用于稳定纯化的苗勒氏管抑制物质(MIS)的储存溶液组合物和与其相关的使用和生产方法

摘要

一种或多种改进的苗勒氏管抑制物质储存缓冲液组合物和一种或多种在所述改进的储存缓冲液组合物中稳定苗勒氏管抑制物质的方法的非限制性实施方案。

说明书

相关申请的交叉引用

不适用。

关于联邦资助的研究或开发的声明

不适用。

技术领域

目前公开和请求保护的一个或多个发明构思涉及增加用于进行至少一种诊断测定的一种或多种组分和/或一种或多种试剂的稳定性和/或保质期的一种或多种组合物、一种或多种试剂盒和一种或多种方法。更具体地，目前公开和请求保护的一个或多个发明构思涉及稳定和增加纯化的苗勒氏管抑制物质(MIS)的保质期的储存缓冲溶液以及与其相关的试剂盒和使用和生产方法的非限制性实施方案。

背景

苗勒氏管抑制物质(MIS)/抗苗勒氏管激素(AMH)是一种不稳定的二聚糖蛋白，并且由于其羧基-末端氨基酸同源性，MIS是糖蛋白的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，其参与调节生长和分化，包括例如抑制卵母细胞减数分裂和肺表面活性物质(lungsurfactant)。MIS是一种性腺激素，其负责在雄性胚胎发生期间中肾旁管/苗勒氏管(胎儿泌尿生殖嵴中的雌性生殖道的间叶原基(anlagen))的退化。MIS也已被用作某些生物疾病和/或病况的临床和/或诊断试剂和/或生物标志物，包括但不限于一般生育能力评价，预测体外受精程序成功可能性，诊断某些癌症(诸如，通过实例的方式，卵巢癌和子宫癌)，检测多囊卵巢综合征，避孕和/或治疗子宫内膜异位和/或子宫腺肌症。

与许多TGF-β蛋白的情况一样，MIS作为二聚前体产生，并且经历翻译后加工以用于激活，需要切割和解离以释放生物活性的C-末端片段。一旦经由本领域中通常已知的方法(包括但不限于亲和纯化和/或离子交换方法)纯化，纯化的MIS就非常倾向且易于被蛋白水解酶切割和降解，由此导致纯化的MIS的保质期缩短和生物活性损失。

因此，需要改进的组合物，诸如，仅通过实例的方式，改进的储存缓冲液，以及方法，其增加纯化的MIS的保质期以及稳定和实质上减轻纯化的MIS的生物活性损失。目前公开和请求保护的一个或多个发明构思涉及此类组合物和方法以及与其相关的试剂盒。

附图的几个视图的描述

图1A-1E是这样的图表，其显示根据目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思，对于范围为约0.15 ng/mL至约33.50 ng/mL的MIS初始浓度(在第0天)，MIS经六十(60)天时段的生物活性。

图2是用于提取、纯化MIS、在根据目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思构建的储存缓冲液中储存和稳定纯化的MIS的方法的非限制性实施方案的框式图。

详细描述

在通过示例性附图、实验、结果和实验室程序的方式详细解释一个或多个发明构思的至少一个实施方案之前，应理解，所述一个或多个发明构思不限于将其应用于下面的描述中阐述的或所述附图、实验和/或结果中举例说明的组分的构造和排列的细节。所述一个或多个发明构思能够具有其他实施方案，或者能够以各种方式实践或实施。因此，本文使用的语言意欲被给予最广泛的可能范围和含义；并且实施方案意味着是示例性的—而非穷举性的。而且，应该理解，本文采用的措辞和术语是为了描述的目的，并且不应被认为是限制性的。

除非本文另有定义，否则结合目前公开和请求保护的一个或多个发明构思使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。前述技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法、并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述而实施。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学结合利用的命名及其实验室程序和技术是本领域中众所周知和通常使用的那些。

本说明书中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物指示这种目前公开和请求保护的一个或多个发明构思所属领域的技术人员的技术水平。在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物在本文中明确地通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的专利或出版物被具体和单独地指出通过引用并入一样。

