类芽孢杆菌属的突变体及其使用方法

摘要

本发明提供了包含在液体培养物中具有降低的粘度的类芽孢杆菌属种菌株的生物学纯的培养物的组合物，所述菌株包含缺少功能性受体结构域或功能性DNA结合结构域的突变型DegU和/或缺少功能性单结合结构域或功能性ATP酶结构域的突变型DegS。还提供了鉴定与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，在液体培养物中具有降低的粘度的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株的方法，该方法通过目视筛选具有非粘液样形态的突变体分离株。

说明书

相关申请的交叉引用

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技术领域

本发明涉及细菌菌株及其防治植物病害的能力的领域。具体而言，本发明涉及具有相对高水平的抗真菌活性和降低的粘度的类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.)菌株，该降低的粘度有利于菌株的全发酵液产物的下游加工和浓缩。

背景技术

类芽孢杆菌属(Paenibacillus)是低GC含量、形成内生孢子的革兰氏阳性菌(厚壁菌门(Firmicutes))的属。属于该属的细菌是工业相关的细胞外酶和抗菌物质的多产生产者(prolific producer)，该抗菌物质包括非核糖体肽类，如杀镰孢菌素(fusaricidin)和多粘菌素(polymyxin)。已知杀镰孢菌素对各种植物病原真菌和细菌具有抗菌活性。

许多类芽孢杆菌属种是菌表多糖(EPS)的多产生产者。微生物EPS是水溶性生物聚合物，其附着在细胞表面并被释放到细胞外培养基中。由于其物理化学和流变学性质，这些聚合物已经在许多工业(包括食品、饲料、包装、化妆品和制药工业)中作为增稠剂的商用。EPS的产生导致全发酵液样品的粘度增加，具体而言，是由于高分子量物质。发酵液粘度的增加为生物反应器生长以及用于活的微生物全发酵液产物的发酵液材料的下游加工带来了问题。进一步加工前，可能需要昂贵的且繁重的程序来从大规模发酵液培养物中移除EPS。

需要用于产生和鉴定具有增强的杀真菌活性和可加工性，且具有降低的粘度和更高水平的杀镰孢菌素和杀镰孢菌素样化合物的类芽孢杆菌属种菌株的方法。

发明内容

本发明涉及一种增强类芽孢杆菌属种菌株及其突变体衍生物的杀真菌活性和可加工性的策略。设计了一种菌株改良策略，以通过连续轮的化学处理和高通量筛选来提高杀镰孢菌素的产生。此外，开发了目视筛选以降低发酵液培养物的粘度，以提高类芽孢杆菌属种菌株的杀真菌突变体衍生物的大规模生长和下游加工。产生并表征了几个具有改善的杀真菌和加工特性的类芽孢杆菌属种菌株。

在一些实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含类芽孢杆菌属种菌株的生物学纯的培养物，该菌株包含缺少功能性受体结构域(receiver Domain)或功能性DNA结合结构域的突变型DegU和/或缺乏功能性单结合结构域或功能性ATP酶结构域的突变型DegS，其中与包含野生型DegU和野生型DegS的类芽孢杆菌属种菌株的液体培养物相比，突变型DegU和/或突变型DegS导致具有降低的粘度的类芽孢杆菌属种菌株的液体培养物。

在某些方面，突变型DegU和/或突变型DegS抑制具有粘液样形态的类芽孢杆菌属种菌株的菌落的形成。

在一个实施方案中，突变型DegU和/或突变型DegS是敲除的或由于提前终止密码子而截短的。在某些方面，提前终止密码子导致在第218位处截短的突变型DegU，所述第218位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的。

在其他实施方案中，突变型DegU包含第109位处小残基到酸性残基的氨基酸置换，所述第109位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第228位处小残基到极性残基的氨基酸置换，所述第228位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第63位处酸性残基到极性残基的氨基酸置换，所述第63位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第195位处极性残基到小残基的氨基酸置换，所述第195位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第204位处疏水性残基到小残基的氨基酸置换，所述第204是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第208位处极性残基到小残基的氨基酸置换，所述第208位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的：和/或第212位处碱性残基到小残基的氨基酸置换，所述第212位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第217位处疏水性残基到小残基的氨基酸置换，所述第217位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第207位处碱性残基到小残基的氨基酸置换，所述第207位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第211位处极性残基到小残基的氨基酸置换，所述第211位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的；和/或第214位处极性残基到小残基的氨基酸置换，所述第214位是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号的。

在一方面，突变型DegU包含具有G109D和/或A228T和/或D63N和/或N195A和/或I204A和/或T208A和/或H208A和/或H212A和/或L217A和/或K2017A和/或N211A和/或S214A的氨基酸置换的SEQ ID NO:2；或其具有保守性氨基酸置换的变体。

在另一方面，突变型DegS包含第99位处疏水性残基到芳香族残基的氨基酸置换，所述第99位是相对于SEQ ID NO:4的氨基酸序列编号的；和/或第294位处酸性残基到碱性残基的氨基酸置换，所述第294位是相对于SEQ ID NO:4的氨基酸序列编号的；和/或第73位处极性残基到小残基的氨基酸置换，所述第73位是相对于SEQ ID NO:4的氨基酸序列编号的；和/或第190位处小残基到疏水性残基的氨基酸置换，所述第190位是相对于SEQ ID NO:4的氨基酸序列编号的。

在一个实施方案中，突变型DegS包含具有L99F和/或E294K和/或T73A和/或A190V的氨基酸置换的SEQ ID NO:4；或其具有保守性氨基酸置换的变体。

在一些实施方案中，类芽孢杆菌属种菌株是经诱变的衍生菌株，并且与未经诱变的亲本菌株相比，显示出提高的杀镰孢菌素水平。在其他实施方案中，类芽孢杆菌属种菌株是经诱变的衍生菌株，并且与未经诱变的亲本菌株相比，显示出降低的淀粉酶表达和/或酶活性。

在某些方面，降低的淀粉酶表达和/或酶活性是由包含与SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10具有大于约90％的序列同一性的序列的α-淀粉酶蛋白引起的。在其他方面，降低的淀粉酶表达和/或酶活性是由α-淀粉酶蛋白引起的，该α-淀粉酶蛋白包含与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有大于约95％的序列同一性、大于约96％的序列同一性、大于约97％的序列同一性、大于约98％的序列同一性或大于约99％的序列同一性的序列。在一个实施方案中，α-淀粉酶蛋白包含SEQ ID NO:9。在另一个实施方案中，α-淀粉酶蛋白由SEQ ID NO:9组成。在一个实施方案中，α-淀粉酶蛋白包含SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，α-淀粉酶蛋白由SEQ ID NO:10组成。

在一些情况下，未经诱变的亲本菌株是类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129。在其他情况下，未经诱变的亲本菌株是类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615。

在一方面，类芽孢杆菌属种菌株是类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615或其杀真菌的突变菌株。

在另一方面，组合物包含类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615或其杀真菌的突变菌株的发酵产物。

在某些实施方案中，杀真菌的突变菌株具有基因组序列，该基因组序列与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615具有大于约90％的序列同一性。

在其他实施方案例中，本发明涉及一种鉴定类芽孢杆菌属种突变型衍生菌株的方法，所述类芽孢杆菌属种突变衍生菌株与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，在液体培养物中具有粘度降低的粘度，该方法包括：诱变类芽孢杆菌属种亲本菌株以产生突变体分离株；在包含浓度为约1％(％(w/v)至约40％％(w/v)的糖的固体培养基上培养突变体分离株和类芽孢杆菌属种亲本菌株，其中所述类芽孢杆菌属种亲本菌株在固体培养基上具有粘液样形态；且在固体培养基上目视测筛选突变体分离株，以鉴定具有非粘液形态的(这表明其在液体培养物中粘度降低)的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株。

在一方面，固体培养基中的糖浓度为约5％(w/v)至约20％(w/v)。在另一方面，所述糖选自蔗糖、淀粉、麦芽糊精、玉米糖浆固体、果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖、木糖醇、菊粉、山梨糖醇、岩藻糖、糖蜜及其组合。

在某些实施方案中，固体培养基中的碳氮比为约10：1至约1000：1。在一方面，固体培养基还包含琼脂、琼脂糖和/或明胶。在一个具体方面，固体培养基是固体琼脂培养基。

在其他实施方案中，该方法进一步包括在液体培养基中培养类芽孢杆菌属种突变衍生菌株以产生液体培养物；以及测定液体培养物的粘度和/或压紧细胞体积(packedcell volume)，以确认与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，类芽孢杆菌属种突变衍生菌株的粘度降低。

在某些实施方案中，该方法进一步包括对类芽孢杆菌属种突变衍生菌株中的degU和/或degS测序，以鉴定编码缺少功能性受体结构域或功能性DNA结合结构域的突变型DegU和/或缺少功能性单结合结构域或功能性ATP酶结构域的突变型DegS的序列。

在其他实施方案中，该方法进一步包括测定在类芽孢杆菌属种突变衍生菌株和类芽孢杆菌属种亲本菌株中淀粉酶的表达和/或酶活性，以确定在类芽孢杆菌属种突变衍生菌株中表达和/或酶活性是否降低。在某些方面，在类芽孢杆菌属种突变衍生菌株中，淀粉酶的表达和/或酶活性小于类芽孢杆菌属种亲本菌株的约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。在其他方面，在类芽孢杆菌属种突变衍生菌株中，淀粉酶的表达和/或酶活性是类芽孢杆菌属种亲本菌株的约1％至约90％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至60％、约20％至90％、约20％至80％、约20％至70％或约20％至60％。

在一些实施方案中，降低的淀粉酶表达和/或酶活性是由包含与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有大于约90％的序列同一性的序列的α-淀粉酶蛋白引起的。

在一个实施方案中，该方法进一步包括定量突变体分离株中的杀镰孢菌素水平，以鉴定与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，具有提高的杀镰孢菌素水平的突变体分离株。

