的胚状体，尖朝上底朝下移至生根培养基中，在光照培养环境中诱导其生根，其中光照培养环境温度为23-25℃，时间为16/8h，分化培养基为步骤二中得到的WPM，且分化培养基中未加入TDZ，生根培养基为步骤二中得到的WPM，在分化培养基中长出鱼雷性质的胚状体后轻轻地用镊子将其夹出置于生根培养基，避免胚状体在愈伤组织上推积出现玻璃化现象，从而达到提高不定芽的成苗率，形成高效的再生体系。

将上述实施例以及对比例中愈伤组织的生长状况和出芽率进行统计，所得结果如下表：

基于上述，本发明的优点在于，本发明，该发明通过设计不同浓度梯度的TDZ，随后在传统杨树再生体系的基础上，筛选了相应激素浓度，优化了其再生体系，并根据生长情况，增添了把成熟的鱼雷胚状体专门挑出培养这一操作手法，实现了对杨树高效的不定芽培育经过筛选获得不同出芽率的愈伤组织，同时得出浓度为0.02mg/L的TDZ为最适工作浓度，更具有高效性和实用性，对杨树再生体系及后续遗传转化工作开展意义重大，同时改进了愈伤组织出芽后的操作流程，从而避免了由于在操作的过程中降低了不定芽的存活率，又节约了实验时间，进一步提高了杨树再生体系过程中应用的效率。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。