鉴于本公开，无需过度实验即可制备和执行本文公开和请求保护的所有装置、试剂盒和/或方法。尽管已经在优选实施方案的方面描述了这种目前公开和请求保护的一个或多个发明构思的组合物和方法，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离这种目前公开和请求保护的一个或多个发明构思的构思、精神和范围的情况下，可对所述组合物和/或方法、以及在本文描述的方法的步骤或步骤顺序中应用变化。认为对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改在如所附权利要求限定的一个或多个发明构思的精神、范围和构思内。

如根据本公开所利用，除非另有指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：

与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，词语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可意味着“一个/种(one)”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，对“一个/种化合物”的提及可指1个/种或多个/种、2个/种或更多个/种、3个/种或更多个/种、4个/种或更多个/种或更大数目的化合物。术语“多个/种”是指“两个/种或更多个/种”。除非明确指出仅指替代方案或替代方案是互相排斥的，否则权利要求中的术语“或”的使用用于指“和/或”，尽管本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。在整个申请中，术语“约”用于指示，值包括用于测定该值的装置、方法的误差的固有变化，或研究对象间存在的变化。例如，但不限于，当利用术语“约”时，指定值可以与列举值相差± 20%或± 10%，或± 5%，或± 1%，或±0.1%，因为此类变化适用于执行公开的方法并由本领域普通技术人员所理解。术语“至少一个/种”的使用将被理解为包括一个/种以及多于一个/种的任何数量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100个/种等。术语“至少一个/种”可延伸多至100或1000或更多个/种，这取决于它所附接的术语；此外，100/1000的数量不视为限制性的，因为更高的限值也可产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z中的至少一个/种”的使用将被理解为包括单独的X，单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。序数术语(即，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅用于区分两个或更多个事项的目的，并且不意味着暗示例如一个事项相对于另一事项的任何顺序或次序或重要性、或任何添加次序。

如在本说明书和一个或多个权利要求中所用，术语“包含(comprising)”(和任何形式的包含，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。

如本文所用，术语“或其组合”是指所述术语之前列出的事项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意欲包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果次序在特定上下文中是重要的，则也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个事项或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解，除非从上下文另外可见，否则通常对任何组合中的事项或术语的数量没有限制。

如本文所用，术语“实质上(substantially)”意味着随后描述的事件或情况完全发生或者随后描述的事件或情况在大范围或程度上发生。例如，术语“实质上”意味着随后描述的事件或情况发生在至少90%的时间、或至少95%的时间或至少98%的时间。

如本文所用，短语“与…缔合(associated with)”包括两个部分彼此直接缔合以及两个部分彼此间接缔合二者。缔合的非限制性实例包括通过直接的键或通过间隔基团将一个部分与另一个部分共价结合，直接或借助与所述部分结合的特异性结合对成员将一个部分与另一个部分非共价结合，诸如通过将一个部分溶解在另一个部分中或通过合成而将一个部分掺入另一个部分，和将一个部分涂覆在另一个部分上。

术语“患者”包括人和兽医对象。在某些实施方案中，患者是哺乳动物。在某些其他实施方案中，患者是人。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人，家养和农场动物，非人灵长类动物以及动物园、运动或玩赏动物，诸如狗、马、猫，牛等。

现在转向具体实施方案，目前公开和请求保护的一个或多个发明构思涉及包含MIS储存缓冲液和/或由其组成的一种或多种组合物，以及与之相关的稳定MIS的一种或多种方法。更具体地，目前公开和请求保护的一个或多个发明构思涉及一种或多种增加纯化的MIS的保质期的MIS储存缓冲液组合物以及一种或多种稳定和减轻所述储存缓冲液内含有的纯化的MIS的生物活性损失的方法的非限制性实施方案。