在某些实施方案中，类芽孢杆菌属种菌株是吃琼脂类芽孢杆菌(P.agarexedens)、嗜琼胶类芽孢杆菌(P.agaridevorans)、解藻酸类芽孢杆菌(P.alginolyticus)、居冷泉类芽孢杆菌(P.alkaliterrae)、蜂房类芽孢杆菌(P.alvei)、解淀粉类芽孢杆菌(P.amylolyticus)、厌氧生长类芽孢杆菌(P.anaericanus)、南极类芽孢杆菌(P.antarcticus)、阿萨姆类芽孢杆菌(P.assamensis)、氮还原类芽孢杆菌(P.azoreducens)、固氮类芽孢杆菌(P.azotofixans)、巴塞罗那类芽孢杆菌(P.barcinonensis)、北风类芽孢杆菌(P.borealis)、巴西类芽孢杆菌(P.brasiliensis)、P.brassicae、坎皮纳斯类芽孢杆菌(P.campinasensis)、晋州类芽孢杆菌(P.chinjuensis)、解几丁质类芽孢杆菌(P.chitinolyticus)、软骨素类芽孢杆菌(P.chondroitinus)、P.cineris、库氏类芽孢杆菌(P.cookie)、解凝乳类芽孢杆菌(P.curdlanolyticus)、内类芽孢杆菌(P.daejeonensis)、树形类芽孢杆菌(P.dendritiformis)、坚韧类芽孢杆菌(P.durum)、爱媛类芽孢杆菌(P.ehimensis)、埃吉类芽孢杆菌(P.elgii)、蜜梳状孢类芽孢杆菌(P.favisporus)、解葡聚糖类芽孢杆菌(P.glucanolyticus)、解聚糖类芽孢杆菌(P.glycanilyticus)、戈氏类芽孢杆菌(P.gordonae)、草类芽孢杆菌(P.graminis)、食颗粒类芽孢杆菌(P.granivorans)、P.hodogayensis、依利诺斯类芽孢杆菌(P.illinoisensis)、加米那类芽孢杆菌(P.jamilae)、神户类芽孢杆菌(P.kobensis)、食鞘类芽孢杆菌(P.koleovorans)、韩国类芽孢杆菌(P.koreensis)、胶冻样类芽孢杆菌(P.kribbensis)、乳类芽孢杆菌(P.lactis)、幼虫类芽孢杆菌(P.larvae)、灿烂类芽孢杆菌(P.lautus)、P.lentimorbus、浸麻类芽孢杆菌(P.macerans)、马阔里类芽孢杆菌(P.macquariensis)、马赛类芽孢杆菌(P.massiliensis)、孟氏类芽孢杆菌(P.mendelii)、本部类芽孢杆菌(P.motobuensis)、食萘类芽孢杆菌(P.naphthalenovorans)、嗜线虫类芽孢杆菌(P.nematophilus)、类芽孢杆菌附生新种(P.nov.spec.epiphyticus)、异味类芽胞杆菌(P.odorifer)、饲料类芽孢杆菌(P.pabuli)、皮尔瑞俄类芽孢杆菌(P.peoriae)、P.phoenicis、叶际类芽孢杆菌(P.phyllosphaerae)、多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)、多粘类芽孢杆菌多粘亚种(P.polymyxa ssp.Polymyxa)、多粘类芽孢杆菌植物亚种(P.polymyxa ssp.Plantarum)、日本类芽孢杆菌(P.popilliae)、尘埃类芽孢杆菌(P.pulvifaciens)、根际类芽孢杆菌(P.rhizosphaerae)、血类芽孢杆菌(P.sanguinis)、星孢类芽孢杆菌(P.stellifer)、台中类芽孢杆菌(P.taichungensis)、土地类芽孢杆菌(P.terrae)、解硫胺素类芽孢杆菌(P.thiaminolyticus)、提蒙类芽孢杆菌(P.timonensis)、P.tylopili、苏黎士类芽孢杆菌(P.turicensis)、强壮类芽孢杆菌(P.validus)、旋涡状类芽孢杆菌(P.vortex)、伤口类芽孢杆菌(P.vulneris)、温尼类芽孢杆菌(P.wynnii)或解木聚糖类芽孢杆菌(P.xylanilyticus)。

在另一个实施方案中，类芽孢杆菌属种菌株是多粘类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌多粘亚种、多粘类芽孢杆菌植物亚种、类芽孢杆菌附生新种、土地类芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌或蜂房类芽孢杆菌。在另一个实施方案中，类芽孢杆菌属种菌株是土地类芽孢杆菌。

在某些方面，类芽孢杆菌属种菌株是产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株。

产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株的实例包括但不限于多粘类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌多粘亚种、多粘类芽孢杆菌植物亚种、类芽孢杆菌附生新种、土地类芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌和蜂房类芽孢杆菌。

在其它实施方案中，本发明涉及用于产生类芽孢杆菌属种突变衍生菌株的方法，所述类芽孢杆菌属种突变衍生菌株与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，在液体培养物中具有降低的粘度，该方法包括：诱变类芽孢杆菌属亲本菌株以产生突变体分离株；在包含浓度为约1％(w/v)至约40％(w/v)的糖的固体培养基上培养突变体分离株和类芽孢杆菌属种亲本菌株，其中类芽孢杆菌属种亲本菌株在固体培养基上具有粘液样形态；在固体培养基上目视筛选突变体分离株以鉴定具有非粘液形态(这表明其在液体培养物中粘度降低)的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株；以及产生所鉴定的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株的发酵产物。在一方面，诱变包括类芽孢杆菌属种亲本菌株的化学诱变。

在一方面，本发明提供了包含用所公开方法鉴定的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株的发酵产物。在另一方面，发酵产物包含来自类芽孢杆菌属种突变衍生菌株的全发酵液的发酵液浓缩物，以增加其杀真菌和/或杀细菌活性。

在一些实施方案中，本发明涉及处理植物以防治病害的方法，其中该方法包括将有效量的本文所公开的组合物或本文所公开的发酵产物施用到植物、植物的部分和/或到植物的位置。

在一个实施方案中，组合物以每公顷约1×10

在一些方面，植物病害是由真菌引起的。在一方面，植物病害是白粉病或霜霉病。在另一方面，所述真菌选自互格交链孢(Alternaria alternata)、索兰尼链格孢(Alternaria solani)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、炭疽毛盘孢(Colletotrichumlagenarium)、葡萄白粉菌(Erysiphe necator)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)、禾生球腔菌(Zymoseptoria tritici)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、葡萄单轴霉(Plasmopara viticola)、白叉丝单囊壳(Podosphaera leucotricha)、古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)、终极腐霉(Pythium ultimum)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、苍耳单丝壳(Sphaerotheca fuliginea)、水稻纹枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、黑粉菌燕麦变种(Ustilago segetum var.avenae)、疣顶单孢锈菌(Uromycesappendiculatus)和小麦叶锈菌(Puccinia triticina)。

在其他方面，植物病害是由细菌引起的。在某些方面，细菌选自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。

在其他实施方案中，本发明涉及本文所公开的组合物或本文所公开的发酵产物在有用植物中防治植物病原生物体的用途。

附图说明

图1描绘了来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-50972、类芽孢杆菌属属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的菌株谱系。

图2描绘了与在没有蔗糖的固体琼脂培养基上生长的缺少粘液样菌落表型的相同类芽孢杆菌属种菌株相比，在含蔗糖的固体琼脂培养基上生长的具有粘液样菌落表型的类芽孢杆菌属种菌株。类芽孢杆菌属种菌株是：(1)土地类芽孢杆菌菌株A；(2)巴西类芽孢杆菌菌株B；(3)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972；(4)多粘类芽孢杆菌菌株C；(5)多粘类芽孢杆菌菌株D；和(6)皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株E。

图3描绘了来自在补充有蔗糖的固体琼脂培养基上的粘液样和非粘液样分离株的混合种群的菌落。

图4描绘了在含蔗糖的固体琼脂培养基上，(1)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972和(4)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的粘液样菌落表型，对比(2)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和(3)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306的非粘液样表型。所有菌株在没有蔗糖的对照固体琼脂培养基上均具有非粘液样表型。

图5描绘了在对类芽孢杆菌属种菌株B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306离心后的发酵液的沉淀(pellet)。在含蔗糖的固体琼脂培养基上具有非粘液样表型的菌株趋向于形成更紧实的沉淀，其具有更小的压紧细胞体积(PCV)。

图6A描绘了在具有非粘液样菌落表型的类芽孢杆菌属种菌株中鉴定的degS和degU基因中的SNP。图6B描绘了来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株168的DegU氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972的DegU氨基酸序列(SEQID NO:2)的比对，及在蛋白质的受体结构域和DNA结合结构域中鉴定的SNP。图6C描绘了来自枯草芽孢杆菌菌株168的DegS氨基酸序列(SEQ ID NO:3)和来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972的DegS氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的比对，及在蛋白质的单结合结构域和ATP酶结构域鉴定的SNP。

图7描述了degS和degU的破坏导致在含蔗糖的固体琼脂培养基上的类芽孢杆菌属种菌株的非粘液样菌落表型。类芽孢杆菌属种菌株是:(1)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129；(2)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306菌株；(3)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129degS::kanR；(4)类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129degSdegU::kanR；和(5)土地类芽孢杆菌菌株F。

图8A描绘了在72小时时间段内，以250rpm的搅拌速度生长的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)和NRRL B-67615(子代)的液体培养物中的粘度(实线)和杀镰孢菌素A(虚线)的测量。图8B描述了在72小时时间段内，以300rpm的搅拌速度生长的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)和NRRL B-67615(子代)的液体培养物中的粘度(实线)和杀镰孢菌素A(虚线)的测量。

图9A和9B描绘了在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)和NRRL B-67615(子代)的液体培养物中，在第40小时和第48小时的时间点评估了两种α-淀粉酶(即“α-淀粉酶#1”和“α-淀粉酶#2”)的相对蛋白表达。

图10描绘了从培养基中的多糖中释放的葡萄糖，其作为来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)和NRRL B-67615(子代)的液体培养物的无细胞上清液中淀粉酶活性的指标。

图11描绘了在第40小时时间点时补充0g/L葡萄糖(即对照)、2g/L葡萄糖、5g/L葡萄糖或10g/L葡萄糖并被允许继续生长6小时的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)和NRRL B-67615(子代)的液体培养物的粘度测量。

具体实施方式

除非另有特别说明，本文所述的微生物和特定菌株均是从自然界分离的并在人工条件下生长，例如在摇瓶培养中或通过扩大的生产过程(例如在生物反应器中)，以例如使生物活性代谢产物的产生最大化。在这样的条件下的生长导致菌株“驯化”。通常，这样的“驯化”菌株与其天然存在的对应菌株的区别在于，“驯化”菌株作为均质种群(homogenouspopulation)培养，其不经受自然环境中存在的选择压力，而是经受到人工选择压力。

