一种地方土鸡线粒体COI基因的扩增引物

摘要

本发明公开了一种地方土鸡线粒体COI基因的扩增引物，属于COI基因扩增引物领域领域，该引物序列为：COI‑F：5’‑CTTTAGCCGGCAACCTAGCC‑3’，COI‑R：5’‑GACGTGCCTCCTTGTTAATT‑3’。本发明筛选出一对用于扩增地方土鸡线粒体部分COI序列的引物COI‑F和COI‑R，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明该引物具特异性好的特点，能够满足地方土鸡遗传多样性研究的需要,也能为种质资源保护、开发和利用提供可靠的分子技术指导。

说明书

技术领域

本发明涉及扩增引物领域，具体涉及一种地方土鸡线粒体COI基因的扩增引物。

背景技术

鸡是最受欢迎和传播最广泛的家禽品种之一，它为世界各地的人类提供了大量的动物蛋白(肉和蛋)。此外，鸡在社会文化和生物医学研究中也发挥着重要作用。地方土鸡是一种宝贵的遗传资源，它们对当地环境的高度适应性使它们能够很好地生存。

由于世界范围内的选择和驯化，地方土鸡具有很大的遗传多样性。物种内部的遗传多样性可以提高对恶劣环境的适应能力和对疾病的抵抗力。毫无疑问，减少地方土鸡的遗传多样性是一种宝贵的遗传资源的损失。地方土鸡种群也可以增加其他土鸡以及纯种商业鸡品种的现有遗传多样性。由于使用了高产的商业鸡品种，一些地方土鸡品种的遗传多样性已经减少，因此，需要加强对地方土鸡遗传多样性的保护。

线粒体脱氧核糖核酸(Mitochondrial DNA，即mtDNA)由染色体外小DNA组成，具有母体遗传、结构简单、组织保守、基因组体积小、突变率高的特点。由于这些特点，线粒体基因可作为重要的分子标记用于生物分子种群遗传学和分子系统学的研究。其中，COI基因被广泛的应用于遗传多样性，系统发育，分类鉴别和母系起源等研究。但是到目前为止，地方土鸡的COI基因还没有广泛使用且特异性较好的通用引物。因此，筛选特异性较好的COI基因引物能够对地方土鸡的遗传多样性评估和种质资源的保护与利用提供技术条件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地方土鸡线粒体COI基因的扩增引物，其可以解决上述背景技术中提出的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种地方土鸡线粒体COI基因的扩增引物，该引物序列为：

COI-F：5’-CTTTAGCCGGCAACCTAGCC-3’，

COI-R：5’-GACGTGCCTCCTTGTTAATT-3’。

优选地，一种所述的地方土鸡线粒体COI基因的扩增引物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)登陆NCBI，下载已有的地方土鸡线粒体COI序列；

(2)将下载的序列比对分析，确定序列两端保守区域；

(3)在确定的保守区域用引物设计软件设计多对引物，并进行合成；

(4)将地方土鸡血液提取DNA，然后分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况；

(5)进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带明亮且单一的一对引物COI-F和COI-R:

COI-F：5’-CTTTAGCCGGCAACCTAGCC-3’，

COI-R：5’-GACGTGCCTCCTTGTTAATT-3’。

优选地，所述步骤(1)中，登陆NCBI下载已有的地方土鸡线粒体COI序列。

优选地，所述步骤(2)中，将下载的序列用DNAMAN 8.0软件比对分析。

优选地，所述步骤(3)中，引物设计软件为Primer Premier 5。

优选地，所述步骤(4)中，反应体系为2×PCR Master Mix 15μL，10μmol·L

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明筛选出一对用于扩增地方土鸡线粒体部分COI序列的引物COI-F和COI-R，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明该引物具特异性好的特点，能够满足地方土鸡遗传多样性研究的需要。

附图说明

图1为本发明实施例PCR扩增获得地方土鸡线粒体COI基因片段的电泳图，其中，S1和S2代表2个地方土鸡样本，Marker为分子量标准；

图2为本发明实施例PCR扩增获得地方土鸡线粒体COI基因片段测序后获得的部分代表性序列，其中，1至19代表19个不同的序列，序列间相同碱基采用小圆点表示，每段序列末尾的数字代表那一行结尾时序列中含总碱基的个数，图2示出的序列长度是567bp。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种地方土鸡线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)登录NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下载已有的15条地方土鸡线粒体COI序列(GenBank登录号为：CM008858，KX987152，KP269069，KJ778617，MG605671，GU261710-GU261719)；

(2)用序列处理软件DNAMAN 8.0对上述序列进行多重比对分析，确定出前后端的保守的区域；

(3)经比对后，在前后端各100个碱基对的较保守区域内，用引物设计软件PrimerPremier 5设计引物，设计的多对引物交由南京擎科生物技术有限公司合成；

(4)用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒对采自40只淮北麻鸡的血液进行DNA提取，经琼脂糖检测DNA完整性好且无明显降解，-20℃保存备用；

在30μL PCR反应体系中用合成的多对引物分别扩增40个淮北麻鸡个体的COI基因片段，该体系为：2×PCR Master Mix 15μL，10μmol·L

(5)扩增出的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一且明亮的一对引物COI-F和COI-R。该引物的COI基因扩增产物片段长度为567bp，40个样品全部成功扩增。

扩增好的样本送至南京擎科生物技术有限公司进行双向测序。测序所得序列用ContigExpress软件拼接，与已有的15条地方土鸡COI序列进行多重比对分析，确定所得序列为地方土鸡线粒体COI基因序列：

COI-F：5’-CTTTAGCCGGCAACCTAGCC-3’，

COI-R：5’-GACGTGCCTCCTTGTTAATT-3’。

以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种地方土鸡线粒体COI基因的扩增引物

<130> NO

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ctttagccgg caacctagcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gacgtgcctc cttgttaatt 20

<210> 3

<211> 567

<212> DNA

<213> 地方土鸡(Gallus gallus domesticus)

<400> 3

ggttgctagt cagctgaaga ctttaatacc agttgggatg gcgatgatta ttgtggctga 60

tgtaaagtag gctcgggtgt ctacgtccat tccgactgtg aatatatggt gggctcatac 120

aatgaagcca aggaatccga ttgacagtat ggctccgact attcctatgt atccgaatgg 180

ttcttttttt cctgcatagt atgctactac gtgggaaatt attccgaaac ctgggaggat 240

gaggatgtaa acttcggggt gaccgaagaa tcagaatagg tgttggtata ggattgggtc 300

tcctcctcca gctgggtcga agaatgtggt gttaaggttg cggtcggtaa gtagtatggt 360

aatcccagct gctaggacgg gtaaggagag gagtagtagg atggcagtaa tgaggacaga 420

tcatacgaat aggggtgttt ggtattgtga cagtgcgggg ggttttatgt tgatgatggt 480

agtgataaag ttgatggctc ctagaatgga ggaaacacct gctaagtgta atgaaaagat 540

ggctaggtct actgatgcgc cagcgtg 567