考虑实际上在生物学、化学或生物化学分析和测定领域中使用的任何试剂都可以用于目前请求保护和公开的一个或多个发明构思的装置、试剂盒和方法中。考虑这些试剂当与目标分析物结合时可以经历物理和/或化学变化，由此由试剂-分析物复合物生成的信号的强度、性质、频率或类型与流体样品内存在的分析物的浓度成正比或成反比。这些试剂可以含有指示剂染料、金属、酶、聚合物、抗体以及电化学反应性成分和/或化学品，当与一种或多种目标分析物反应时，它们可能表现出颜色变化。

检测和测量其中的分析物的任何方法都可以用于目前请求保护的和创造性构思的装置、试剂盒和方法中。用于检测分析物的多种测定是本领域中众所周知的，并且包括但不限于化学测定、酶抑制测定、抗体染色、乳胶凝集、乳胶凝集抑制和免疫测定，诸如放射免疫测定。本文的术语“抗体”以最广义使用，并且是指例如完整的单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，并且是指表现出期望的生物学活性(例如，抗原/分析物-结合)的抗体片段。所述抗体可以是任何类型或类别的(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。

可以开发测定，包括但不限于免疫测定、核酸捕获测定、基于脂质的测定和基于血清学的测定，用于液体测试样品内可能含有的蛋白、肽和核酸的多重组，此类蛋白和肽包括例如但不限于白蛋白、微量白蛋白、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、α-1-微球蛋白、免疫球蛋白、酶、蛋白、糖蛋白、蛋白酶抑制剂、药物、细胞因子、肌酐、和葡萄糖。

在目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思中可以使用任何生物和/或化学纯化的方法。例如，仅通过实例的方式，当待纯化的化合物是至少一种蛋白时，可以在提取之后经由尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)、离子交换色谱法、自由流电泳、亲和色谱法、免疫亲和色谱法、金属结合技术、高效液相色谱法(HPLC)及其组合纯化至少一种蛋白。

在一个非限制性实施方案中，目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思涉及保持MIS的生物活性的新的和改进的储存缓冲液组合物。

在一个非限制性实施方案中，所述改进的储存缓冲液包含以下和/或由以下组成：无蛋白酶的牛血清白蛋白(BSA)、至少一种糖醇、明胶和至少一种表面活性剂。

在另一个非限制性实施方案中，所述改进的储存缓冲液包含以下和/或由以下组成：一定体积和/或浓度的去离子水，至少一种缓冲剂，至少一种盐，至少一种糖醇，明胶，至少一种表面活性剂，无蛋白酶的BSA，和至少一种杀生物剂。

所述至少一种缓冲剂可以包含以下，由以下组成或选自以下：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，[三(羟甲基)甲基氨基]丙磺酸(TAPS)缓冲液，2-(双(2-(羟乙基)氨基)乙酸(bicine)缓冲液，三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液，3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(tricine)缓冲液，2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)缓冲液，3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液，哌嗪-N-N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液，二甲基砷酸(甲次砷酸盐)，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)缓冲液，柠檬酸缓冲液，乙酸缓冲液，磷酸二氢钾缓冲液，硼酸盐缓冲液及其组合。在目前公开的一个或多个发明构思的一个非限制性实施方案中，所述至少一种缓冲剂是浓度为约50 mM的HEPES缓冲液。

所述至少一种盐可以是本领域中通常已知的任何盐，包括但不限于由碱和酸、金属和酸、金属和非金属、碱和酸酐、酸和碱酐(base anhydride)的化学反应、两种或多种盐的溶解和重组及其组合形成的任何盐。在目前公开的一个或多个发明构思的一个非限制性实施方案中，所述至少一种盐是浓度为约150 mM的氯化钠。

在目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思的一个非限制性实施方案中，所述明胶是纯化的液体明胶，例如，仅通过实例的方式，浓度为约6克/升的由NorlandProducts, Inc.商业提供用于销售的HiPure Liquid Gelatin。

所述至少一种糖醇可以包含以下，由以下组成或选自以下：乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、肌醇、庚七醇(volemitol)、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇、聚葡糖醇(polyglycitol)、氢化淀粉水解物及其组合。在目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思的一个非限制性实施方案中，所述至少一种糖醇是浓度为约50克/升的甘露糖醇。