本发明的微生物或其培养物或分离菌株，可以描述为呈“分离的”或“生物学纯的”形式。这些术语旨在意指微生物已经被从环境或一种或多种组分、细胞或其他成分中分离，如果在自然或其他条件下，这些组分、细胞或其他成分可能与所述微生物相伴随。术语“分离的”或“生物学纯的”不应被用来表示微生物被纯化的程度。然而，在一个实施方案中，微生物的分离株或培养物主要含有本发明的微生物。

如本文所用，在本说明书和权利要求书中使用的动词“包含/包括(comprise)”及其变化形式以其非限制性意义使用，以意指包括该词之后的项目，但是不排除未具体提及的项目。另外，通过不定冠词“一(a)”或“一个(an)”提及的元素不排除存在一个以上所述元素的可能性，除非上下文明确地要求存在一个且仅存在一个所述元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。

如本文所用，“碱性残基”是精氨酸、赖氨酸或组氨酸；“酸性残基”是谷氨酸或天冬氨酸；“极性残基”是丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺；“疏水性残基”是甲硫氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；“芳香族残基”是苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；以及“小残基”是甘氨酸或丙氨酸。

在一些实施方案中，与包含野生型DegU和野生型DegS的类芽孢杆菌属种菌株的液体培养物相比，包含突变型DegU和/或突变型DegS的类芽孢杆菌属种菌株产生具有降低的粘度的液体培养物。在某些方面，降低的粘度是通过以下方法测量的：将包含突变型DegU和/或突变型DegS的类芽孢杆菌属种菌株和包含野生型DegU和野生型DegS的类芽孢杆菌属种菌株分别在相同的液体培养基中生长直到稳定期，并测量每种液体培养物的粘度。粘度可以通过本领域已知的任何方法(包括实施例2中概述的方法)来测量。野生型DegU和野生型DegS的实例包括分别以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2以及以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列。

如本文所用，术语“粘液样”和“粘液样形态”是指微生物菌落的表型，其中该菌落在光学显微镜下具有明确的圆形边缘和发亮的外观。另外，具有粘液样形态的微生物菌落在三维上倾向于更高和更圆。粘液样菌落的实例在图3中呈现。

如本文所用，术语“非粘液样”和“非粘液样形态”是指微生物菌落的表型，其中该菌落在光学显微镜下具有较不明显的随机形状的边缘和暗淡的外观。非粘液样菌落在三维上倾向于更平坦。非粘液样菌落的实例也在图3中呈现。

在包含浓度为约1％(w/v)至约40％(w/v)的糖的固体琼脂培养基上，粘液样形态和非粘液样形态更容易区分。在某些方面，糖浓度为约1％(w/v)至约30％(w/v)、约1％(w/v)至约20％(w/v)、约5％(w/v)至约40％(w/v)、约5％(w/v)至约30％(w/v)或约5％(w/v)至约20％(w/v)。在一方面，固体琼脂培养基中的糖的浓度为约5％(w/v)至约20％(w/v)。

在一些实施方案中，固体培养基中的碳氮比为约10:1至约1000:1、约10:1至约750:1、约10:1至约500:1、约10:1至约250:1、约10:1至约100:1、约10:1至约75:1、约10:1至约50:1、约10:1至约25:1、约1:1至约100:1、约1:1至约75:1、约1:1至约50:1或约1:1至约25:1。在另一方面，固体培养基中的碳氮比为约10:1至约1000:1、约10:1至约750:1、约10:1至约500:1、约10:1至约250:1、约10:1至约100:1。在一方面，固体培养基中的碳氮比为约10:1至约1000:1。

在一个实施方案中，在所公开的方法中所使用的固体培养基和/或液体培养基包含支持类芽孢杆菌属种细胞生长的任何糖，所述方法用于鉴定与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，在液体培养物中具有降低的粘度的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株。

在某些方面，所述糖选自以下蔗糖、麦芽糊精、淀粉、玉米糖浆固体、果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖、木糖醇、菊粉、山梨糖醇、岩藻糖、糖蜜及其组合。在另一方面，所述糖选自蔗糖、淀粉、玉米糖浆固体、麦芽糊精、果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖及其组合。在另一方面，所述糖选自蔗糖、麦芽糊精、果糖及其组合。在另一方面，所述糖是蔗糖或麦芽糊精。

在一些实施方案中，本发明涉及一种使用目视筛选鉴定与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，在液体培养物中具有降低的粘度的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株的方法。如本文所用，术语“目视筛选”和“目视地筛选”是指无论是手动地还是用机器或机器人自动地进行的，分析在固体培养基上生长的微生物菌落的大小、形状和/或光泽(即光泽度)的任何方法。在一些方面，固体培养基是固体琼脂培养基。

在其他实施方案中，本发明涉及一种鉴定与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，在液体培养物中具有降低的粘度的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株的方法，该方法包括：诱变类芽孢杆菌属种亲本菌株以产生突变体分离株；在包含浓度为约1％(w/v)至约40％(w/v)的糖的液体培养基中培养突变体分离株和类芽孢杆菌属种亲本菌株，并测量在液体培养基中突变体分离株的粘度和/或压紧细胞体积，以鉴定与类芽孢杆菌属种亲本菌株相比，在液体培养物中具有降低的粘度的类芽孢杆菌属种突变衍生菌株。

类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972和类芽孢杆菌属菌株NRRL B-67129之前鉴定为具有广谱抗真菌活性的一组独特的杀镰孢菌素和杀镰孢菌素样化合物的产生者(WO2016/154297)。

在一方面，本发明的类芽孢杆菌属种菌株选自以下的任一种：吃琼脂类芽孢杆菌、嗜琼胶类芽孢杆菌、解藻酸类芽孢杆菌、居冷泉类芽孢杆菌、蜂房类芽孢杆菌、解淀粉类芽孢杆菌、厌氧生长类芽孢杆菌、南极类芽孢杆菌、阿萨姆类芽孢杆菌、氮还原类芽孢杆菌、固氮类芽孢杆菌、巴塞罗那类芽孢杆菌、北风类芽孢杆菌、巴西类芽孢杆菌、P.brassicae、坎皮纳斯类芽孢杆菌、晋州类芽孢杆菌、解几丁质类芽孢杆菌、软骨素类芽孢杆菌、P.cineris、库氏类芽孢杆菌、解凝乳类芽孢杆菌、内类芽孢杆菌、树形类芽孢杆菌、坚韧类芽孢杆菌、爱媛类芽孢杆菌、埃吉类芽孢杆菌、蜜梳状孢类芽孢杆菌、解葡聚糖类芽孢杆菌、解聚糖类芽孢杆菌、戈氏类芽孢杆菌、草类芽孢杆菌、食颗粒类芽孢杆菌、P.hodogayensis、依利诺斯类芽孢杆菌、加米那类芽孢杆菌、神户类芽孢杆菌、食鞘类芽孢杆菌、韩国类芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌、乳类芽孢杆菌、幼虫类芽孢杆菌、灿烂类芽孢杆菌、P.lentimorbus、浸麻类芽孢杆菌、马阔里类芽孢杆菌、马阔里类芽孢杆菌、孟氏类芽孢杆菌、本部类芽孢杆菌、食萘类芽孢杆菌、嗜线虫类芽孢杆菌、类芽孢杆菌附生新种、异味类芽胞杆菌、饲料类芽孢杆菌、皮尔瑞俄类芽孢杆菌、P.phoenicis、叶际类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌多粘亚种、多粘类芽孢杆菌植物亚种、日本类芽孢杆菌、尘埃类芽孢杆菌、根际类芽孢杆菌、血类芽孢杆菌、星孢类芽孢杆菌、台中类芽孢杆菌、土地类芽孢杆菌、解硫胺素类芽孢杆菌、提蒙类芽孢杆菌、P.tylopili、苏黎士类芽孢杆菌、强壮类芽孢杆菌、旋涡状类芽孢杆菌、伤口类芽孢杆菌、温尼类芽孢杆菌和解木聚糖类芽孢杆菌。

在另一方面，本发明的类芽孢杆菌属种菌株选自以下的任一种：土地类芽孢杆菌、巴西类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌或皮尔瑞俄类芽孢杆菌。在一方面，本发明的类芽孢杆菌属种菌株是土地类芽孢杆菌。

在一个实施方案中，提供了类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的突变菌株。术语“突变体”是指衍生自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的遗传变体。在一个实施方案中，所述突变体具有类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的一种或多种或全部鉴定(功能性)特征。在一个特定的实例下，突变体或其发酵产物至少和亲本类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615一样防治(作为鉴定的功能性特征)真菌、卵菌和/或细菌。这样的突变体可以是具有基因组序列的遗传变体，该基因组序列与类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615具有大于约85％、大于约90％、大于约95％、大于约98％或大于约99％的序列同一性。突变体可以通过以下方法来获得：通过用化学品或辐射处理类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的细胞，或通过从来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615细胞的种群中选择自发突变体(例如噬菌体抗性或抗生素抗性突变体)，通过如下所述的基因组改组(genome shuffling)或通过本领域技术人员公知的其他方式。

可以通过使用称为原生质体融合的方法来促进类芽孢杆菌属种菌株之间的基因组改组。该方法开始于从营养杆菌(bacillary)细胞形成原生质体。通常使用溶菌酶和渗透稳定剂去除肽聚糖细胞壁会导致原生质体的形成。光学显微镜下可以看到该过程以及球形细胞的出现。然后PEG(聚乙二醇)的加入诱导原生质体之间的融合，使两个或多个细胞的遗传成分接触，从而促进重组和基因组改组。然后融合的细胞重新分配并在固体生长培养基上恢复。在恢复过程中，原生质体会重建肽聚糖细胞壁，并转变回杆菌形状。参见Schaeffer,et.al.,(1976)PNAS USA,vol.73,6:2151-2155)。

类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615及其突变体对多种植物病原体具有活性。在一方面，该菌株具有抗真菌、抗卵菌和/或抗细菌活性，真菌例如黄瓜炭疽病、黄瓜白粉病、小麦叶锈病、大麦白粉病、链格孢属(Alternaria)和葡萄孢属(Botrytis)；卵菌例如番茄晚疫病、黄瓜霜霉病和芸苔霜霉病；细菌例如假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和欧文氏菌属(Erwinia)。

在某些方面，类芽孢杆菌属种菌株的突变型DegU和/或突变型DegS特征包括保守性氨基酸置换。例如，考虑到了SEQ ID NO:1-4的序列内的保守性氨基酸置换。保守性氨基酸置换的实例在以下组内：碱性氨基酸(即精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(即谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(即丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(即甲硫氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(即苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(即甘氨酸和丙氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸置换是本领域已知的，并记载于例如，H.Neurath and R.L.Hill,1979,TheProteins,Academic Press,New York中，其内容以引用的方式全文纳入此文。常见的保守性置换包括Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Lys/Arg、Leu/Ile和Leu/Val。