所述至少一种表面活性剂可以包含以下，由以下组成或选自以下：一种或多种阴离子表面活性剂、一种或多种非离子表面活性剂、一种或多种阳离子表面活性剂、一种或多种两性表面活性剂、一种或多种两性离子表面活性剂及其组合。在目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思的一个非限制性实施方案中，所述至少一种表面活性剂是浓度为约1.1克/升的聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(由Millipore Sigma作为Tween® 20商业销售)。

所述至少一种杀生物剂可以包含任何物质或物质的组合，由任何物质或物质的组合组成，或选自任何物质或物质的组合，所述物质包括但不限于：防腐剂、抗微生物剂(包括但不限于杀菌剂、抗生素、抗细菌剂(包括杀细菌剂)、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂和/或抗寄生虫剂)、防污剂、消毒剂和/或农药(包括但不限于杀真菌剂、除草剂、杀昆虫剂、杀藻剂、杀软体动物剂、杀螨剂和/或灭鼠剂)，其用于控制对人和/或动物健康有害和/或引起对天然或制造产品的损害的生物体。如本文所用的杀生物剂可以呈任何形式，包括但不限于水性的(即，流体)或固体的(即，粉末)。在目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思的一个非限制性实施方案中，所述至少一种杀生物剂是浓度为约2毫升/升的溴-硝基-二氧杂环己烷和甲基异噻唑啉酮(MIT)的乙醇溶液(由Roche Diagnostics作为Micr-O-protect商业销售)。

根据目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思构建的改进的MIS储存缓冲液组合物的一个非限制性实施方案显示于下文表1中。

表1：MIS储存缓冲液组合物的非限制性实施方案。

一旦构成，就将MIS储存缓冲液的pH调节至中性(约7.5)。另外，可以对储存缓冲液进行过滤(例如，仅通过实例的方式，通过0.2微米过滤器)，以从所述储存缓冲液过滤掉任何颗粒物质。然后将所述缓冲液储存在范围为约2℃至约8℃的温度以供使用。

现在参考图1A-1E，其中显示了这样的图表，其显示对于范围为约0.15 ng/mL至约33.50 ng/mL的MIS初始浓度(在第0天)，MIS在范围为约2℃至约8℃的温度下经六十(60)天时段的生物活性和保质期，其中MIS被包含在根据目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思构建的改进的储存缓冲液内。从这些图可以看出，不管MIS的初始浓度如何，当储存在所述储存缓冲液中时，每种样品在第60天的MIS浓度仅降低约10%(或者甚至更少)。所述储存缓冲液的至少一种糖醇(诸如，通过实例的方式，甘露糖醇)组分通过防止/减轻导致MIS激活的蛋白水解切割来稳定MIS，由此不仅增加MIS的保质期，而且增加其用作诊断试剂的生物活性。

现在参考图2，其中显示了提取、纯化MIS、在根据目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思构建的储存缓冲液中储存和稳定纯化的MIS的方法的框式图。如步骤10中所示，从哺乳动物睾丸(包括，仅通过实例的方式，牛小牛睾丸)提取MIS(经由本领域中通常已知的方法)。在提取后，通过本领域中通常已知的任何方法(包括但不限于通过经由利用例如与琼脂糖偶联的MIS单克隆抗体对MIS进行亲和纯化)纯化提取的MIS(如步骤20中所示)。一旦提取的MIS与特定的纯化剂结合并与之缔合，则通过至少一种洗脱缓冲液(例如，通过实例的方式(且如步骤30中所示)，用pH中性的温和洗脱缓冲液)洗脱MIS。在洗脱后，通过本领域中通常已知的方法浓缩纯化的MIS，并且将洗脱缓冲液与根据目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思构建的储存缓冲液进行交换(如步骤40中所示)，缓冲液交换经由本领域中通常已知的方法(包括但不限于sephadex G-25方法)完成。如步骤50中所示，然后将纯化和浓缩的MIS在范围为约2℃至约8℃的温度下储存在所述储存缓冲液中。