本发明还包括通过将所公开的类芽孢杆菌属种菌株或其突变体，或其无细胞制品或其代谢产物给予植物或植物部分(例如叶、茎、花、果实、根或种子)或通过施用于该植物或植物部分生长的位置(例如土壤)，来处理植物以防治植物病害的方法。

在根据本发明的方法中，含有所公开的类芽孢杆菌属种菌株或其杀真菌突变体的组合物可被施用于生长在任何类型的用于生长植物的介质(例如土壤、蛭石、碎纸板和水)中的任何植物或任何植物的任何部分，或施用于气生生长的植物或植物部分(例如兰花或鹿角蕨)。该组合物可以例如通过喷洒(spraying)、雾化(atomizing)、蒸发(vaporizing)、散播(scattering)、粉化(dusting)、添水(watering)、喷射(squirting)、喷洒(sprinkling)、倾注(pouring)或熏蒸(fumigating)来施用。如上文已经说明的，可以在目的植物所处的任何需要的场所进行施用，例如农业、园艺、森林、种植园、果园、苗圃、有机种植农作物、草皮和城市环境。

根据本领域公知的方法，包括通过使用培养基和以下实施例中描述的其他方法，可以通过培养所公开的类芽孢杆菌属种菌株或从其衍生的杀真菌突变体(菌株)来获得本发明的组合物。常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。接近发酵结束时，随着营养物的消耗，细胞开始从生长期转变到孢子形成期，因此最终发酵产物主要是孢子、代谢产物和残留的发酵培养基。孢子形成是类芽孢杆菌属的天然生命周期的一部分，且通常由细胞响应于营养物限制而开始。设置发酵以获得高水平的菌落形成单位并促进孢子形成。发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢产物可以直接使用，或通过常规工业方法(例如离心、正切流动过滤、深层过滤和蒸发)浓缩。

本发明的组合物包括发酵产物。在一些实施方案中，清洗浓缩发酵液(例如通过渗滤方法)以除去残留的发酵液和代谢产物。如本文所用，术语“发酵液浓缩物(brothconcentrate)”是指已如上文所述由常规工业方法浓缩，但是以液体形式保留的全发酵液(发酵液)。如本文所用，术语“发酵固体”是指在发酵液干燥后保留的固体材料。如本文所用，术语“发酵产物”是指全发酵液、发酵液浓缩物和/或发酵固体。本发明的组合物包括发酵产物。

使用常规干燥过程或方法(例如喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥、流化床干燥、转鼓干燥或蒸发)，添加或不添加载体，可干燥发酵液或发酵液浓缩物。

所得的干燥产物可以进一步加工，例如通过制粉(milling)或造粒(granulation)，以达到特定的颗粒大小或物理形式。也可以在干燥后添加下文所述的载体。

本发明菌株的发酵液的无细胞制品可以通过本领域已知的任何方法(例如发酵液的提取、离心和/或过滤)获得。本领域技术人员将了解，取决于移除细胞所使用的技术(例如，离心速度)，所谓的无细胞制剂可能无法不含细胞，而是在很大程度上没有细胞或基本上没有细胞。所得的无细胞制品可被干燥和/或用有助于将其施用于植物或植物生长培养基的组分来配制。上文所述的发酵液的浓缩方法和干燥技术也适用于无细胞制品。

在一个实施方案中，发酵产物包含至少约1×10

本发明的组合物可以本身的形式来使用，或根据它们特定的物理和/或化学性质，以它们的制剂形式或从其制备的使用形式来使用，例如气雾剂、胶囊悬剂、冷雾化浓缩物、热雾化浓缩物、胶囊颗粒剂、微粒剂(fine granules)、用于处理种子的流动浓缩物、即用型溶液剂、粉剂(dustable powder)、乳化浓缩物、水包油乳剂、油包水乳剂、大颗粒剂、小颗粒剂、油分散粉剂、油混溶性流动浓缩物、油混溶性液剂、气体(在压力下)、产气产品、发泡剂、糊剂、农药包被的种子、悬浮浓缩物、油分散液、悬乳剂浓缩物、可溶性浓缩物、悬浮剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、粉剂和颗粒剂(dusts and granules)、水溶性和水分散颗粒剂或片剂、用于处理种子的水溶性和水分散粉剂(powder)、可湿性粉剂、浸透活性成分的天然产物和合成物质，以及用于种子的聚合物质中和包被材料中的微囊剂，以及ULV冷雾化和热雾化制剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物是液体制剂。液体制剂的非限制性实例包括悬浮浓缩物和油分散液。在其他实施方案中，本发明的组合物是固体制剂。液体制剂的非限制性实例包括冻干粉剂和喷雾干燥的粉剂。

根据本发明可处理所有植物和植物部分。在本发明上下文中，植物可理解为意指全部植物和植物种群，如需要的和不需要的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可为通过传统育种和优化方法或通过生物技术和重组方法，或这些方法的组合而获得的植物，包括转基因植物且包括受到或不受植物育种者权利保护的植物品种。植物部分可理解为意指植物的所有地上和地下部分以及器官，如幼苗(shoot)、叶、花和根，可提及的实例是叶、针叶、秆、茎、花、子实体、果实和种子、以及根、块茎和根茎。植物部分还包括作物材料以及营养繁殖和有性繁殖材料，例如插枝、块茎、根茎、接枝(slip)和种子。

如上文已经提及的，可以根据本发明处理所有植物及其部分。在一个优选的实施方案中，对野生的或通过传统生物育种方法(例如杂交或原生质体融合)获得的植物物种和植物品种以及它们的部分进行处理。在另一个优选的实施方案中，对通过重组方法(如果合适，与传统方法结合)获得的转基因植物和植物品种(遗传修饰的生物体)以及它们的部分进行处理。术语“部分”或“植物的部分”和“植物部分”已在上文中解释。特别优选地根据本发明处理在每种情况下均是市售的或使用中的植物品种的植物。植物品种理解为意指具有新性状的植物，其通过传统育种、通过诱变或通过重组DNA技术培育。植物品种可以表现为品种、种类(race)、生物型和基因型的形式。

使用本发明的组合物进行的对植物和植物部分的处理可以直接进行，或通过使用常规处理方法作用于环境、生境或贮存空间，例如通过浸渍(dipping)、喷洒、雾化(atomizing)、成雾(misting)、蒸发(evaporating)、粉化、成雾(fogging)、散播、起泡(foaming)、涂抹(painting on)、散播(spreading)、注射(injecting)、浸透(drenching)、滴灌溉(trickle irrigation)，以及在繁殖材料的情况下，特别是在种子的情况下，还可以通过干种子处理方法、湿种子处理方法、浆处理方法、通过形成外壳、通过用一种或多种包衣来包被等。还可以通过超低容积法来施用活性物质，或将活性物质制剂或活性物质本身注射到土壤中。

优选的植物直接处理是叶施用处理，即将根据本发明的组合物施用于叶片，可使处理频率与施用率与所讨论的病原体的感染压力相匹配。

在系统活性(systemically active)化合物的情况下，本发明的组合物经由根部系统到达植物。在这种情况下，通过使本发明的化合物作用于植物环境来处理植物。这可例如通过以下方式来进行：浸透、混合于土壤中或营养液中，即，用液体形式的本发明的组合物来灌注植物的位置(例如土壤或溶液培养体系)，或通过土壤施用，即，将本发明的组合物以固体形式(例如以颗粒形式)掺入到植物所处的位置。在水稻培养物的情况下，这也可以通过将本发明的组合物以固体使用形式(例如以颗粒形式)加到(meter)被淹没的水稻田来实现。

优选的植物为那些有用的植物、观赏植物、草坪，通常使用的在公共场合和家庭中被用作观赏植物的树木，以及林业树木。林业树木包括用于生产木材、纤维素、纸的树木，以及从树木部分产生的产品。

本文上下文中使用的术语“有用植物”指这样的作物植物，即其被用作获得食品、饲料、燃料或用于工业目的的植物。

可使用本发明的组合物和方法来处理和/或改善的有用的植物包括例如以下类型的植物：草皮、藤本植物、谷类，例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米和粟/高粱；甜菜，例如糖用甜菜和饲用甜菜；水果，例如仁果、核果和浆果，例如苹果、梨、李子、桃、扁桃、樱桃和浆果，例如草莓、树莓、黑莓；豆科植物，例如豆、小扁豆、豌豆和大豆；油类作物，例如油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可和花生；葫芦，例如南瓜(pumpkin/squash)、黄瓜和甜瓜；纤维植物，例如棉花、亚麻、大麻和黄麻；柑橘类水果，例如橙子、柠檬、葡萄柚和柑橘；蔬菜，例如菠菜、莴苣、芦笋、甘蓝物种、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯和甜椒；樟科(Lauraceae)，例如鳄梨、樟属(Cinnamomum)、樟脑，或其他植物，例如烟草、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶、辣椒、葡萄藤、啤酒花(hop)、香蕉、乳胶植物，以及观赏植物，例如花、灌木、落叶树木和针叶树木。该列举是非限制性的。

以下植物被认为是本发明的组合物和方法特别适用的靶作物：棉花、茄子、草皮、仁果、核果、浆果、玉米、小麦、大麦、黄瓜、烟草、藤本植物、稻、谷类、梨、豆、大豆、油菜、番茄、甜椒、甜瓜、甘蓝、马铃薯和苹果。

可根据本发明的方法来改善的树木的实例是：冷杉属种(Abies sp.)、桉属种(Eucalyptus sp.)、云杉属种(Picea sp.)、松属种(Pinus sp.)、七叶树属种(Aesculussp.)、悬铃木属种(Platanus sp.)、椴树属种(Tilia sp.)、槭树属种(Acer sp.)、铁杉属种(Tsuga sp.)、梣属种(Fraxinus sp.)、花楸属种(Sorbus sp.)、桦木属种(Betula sp.)、山楂属种(Crataegus sp.)、榆属种(Ulmus sp.)、栎属种(Quercus sp.)、山毛榉属种(Fagussp.)、柳属种(Salix sp.)、杨属种(Populus sp.)。

可根据本发明的方法来改善的优选的树木是：来自七叶树属树木物种：欧洲七叶树(A.hippocastanum)、小花七叶树(A.pariflora)、红花七叶树(A.carnea)；来自悬铃木属树木物种：二球悬铃木(P.aceriflora)、一球悬铃木(P.occidentalis)、加利福尼亚悬铃木(P.racemosa)；来自云杉属树木物种：欧洲云杉(P.abies)；来自松属树木物种：辐射松(P.radiata)、西黄松(P.ponderosa)、扭叶松(P.contorta)、欧洲赤松(P.sylvestre)、湿地松(P.elliottii)、白松(P.montecola)、美国白皮松(P.albicaulis)、多脂松(P.resinosa)、长叶松(P.palustri)、火炬松(P.taeda)、柔枝松(P.flexilis)、黑材松(P.jeffregi)、北美短叶松(P.baksiana)、北美乔松(P.strobus)；来自桉属树木物种：巨桉(E.grandis)、蓝桉(E.globulus)、赤桉(E.camadentis)、亮果桉(E.nitens)、斜叶桉(E.obliqua)、王桉(E.regnans)、弹丸桉(E.pilularus)。

可根据本发明的方法来改善的特别优选的树木是：来自松属物种的树木：辐射松、西黄松、扭叶松、欧洲赤松、北美乔松：来自桉属物种的树木：巨桉、蓝桉、赤桉。

可根据本发明的方法来改善的非常特别优选的树木是：七叶树、悬铃木科(Platanaceae)、椴树、枫树。

本发明还可以应用于任何草皮草，包括冷季型草皮草和暖季型草皮草。冷季型草皮草的实例是：早熟禾(早熟禾属种(Poa ssp.))，例如肯塔基早熟禾(草地早熟禾(Poapratensis L.))、粗茎早熟禾(普通早熟禾(Poa trivialis L.))、加拿大早熟禾(加拿大早熟禾(Poa compressa L.))、一年生早熟禾(早熟禾(Poa annua L.))、高地早熟禾(高地早熟禾(Poa glaucantha Gaudin))、林地早熟禾(林地早熟禾(Poa nemoralis L.))和鳞茎早熟禾(鳞茎早熟禾(Poa bulbosa L.))；剪股颖(剪股颖属种(Agrostis ssp.))，如匍匐翦股颖(匍匐翦股颖(Agrostis palustris Huds.))、细弱翦股颖(细弱翦股颖(Agrostistenuis Sibth.))、绒毛翦股颖(绒毛翦股颖(Agrostis canina L.))、德国南部混合翦股颖(剪股颖属种，包括细弱翦股颖、绒毛翦股颖和匍匐翦股颖)，以及小糠草(小糠草(Agrostisalba L.))；

羊茅(羊茅属种(Festuca ssp.))、如紫羊茅(Festuca rubra L.ssp.rubra)、匍匐羊茅(匍匐羊茅(Festuca rubra L.))、紫羊茅(紫羊茅(Festuca rubra commutataGaud.))、羊茅(羊茅(Festuca ovina L.))、硬羊茅(硬羊茅(Festuca longifoliaThuill.))、细叶羊茅(细叶羊茅(Festucu capillata Lam.))、高羊茅(高羊茅(Festucaarundinacea Schreb.))和牛尾草(牛尾草(Festuca elanor L.))；

黑麦草(黑麦草属种(Lolium ssp.))，例如一年生黑麦草(多花黑麦草(Loliummultiflorum Lam.))、多年生黑麦草(多年生黑麦草(Lolium perenne L.))和意大利黑麦草(多花黑麦草(Lolium multiflorum Lam.))；

以及冰草(冰草属种(Agropyron ssp.))，如扁穗冰草(扁穗冰草(Agropyroncristatum(L.)Gaertn.))、沙生冰草(沙生冰草(Agropyron desertorum(Fisch.)Schult.))和蓝茎冰草(蓝茎冰草(Agropyron smithii Rydb.))。

其他冷季型草皮草的实例是：喜沙草(美洲沙茅草(Ammophila breviligulataFern.))、无芒雀麦(无芒雀麦(Bromus inermis Leyss.))、香蒲如梯牧草(梯牧草(Phleumpratense L.))、沙香蒲(Phleum subulatum L.)、鸭茅(鸭茅(Dactylis glomerata L.))、碱茅(碱茅(Puccinellia distans(L.)Parl.))和洋狗尾草(洋狗尾草(Cynosuruscristatus L.))。

暖季型草皮草的实例是：狗牙根(狗牙根属种(Cynodon spp.L.C.Rich))、结缕草(结缕草属种(Zoysia spp.Willd.))、偏序钝叶草(偏序钝叶草(Stenotaphrum secundatumWalt Kuntze))、假俭草(假俭草(Eremochloa ophiuroides Munro Hack.))、地毯草(类地毯草(Axonopus affinis Chase))、百喜草(百喜草(Paspalum notatum Flugge))、狼尾草(狼尾草(Pennisetum clandestinum Hochst.ex Chiov.))、野牛草(野牛草(Buchloedactyloids(Nutt.)Engelm.))、格兰马草(格兰马草(Bouteloua gracilis(H.B.K.)Lag.exGriffiths))、海滨雀稗(海滨雀稗(Paspalum vaginatum Swartz))和垂穗草(垂穗草(Bouteloua curtipendula(Michx.Torr.))。冷季型草皮草通常优选地用于根据本发明的用途。特别优选的是早熟禾、剪股颖和小糠草、羊茅和黑麦草。尤其优选的是剪股颖。

本发明的组合物具有有效的杀微生物活性，并且可用于在作物保护和材料保护中防治不想要的微生物，如真菌和细菌。

本发明还涉及用于防治不想要的微生物的方法，其特征在于，将本发明的组合物施用于植物病原真菌、植物病原细菌和/或其生境。

杀真菌剂可用于在作物保护中防治植物病原真菌。杀真菌剂的特征在于具有对抗广谱植物病原真菌的显著功效，所述植物病原真菌包括土壤传播的病原体，特别是根肿菌纲(Plasmodiophoromycetes)、卵菌纲(Peronosporomycetes)(同义词：卵菌纲(Oomycetes))、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)(同义词：半知菌纲(Fungi imperfecti))的成员。一些杀真菌剂具有系统活性且可以作为叶片、种子拌种或土壤杀真菌剂用于植物保护中。此外，它们适合用于防治真菌，尤其是侵扰植物的木材或根部的真菌。

杀细菌剂可用于作物保护中防治假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科(Streptomycetaceae)。

可以根据本发明处理的真菌性病害的病原体的非限制性实例包括：

由白粉病病原体引起的病害，所述白粉病病原体例如，布氏白粉菌属(Blumeria)种，例如禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis)；叉丝单囊壳属(Podosphaera)种，例如白叉丝单囊壳(Podosphaera leucotricha)；单丝壳属(Sphaerotheca)种，例如苍耳单丝壳(Sphaerotheca fuliginea)；钩丝壳属(Uncinula)种，例如葡萄白粉菌(Uncinulanecator)；

由锈病病原体引起的病害，所述锈病病原体例如，裸孢子囊菌属(Gymnosporangium)种，例如梨锈菌(Gymnosporangium sabinae)；驼孢锈菌属(Hemileia)种，例如咖啡锈菌(Hemileia vastatrix)；层锈菌属(Phakopsora)种，例如豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)；柄锈菌属(Puccinia)种，例如小麦隐匿柄锈菌(Puccinia recondite)、小麦叶锈菌(P.triticina)、禾柄锈菌(P.graminis)或小麦条锈病菌(P.striiformis)；单孢锈菌属(Uromyces)种，例如疣顶单胞锈菌(Uromyces appendiculatus)；

由卵菌纲(Oomycetes)的病原体引起的病害，所述病原体例如白锈菌属(Albugo)种，例如白锈病菌(Albugo candida)；盘梗霉属(Bremia)种，例如莴苣盘梗霉菌(Bremialactucae)；斜尖状孢子菌属(Peronospora)种，例如豌豆霜霉(Peronospora pisi)或芸苔霜霉(P.brassicae)；疫霉属(Phytophthora)种，例如马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)；单轴霉属(Plasmopara)种，例如葡萄单轴霉(Plasmopara viticola)；假霜霉属(Pseudoperonospora)种，例如葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)或古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)；腐霉属(Pythium)种，例如终极腐霉菌(Pythiumultimum)；

由例如以下病原体引起的叶斑病和叶萎蔫病：链格孢属(Alternaria)种，例如索兰尼链格孢(Alternaria solani)；尾孢菌属(Cercospora)种，例如甜菜尾孢菌(Cercospora beticola)；枝孢属(Cladiosporium)种，例如黄瓜叶霉病菌(Cladiosporiumcucumerinum)；旋孢腔菌属(Cochliobolus)种，例如禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)(分生孢子形式：德氏霉属(Drechslera)，同义词：长蠕孢属(Helminthosporium))、水稻旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)；毛盘孢属(Colletotrichum)种，例如豆刺盘孢菌(Colletotrichum lindemuthanium)；环黑星霉属(Cycloconium)种，例如油橄榄孔雀斑菌(Cycloconium oleaginum)；间座壳菌属(Diaporthe)种，例如柑橘褐色蒂腐病菌(Diaporthe citri)；痂囊腔菌属(Elsinoe)种，例如柑桔痂囊腔菌(Elsinoe fawcettii)；盘长孢菌属(Gloeosporium)种，例如桃树腐烂病菌(Gloeosporium laeticolor)；小丛壳属(Glomerella)种，例如炭疽病菌(Glomerella cingulate)；球座菌属(Guignardia)种，例如葡萄球座菌(Guignardia bidwelli)；小球腔菌属(Leptosphaeria)种，例如十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)；间座壳属(Magnaporthe)种，例如稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；盘二孢属(Marssonia)种，例如苹果盘二胞(Marssonia coronaria)；微结节菌属(Microdochium)种，例如雪霉叶枯菌(Microdochium nivale)；球腔围属(Mycosphaerella)种，例如禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、花生球腔菌(M.arachidicola)和斐济球腔菌(M.fijiensis)；球腔菌属(Phaeosphaeria)种，例如小麦叶枯病菌(Phaeosphaerianodorum)；核腔菌属(Pyrenophora)种，例如圆核腔菌(Pyrenophora teres)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici repentis)；柱隔孢属(Ramularia)种，例如柱隔孢叶斑病菌(Ramularia collo-cygni)、白斑柱隔孢(Ramularia areola)；喙孢属(Rhynchosporium)种，例如大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis)；壳针孢菌属(Septoria)种，例如芹菜壳针孢菌(Septoria apii)、番茄壳针孢菌(Septoria lycopersii)；核瑚菌属(Typhula)种，例如肉孢核瑚菌(Typhula incarnate)；黑星菌属(Venturia)种，例如苹果黑星菌(Venturia inaequalis)；