一个或多个发明构思的非限制性实例

苗勒氏管抑制物质储存缓冲液组合物，其包含：去离子水；至少一种缓冲剂；至少一种盐；至少一种糖醇；明胶；至少一种表面活性剂；无蛋白酶的牛血清白蛋白；和至少一种杀生物剂。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种缓冲剂选自：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液，[三(羟甲基)甲基氨基]丙磺酸缓冲液，2-(双(2-(羟乙基)氨基)乙酸(bicine)缓冲液，三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液，3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸缓冲液，2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸缓冲液，3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液，哌嗪-N-N’-双(2-乙磺酸)缓冲液，二甲基砷酸，2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，N-环己基-2-氨基乙磺酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，乙酸缓冲液，磷酸二氢钾缓冲液，硼酸盐缓冲液及其组合。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液。

所述储存缓冲液组合物，其中所述4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液占约50 mM的浓度。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种盐是氯化钠。

所述储存缓冲液组合物，其中所述氯化钠占约150 mM的浓度。

所述储存缓冲液组合物，其中所述明胶是液体明胶。

所述储存缓冲液组合物，其中所述液体明胶占约6克/升的浓度。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种糖醇选自：乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、肌醇、庚七醇(volemitol)、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇、聚葡糖醇、氢化淀粉水解物及其组合。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种糖醇是甘露糖醇。

所述储存缓冲液组合物，其中所述甘露糖醇占约50克/升的浓度。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂及其组合。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种表面活性剂是聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

所述储存缓冲液组合物，其中所述聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯占约1.1克/升的浓度。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种杀生物剂选自：防腐剂、抗微生物剂、杀菌剂、抗生素、抗细菌剂、杀细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗寄生虫剂、防污剂、消毒剂、农药、杀真菌剂、除草剂、杀昆虫剂、杀藻剂、杀软体动物剂、杀螨剂、灭鼠剂及其组合。

所述储存缓冲液组合物，其中所述至少一种杀生物剂是溴-硝基-二氧杂环己烷和甲基异噻唑啉酮的乙醇溶液。

所述储存缓冲液组合物，其中所述溴-硝基-二氧杂环己烷和甲基异噻唑啉酮的乙醇溶液占约2毫升/升的浓度。

用于在苗勒氏管抑制物质储存缓冲液组合物内稳定纯化的苗勒氏管抑制物质的方法，所述方法包括以下步骤：从哺乳动物来源提取苗勒氏管抑制物质，以由此形成提取的苗勒氏管抑制物质；纯化所述提取的苗勒氏管抑制物质，以由此形成纯化的苗勒氏管抑制物质；和将所述纯化的苗勒氏管抑制物质储存于储存缓冲液中，所述储存缓冲液包含：去离子水；至少一种缓冲剂；至少一种盐；至少一种糖醇；明胶；至少一种表面活性剂；无蛋白酶的牛血清白蛋白；和至少一种杀生物剂，其中所述储存缓冲液被维持在预定温度范围并稳定其中含有的纯化的苗勒氏管抑制物质。

所述方法，其中所述预定温度范围是约2℃至约8℃。

所述方法，其中所述至少一种糖醇是甘露糖醇。

因此，根据目前公开和请求保护的一个或多个发明构思，已经提供了用于稳定苗勒氏管抑制物质的组合物和方法。 如本文所述，目前公开和请求保护的一个或多个发明构思涉及改进的苗勒氏管抑制物质储存缓冲液组合物以及一种或多种在所述改进的缓冲液组合物内稳定苗勒氏管抑制物质的方法的实施方案。因此，目前公开和/或请求保护的一个或多个发明构思完全满足上文阐述的目的和优点。尽管已经结合上文阐述的具体附图、实验、结果和语言描述了目前公开和请求保护的一个或多个发明构思，但显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，意欲涵盖落入目前公开和请求保护的一个或多个发明构思的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。