由例如以下病原体引起的根和茎的病害：伏革菌属(Corticium)种，例如禾伏革菌(Corticium graminearum)；镰刀菌属(Fusarium)种，例如尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)；禾顶囊壳属(Gaeumannomyces)种，例如小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis)；丝核菌属(Rhizoctonia)种，诸如，例如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；例如由稻帚枝霉(Sarocladium oryzae)引起的帚枝霉属(Sarocladium)病害；例如由稻小球菌核菌(Sclerotium oryzae)引起的小核菌属(Sclerotium)病害；Tapesia属种，例如Tapesia acuformis；根串珠霉属(Thielaviopsis)种，例如烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)；

由例如以下病原体引起的肉穗花序和圆锥花序病害(包括玉米穗轴)：链格孢属(Alternaria)种，例如链格孢属种(Alternaria spp.)；曲霉属(Aspergillus)种，例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus)；枝孢属(Cladosporium)种，例如芽枝状枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)；麦角菌属(Claviceps)种，例如紫色麦角菌(Claviceps purpurea)；镰刀菌属(Fusarium)种，例如大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)；赤霉属(Gibberella)种，例如玉米赤霉(Gibberella zeae)；小画线壳属(Monographella)种，例如雪腐小画线壳(Monographella nivalis)；壳针孢菌属(Septoria)种，例如小麦颖枯壳针孢菌(Septorianodorum)；

由以下黑粉菌引起的病害：例如轴黑粉菌属(Sphacelotheca)种，例如玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)；腥黑粉菌属(Tilletia)种，例如小麦腥黑穗病菌(Tilletia caries)、小麦矮腥黑穗病菌(T.controversa)；条黑粉菌属(Urocystis)种，例如黑麦杆黑穗病菌(Urocystis occulta)；黑粉菌属(Ustilago)种，例如裸黑粉菌(Ustilago nuda)、散黑穗病菌(U.nuda tritici)；

由以下引起的果实腐烂：例如曲霉属(Aspergillus)种，例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus)；葡萄孢属(Botrytis)种，例如灰葡病菌(Botrytis cinerea)；青霉属(Penicillium)种，例如扩展青霉菌(Penicillium expansum)和产紫青霉(P.purpurogenum)；核盘菌属(Sclerotinia)种，例如核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)；轮枝孢属(Verticilium)种，例如黑白轮枝孢(Verticilium alboatrum)；

由以下引起的种传的和土传的腐败、发霉、萎蔫、腐烂和猝倒病害：例如链格孢属(Alternaria)种，例如由甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)引起的；丝囊霉属(Aphanomyces)种，例如由根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)引起的；壳二孢属(Ascochyta)种，例如由晶状体壳二孢(Ascochyta lentis)引起的；曲霉属(Aspergillus)种，例如由黄曲霉菌(Aspergillus flavus)引起的；枝孢属(Cladosporium)种，例如由多主枝孢(Cladosporium herbarum)引起的；旋孢腔菌属(Cochliobolus)种，例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)引起的；(分生孢子形式：德氏霉属(Drechslera)、双极霉属(Bipolaris)，同义词：长蠕孢属(Helminthosporium))；毛盘孢属(Colletotrichum)种，例如由球炭疽菌(Colletotrichum coccodes)引起的；镰刀菌属(Fusarium)种，例如由大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)引起的；赤霉属(Gibberella)种，例如由玉米赤霉(Gibberellazeae)引起的；壳球孢属(Macrophomina)种，例如由菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)引起的；小画线壳属(Monographella)种，例如由雪腐小画线壳(Monographella nivalis)引起的；青霉属(Penicillium)种，例如由扩展青霉菌(Penicillium expansum)引起的；茎点霉属(Phoma)种，例如由黑胫茎点霉(Phoma lingam)引起的；拟茎点霉属(Phomopsis)种，例如由大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae)引起的；疫霉属(Phytophthora)种，例如由恶疫霉(Phytophthora cactorum)引起的；核腔菌属(Pyrenophora)种，例如由麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)引起的；梨孢属(Pyricularia)种，例如由稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引起的；腐霉属(Pythium)种，例如由终极腐霉(Pythium ultimum)引起的；丝核菌属(Rhizoctonia)种，例如由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的；根霉属(Rhizopus)种，例如由稻根霉菌(Rhizopus oryzae)引起的；小核菌属(Sclerotium)种，例如由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的；壳针孢属(Septoria)种，例如由小麦颖枯壳针孢菌(Septoria nodorum)引起的；核瑚菌属(Typhula)种，例如由肉孢核瑚菌(Typhula incarnate)引起的；轮枝孢属(Verticillium)种，例如由棉花黄萎病菌(Verticillium dahlia)引起的；

由以下引起的癌症(cancer)、虫瘿和扫帚病(witches’broom)：例如丛赤壳属(Nectria)种，例如仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena)；

由以下引起的萎蔫病害：例如链核盘菌属(Monilinia)种，例如核果链核盘菌(Monilinia laxa)；

由以下引起的叶疱病或卷叶病病害：例如外担子菌属(Exobasidium)种，例如坏损外担菌(Exobasidium vexans)；

外囊菌属(Taphrina)种，例如畸形外囊菌(Taphrina deformans)；

木本植物的退行性病害：由例如根霉格孢菌(Phaemoniella clamydospora)、褐枝顶孢霉(Phaeoacremonium aleophilum)和地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)引起的埃斯卡(Esca)病害；由例如侧弯孢壳(Eutypa lata)引起的葡萄顶枯病(Eutypa dyeback)；由例如岛灵芝(Ganoderma boninense)引起的灵芝属(Ganoderma)病害；由例如木硬孔菌(Rigidoporus lignosus)引起的硬孔菌属(Rigidoporus)病害；

由以下引起的花和种子的病害：例如葡萄孢属(Botrytis)种，例如灰葡萄孢(Botrytis cinerea)；

由以下引起的植物块茎病害：例如丝核菌属(Rhizoctonia)种，例如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；长蠕孢菌属(Helminthosporium)种，例如茄病长蠕孢(Helminthosporium solani)；

由以下引起的根肿病病害：例如根肿菌属(Plasmodiophora)种，例如芸薹根肿菌(Plamodiophora brasicae)；

由以下细菌性病原体引起的病害：例如黄单胞菌属(Xanthomonas)种，例如稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas campestris pv.Oryzae)；假单胞菌属(Pseudomonas)种，例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringae pv.Lachrymans)；欧文氏(Erwinia)种，例如噬淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。

优选地可防治大豆的以下病害：

由例如以下病原体引起的位于叶、茎、荚和种子上的真菌病害：链格孢属叶斑病(Alternaria leaf spot)(Alternaria spec.atrans tenuissima)、炭疽病(Colletotrichum gloeosporoides dematium var.truncatum)、褐斑病(大豆壳针孢(Septoria glycines))、尾孢属叶斑病和叶枯病(Cercospora leaf spot and blight)(菊池尾孢菌(Cercospora kikuchii))、笄霉属(Choanephora)叶枯病(漏斗笄霉(Choanephorainfundibulifera trispora)(同义词))、疏毛核菌霉(dactuliophora)叶斑病(大豆疏毛核菌霉(Dactuliophora glycines))、霜霉病(downy mildew)(东北霜霉(Peronosporamanshurica))、德氏霉属(drechslera)枯萎病(德氏霉叶枯病(Drechslera glycini))、蛙眼病叶斑病(大豆尾孢(Cercospora sojina))、小光壳属(leptosphaerulina)叶斑病(三叶草小光壳(Leptosphaerulina trifolii))、叶点霉属(phyllostica)叶斑病(大豆生叶点霉(Phyllosticta sojaecola))、荚和茎枯萎病(大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae))、白粉病(扩散叉丝壳(Microsphaera diffusa))、棘壳孢属(pyrenochaeta)叶斑病(大豆棘壳孢(Pyrenochaeta glycines))、丝核菌属地上部分、叶枯病和立枯病(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))、锈病(豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae))、痂病(大豆痂圆孢(Sphaceloma glycines))、匍柄霉属叶枯病(匍柄霉(Stemphylium botryosum))、靶斑病(target spot)(山扁豆生棒孢菌(Corynespora cassiicola))。

由以下引起的根部和茎基部的真菌病害：例如黑根腐病(black root rot)(丽赤壳菌(Calonectria crotalariae))；炭腐病(菜豆生壳球孢(Macrophomina phaseolina))；镰孢属枯萎病或萎蔫病、根腐病以及荚和根颈腐烂(尖镰孢(Fusarium oxysporum)、直喙镰孢(Fusarium orthoceras)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、木贼镰孢(Fusariumequiseti))；莲孢霉(mycoleptodiscus)根腐病(凤眼莲孢霉(Mycoleptodiscusterrestris))；新赤壳属(neocosmospora)(侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta))；荚和茎枯病(菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum))；茎溃疡(大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora))；疫霉属腐病(大雄疫霉(Phytophthoramegasperma))；褐茎腐病(大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata))；腐霉菌属腐病(瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、畸雌腐霉(Pythium irregular)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、群结腐霉(Pythium myriotylum)、终极腐霉(Pythium ultimum))；丝核菌属根腐病、茎腐和猝倒病(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))；核盘菌茎腐病(核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))；核盘菌白绢病(棉花白绢病(Sclerotinia rolfsii))；根串珠霉属根腐病(根串珠霉(Thielaviopsis basicola))。

本发明的杀真菌组合物可用于治疗性或保护性/预防性地防治植物病原真菌。因此，本发明也涉及通过使用本发明的组合物来防治植物病原真菌的治疗性和保护性方法，其中将所述组合物施用于种子、植物或植物部分、果实或植物所生长的土壤。

所述组合物在防治植物病害所需的浓度下可被植物良好的耐受，这一事实使得其能够处理植物的地上部分、繁殖的根状茎和种子以及土壤。

根据本发明可以处理所有植物和植物部分，包括栽培种和植物品种(无论是否受植物品种或植物育种者权利的保护)。栽培种和植物品种可为通过常规的繁殖和育种方法而获得的植物，所述常规的繁殖和育种方法可通过一种或多种生物技术方法来辅助或补充，例如通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定向诱变、分子或遗传标记物，或通过生物工程和基因工程方法。

在某些方面，本发明的组合物以以下量施用：每公顷约1×10

在其他方面，本发明的组合物以以下量施用：每公顷约1×10

在某些实施方案中，本发明的组合物以每公顷约0.1kg至约20kg发酵固体来施用。在一些实施方案中，本发明的组合物以每公顷约0.1kg至约10kg发酵固体来施用。在其他实施方案中，本发明的组合物以每公顷约0.25kg至约7.5kg发酵固体来施用。在其他实施方案中，本发明的组合物以每公顷约0.5kg至约5kg发酵固体来施用。本发明的组合物还可以每公顷约1kg或约2kg发酵固体来施用。

当被植物良好的耐受时，本发明的组合物具有有利的恒温动物毒性且可被环境良好的耐受，适用于保护植物和植物器官，用于提高收获产量，用于改善收获材料的品质。优选地将它们用作作物保护组合物。它们对一般敏感且具有抗性的物种具有活性，并且对所有的或一些发育阶段具有活性。

可以根据本发明进行处理的植物包括下列主要作物植物：玉米、大豆、苜蓿、棉花、向日葵、芸苔属(Brassica)油料种子(如欧洲油菜(Brassica napus)(例如加拿大油菜、油菜籽))、芜菁(Brassica rapa)、芥菜(B.juncea)(例如(田)芥菜)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、棕榈科种(Arecaceae sp.)(例如，油棕、椰子)、稻、小麦、甜菜、甘蔗、燕麦、黑麦、大麦、粟和高粱、小黑麦、亚麻、坚果、葡萄和藤本植物以及来自各种植物分类单位的各种水果和蔬菜，例如，蔷薇科种(Rosaceae sp.)(例如，仁果类水果(如苹果和梨)，还有核果类水果，(例如杏子、樱桃、扁桃、李子和桃)，以及浆果类水果(例如草莓、覆盆子、红醋栗和黑醋粟以及圆醋粟))、茶薦子科种(Ribesioidae sp.)、胡桃科种(Juglandaceae sp.)、桦木科种(Betulaceae sp.)、漆树科种(Anacardiaceae sp.)、壳斗科种(Fagaceae sp.)、桑科种(Moraceae sp.)、木犀科种(Oleaceae sp.)(例如橄榄树)、猕猴桃科种(Actinidaceae sp.)、樟科种(Lauraceae sp.)(例如，鳄梨、肉桂、樟脑)、芭蕉科种(Musaceae sp.)(例如，香蕉树和香蕉种植园)、茜草科种(Rubiaceae sp.)(例如，咖啡)、山茶科种(Theaceae sp.)(例如，茶)、梧桐科种(Sterculiceae sp.)、芸香科种(Rutaceaesp.)(例如，柠檬、橙、桔和葡萄柚)；茄科种(Solanaceae sp.)(例如，番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、茄子、烟草)、百合科种(Liliaceae sp.)、菊科种(Compositae sp.)(例如，莴苣、朝鲜蓟和菊苣(chicory)–包括根菊苣、菊苣(endive)或普通菊苣)、伞形科种(Umbelliferae sp.)(例如，胡萝卜、欧芹、芹菜和块根芹菜)、葫芦科种(Cucurbitaceae sp.)(例如，黄瓜–包括腌食用小黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦和甜瓜)、葱科种(Alliaceae sp.)(例如，韭和洋葱)、十字花科种(Cruciferae sp.)(例如，白甘蓝、红甘蓝、西兰花、花椰菜、抱子甘蓝、小白菜、球茎甘蓝(kohlrabi)、小萝卜、山葵、水芹和大白菜)、豆科种(Leguminosae sp.)(例如，花生、豌豆、扁豆和菜豆–例如，刀豆和蚕豆)、藜科种(Chenopodiaceae sp.)(例如，唐莴苣、饲用甜菜、菠菜、甜菜根)、亚麻科种(Linaceae sp.)(例如，大麻)、大麻科种(Cannabeacea sp.)(例如，印度大麻)、锦葵科种(Malvaceae sp.)(例如，秋葵、可可)、罂粟科(Papaveraceae)(例如，罂粟)、天门冬科(Asparagaceae)(例如，芦笋)；园艺和森林中的有用植物和观赏植物，包括草地、草坪、牧草和甜叶菊(Stevia rebaudiana)；以及在每种情况下这些植物的基因修饰型。

在某些方面，发酵产物还包含制剂成分。所述制剂成分可以是润湿剂、增量剂、溶剂、自发性促进剂、乳化剂、分散剂、防冻剂、增稠剂和/或佐剂。在一个实施方案中，所述制剂成分是润湿剂。在其他方面，发酵产物是冻干粉末或喷雾干燥的粉末。

本发明的组合物可以包括制剂成分，其被添加到本发明的组合物中以改善回收、功效或物理性质和/或帮助加工、包装和施用。这样的制剂成分可以单独或组合添加。

可以将制剂成分添加到包含细胞、无细胞制剂、分离的化合物和/或代谢产物的组合物中，以改善功效、稳定性和物理性质、可用性和/或促进加工、包装和终端使用应用。这样的制剂成分可以包括农业上可接受的载体、惰性物质、稳定剂、防腐剂、营养物或物理性质改良剂，它们可以被单独或组合添加。在一些实施方案中，载体可包括液体材料，例如水、油和其他有机或无机溶剂，以及固体材料，例如矿物质、聚合物或通过生物方法或通过化学合成获得的聚合物复合物。在一些实施方案中，制剂成分是促进组合物与植物部分(例如叶、种子或根)粘附的粘合剂、佐剂或胶粘剂。参见，例如，Taylor,A.G.,et al.,“Conceptsand Technologies of Selected Seed Treatments,”Annu.Rev.Phytopathol.,28:321-339(1990)。稳定剂可包括抗结块剂、抗氧化剂、抗沉降剂、消泡剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。营养物可以包括碳、氮和磷源，例如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改良剂可包括填充剂、润湿剂、增稠剂、pH修饰剂、流变改性剂、分散液、佐剂、表面活性剂、成膜剂、助水溶剂、增洁剂(builder)、防冻剂或着色剂。在一些实施方案中，可使用水作为稀释剂或不使用水，而没有任何其他制剂制品的情况下，直接使用包含细胞、无细胞制剂和/或通过发酵产生的代谢产物的组合物。在一个具体的实施方案中，将润湿剂或分散液添加至发酵固体，例如冻干粉末或喷雾干燥的粉末。在一些实施方案中，在浓缩发酵液之后和/或在干燥期间和/或干燥之后添加制剂惰性物质。当被施用到表面时，润湿剂提高活性成分的扩散和透过性质，或分散液提高活性成分的分散性和溶解性(一旦被稀释)。示例性的润湿剂是本领域技术人员已知的，且包括磺基琥珀酸酯及其衍生物，例如MULTIWET

保藏信息

本发明的类芽孢杆菌属种菌株的样品根据布达佩斯条约保藏在农业研究机构培养物保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)，其位于美国伊利诺伊州皮奥里亚市北部大学街1815号，美国农业部农业研究局，农业应用研究国家中心(NRRL)，邮编61604。类芽孢杆菌属种NRRL B-50972保藏于2014年8月28日。类芽孢杆菌属种NRRL B-67129保藏于2015年9月1日。类芽孢杆菌属种NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种NRRLB-67306均保藏于2016年7月22日。类芽孢杆菌属种NRRL B-67615保藏于2018年5月2日。

类芽孢杆菌属种菌株被保藏在这样的条件下，即确保在本专利申请的在审期间，由专利和商标专员根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122确定的有资格的人能够获得培养物。然而，应当理解，可获得保藏物并非许可在违背政府授予的专利权的情况下实施本发明。

以下给出的实施例仅用于本发明的说明性和非限制性目的。

实施例1.增强类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129及其突变衍生物的杀镰孢菌素产生

用1-甲基-3-硝基-1-硝基胍(NTG)或甲基磺酸乙酯(EMS)处理类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129以引入遗传变异。导致菌落形成单位(CFU)损失50-90％的处理被认为适合获得足够的遗传变异和活细胞，以用于后续筛选。来自经化学处理的种群的单个分离株在96孔深孔板(block)中进行培养，并筛选四种杀镰孢菌素样化合物的产生增加，即杀镰孢菌素A(也称为“Fus A”)、LiF08a、Paeniserine A1和B1(也因其分子量而被称为“M868”)；以及如WO 2016/154297中记载的Paeniprolixin A2和B2(也因其分子量而被称为“M938”)。

来自该初始筛选的具有明显提高的杀镰孢菌素水平的分离株在96孔深孔板中以技术性重复进行再次筛选，并被确认是过量生产者。随后将经确认的分离株扩大培养并分析杀镰孢菌素产生和生长特性(包括产生耐热细菌孢子的能力)。从初始轮筛选、确认和扩大培养，鉴定出了几种过量生产的分离株，并且对该分离株再次进行化学处理并筛选杀镰孢菌素产生的进一步提高。重复该过程几次。

进一步评估用该分析所鉴定的菌株，以确认杀镰孢菌素产生。简而言之，将每种菌株在大豆基培养基中培养，并提取全发酵液的亲脂性级分。通过高效液相层析(HPLC)分析全发酵液提取物，并基于由含有杀镰孢菌素A的标准样品产生的HPLC谱鉴定杀镰孢菌素A的存在。还评估了突变菌株产生耐热孢子的能力。

总共约10,000个衍生自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的分离株在96孔深孔板形式中进行筛选。该分析产生了数个目的分离株，其特征在于四种杀镰孢菌素样化合物的相对水平(参见表1)。对这些菌株进行了广泛表征，且与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129相比，类芽孢杆菌属种菌株J被鉴定为呈现提高的杀镰孢菌素产生和有利的生长特性(例如，孢子形成)。但是，类芽孢杆菌属种菌株J产生了使其难以加工的粘性发酵液。根据该观察结果，很明显有必要筛选突变菌株的在液体培养物中的粘度以及它们的杀镰孢菌素样化合物产生。

表1.来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129以及衍生自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的突变菌株的相对杀镰孢菌素产生

N.D.＝未检测到。如实施例2中所述，用斜体字体标识的菌株是在含有蔗糖的固体琼脂上具有非粘液样表型的菌株。

实施例2类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129突变衍生物的发酵液粘度的降低

类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129产生粘性发酵液培养物，如许多衍生自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的突变菌株一样。这些培养物的物理化学特性对发酵和下游加工提出了挑战。因此，需要鉴定出一种鉴定产生粘性较低的发酵液培养物的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的突变衍生物的方法。

蔗糖经常被类芽孢杆菌属种用作菌表多糖(EPS)产生的碳源，并且据报道，蔗糖的使用导致了高分子量Levan型EPS的显著产量(Liang and Wang.Mar.Drugs 2015,13,1847-1863)。已经发现高分子量EPS聚合物具有作为增稠剂的商业用途。与蔗糖一起，其他寡糖和多糖也被用作类芽孢杆菌属中EPS产生的碳源。

当类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129及其突变衍生物在补充有终浓度为0.25至0.5M的蔗糖的固体琼脂培养基(参见表2中的配方)上生长时，观察到明显的粘液样菌落表型。含有200g/L麦芽糖糊精的类似固体琼脂培养基也显示出粘液样菌落表型。

几种类芽孢杆菌属种菌株(包括土地类芽孢杆菌、巴西类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和皮尔瑞俄类芽孢杆菌的菌株)，在含蔗糖的固体琼脂培养基上产生粘液样表型(参见图2)。假设可以为非粘液样菌落分离株(这将导致具有降低的粘度和增强的物理特性发酵液培养物)建立快速的目视筛选。不希望受任何理论的束缚，粘液样菌落表型可能对应于类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129、其突变衍生物和其他深层培养的类芽孢杆菌属种菌株的EPS产生。

表2.用于鉴定粘液样表型的含有蔗糖的固体琼脂培养基配方

开发并验证了以下方案为用于鉴定非粘液样菌落分离株的快速目视筛选。对类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的杀真菌突变衍生物的液体培养物进行化学处理，然后稀释并接种到补充有蔗糖的固体琼脂培养基上以获得单菌落。非粘液样菌落与粘液样菌落易于通过肉眼区分开(参见图3)。挑取非粘液样分离株，并在补充有蔗糖的新鲜固体琼脂培养基上划线，以确认表型。

从衍生自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的过量产生杀镰孢菌素的亲本菌株中鉴定出八个非粘液样分离株。非粘液样分离株包括类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(参见图4)。八个分离株中的六个产生杀镰孢菌素生物标记物，其水平相当于或高于其各自的亲本菌株。另外，八个分离株中的五个能够产生耐热孢子，其水平与相同条件下的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129产生的水平相似。这些观察结果表明，与杀镰孢菌素产生、孢子形成和粘度产生剂(viscosity-producing agents)相关的细胞过程是遗传上可分离的。

在较大规模的培养物中评估了八个非粘液样分离株，并且发现两个非粘液样分离株(类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304)在大豆基的培养基中具有提高的杀镰孢菌素产生和有利的生长特性。分析这些菌株的压紧细胞体积(％PCV)及其粘度。

通过将1mL体积在2mL微量离心管中以17,000g离心3分钟来定量％PCV。根据管的刻度来确定压紧细胞体积百分比，将原始的1mL样品体积标记设置为100％。

或者，将约10mL的全发酵液置于15mL离心管中，记录全发酵液的重量(“W

％PCV＝100×(W

在粘度计上以50rpm测试发酵液的粘度，并以厘泊报告数值。

相对于类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972的发酵液的56厘泊(cP)，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304产生的发酵液的粘度分别为11.5和33.9cP(参见表3)。此外，与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972相比，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304产生更小的压紧细胞体积(PCV)(参见表3和图5)。这些结果验证了以下假设：在含有高水平多糖(如蔗糖或麦芽糖糊精)的固体培养基上进行的快速目视筛选可鉴定非粘液样菌落分离株，其导致具有降低的粘度且增强的物理特性的发酵液培养物。

来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的发酵液的改善的物理特性使得这些非粘液样菌株作为活的微生物基的产品具有增强的可加工性。发酵液的较低PCV和粘度可以使全发酵液材料的浓度更高，以降低农业应用中的使用率。

表3.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972和非粘液样衍生菌株的粘度和压紧细胞体积(PCV)。

实施例3.菌株改良分离株的突变分析

使用标准测序方法确定具有非粘液样表型的几个分离株的基因组序列。比较了分离株的单核苷酸多态性(SNP)。出人意料地，发现衍生自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129的八个非粘液样菌株种的五个(包括类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306)在degS degU区域的蛋白质密码子序列中具有突变(参见图6A)。这些突变落入DegU的受体结构域和DNA结合域内以及DegS的单结合结构域和ATP酶结构域内(见图6B-6C)。

假设在degS和degU中的这些突变与这些分离株在补充有蔗糖的固体琼脂平板上的非粘液样表型有关。为了验证，使用标准分子操作来制备该DNA构建体，以在亲本类芽孢杆菌属种菌株B-67129中，用卡那霉素盒替换degS基因并用卡那霉素盒替换degS和degU区域。

将编码卡那霉素抗性(kanR)的基因克隆到可接合的大肠杆菌-类芽孢杆菌穿梭质粒中，其侧翼是编码DegS基因的上游1kbp区域和编码DegS或DegU基因的下游1kbp，以由kanR靶向替换单独的degS或degS和degU。该质粒首先通过电穿孔引入到大肠杆菌菌株，然后通过接合移入到类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129。由质粒骨架编码的红霉素抗性被用于选择成功的质粒转移。卡那霉素抗性、红霉素敏感性和PCR验证用于确认双交换整合体。两种卡那霉素抗性标记物-替换菌株(类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129degS::kanR和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129degSdegU::kanR)模拟了先前选择的分离株的非粘液样表型(参见图7)。这些结果证实，导致非功能性基因产物的degS和degU中的突变产生非粘液样表型。

已经表征了degS和degU中的其他突变，并导致非功能性基因产物。与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972中的苏氨酸73相对应的枯草芽孢杆菌菌株168中的残基丝氨酸76，是一个刺激其激酶活性的磷酸化位点，，而将丝氨酸76突变为丙氨酸会显著降低DegS的酶促活性。参见Jers,C.et al.,“Bacillus subtilis Two-Component System SensoryKinase DegS is Regulated by Serine Phosphorylation in Its Input Domain,”PLoSONE(2011)6(2):e14653。与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972中的丙氨酸190相对应的枯草芽孢杆菌菌株168中的残基丙氨酸193突变为缬氨酸菌株基本上消除了DegS的激酶活性。参见Dahl,M.K.et al.,“The Phosphorylation State of the DegU Response RegulatorActs as a Molecular Switch Allowing Either Degradative Enzyme Synthesis orExpression of Genetic Competence in Bacillus subtilis,”J.Biol.Chem.(1992)267(20):14509。

导致天冬氨酸56(其与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972中的天冬氨酸63相对应)置换为天冬酰胺的degU突变阻止了DegS对DegU的磷酸化。参见Dahl,M.K.et al.,supra。对DegU的DNA结合结构域的丙氨酸扫描显示了五个常见突变，这些突变导致DegU与comK和aprE的启动子区域的结合严重降低，并随后导致这些基因的表达降低，以及三个其他突变抑制DegU与aprE的启动子区域结合，并随后降低该基因的表达。参见表4中的突变，其报道于Shimane et al.,“Mutational Analysis of the Helix-Turn-Helix Region ofBacillus subtilis Response Regulator DegU,and Identification of cis-ActingSequences for DegU in the aprE and comK Promoters,”J.Biochem.(2004)136(3):387-397.

根据用抗生素抗性盒替换degS基因或替换degS和degU基因的结果，得出的结论是，导致非功能性基因产物的degS或degU的任何突变(包括上述的那些)，与包含野生型DegU和野生型DegS的类芽孢杆菌属种菌株相比，将导致在液体培养物中具有降低的粘度和/或非粘液样菌落形态的类芽孢杆菌属种菌株。

表4.影响DegU的DNA结合功能的氨基酸置换

表5.DegU和DegS的氨基酸序列

表6.degU和degS的核苷酸序列

实施例4非粘液样菌株的进一步诱变和筛选

为了进一步提高杀镰孢菌素样化合物的效价，如实施例1所述，进行类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的化学处理。分析来自在96孔板中产生的培养液的样品中的杀镰孢菌素A的相对水平(参见表7)。然后在较大规模培养物中发酵后，选择出几个具有增加的杀镰孢菌素产生的分离株，用于进一步测试。再次分析来自这些较大规模培养物的样品中的杀镰孢菌素A含量(参见表8)，并如实施例2中所述测定其压紧细胞体积(参见表9)。仅用来自较大规模培养物的样品评估压紧细胞体积，因为来自96孔板的培养物不能为这些测量提供足够的体积。

出人意料地，发现了类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615不仅具有提高的杀镰孢菌素样化合物水平(参见表7和表8)，而且具有比类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304B-67304更低的粘度水平(参见表9)。这些结果进一步证实，与杀镰孢菌素生物合成、孢子形成和粘度产生剂的产生相关的细胞过程是遗传上可分离的。类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67129、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306的谱系在图1中示出。

表7. 96孔板中培养的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和衍生自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的突变菌株的相对杀镰孢菌素产生

表8.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和衍生自在较大体积下培养的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的突变菌株的相对杀镰孢菌素产生，报告为平均值±标准差(n＝2)

表9.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和衍生自在较大体积下培养的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的突变菌株的压紧细胞体积(PCV)，报告为平均值±标准差(n＝3)。在该实验中未评估类芽孢杆菌属种菌株Y

一起评估类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的相对杀镰孢菌素A水平、压紧细胞体积和粘度，以证实通过用所公开的方法进行的多轮诱变和筛选所获得的改善。呈现在表10中的结果证明，所公开的筛选方法导致突变衍生菌株，其在杀镰孢菌素产生中具有显著提高，并且具有较低的压紧细胞体积和粘度，以使得活性化合物在发酵液中的浓度更高。

表10.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的压紧细胞体积(PCV)、粘度和相对杀镰孢菌素A水平，报告为平均值±标准差(n＝3)

实施例5.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的生物活性的比较

类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304在大豆基的培养基中培养以产生全发酵液。将全发酵液在水和有机溶剂的混合物中稀释至2.5％、1.25％、0.625％和0.312％的浓度。将稀释的全发酵液施用于幼苗(young plant)，随后将其暴露于索兰尼链格孢(ALTESO)接种物。每个测定中都包含化学杀真菌剂，作为阳性对照。暴露于植物病原体接种物几天后，相对于未处理的对照植物，对每株植物的病原体防治百分比进行评分。评估每种处理，进行三次重复，并报告平均防治百分比(参见表11)。0％是指对应于未经处理的对照的效力，而100％的效力是指未观察到病害。与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972相比，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304具有优异的抗真菌活性。

表11.在稀释率分别为2.5％、1.25％、0.625％和0.312％下，用类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304获得的索兰尼链格孢(ALTESO)的防治

N.E.＝未评估

用类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615以及真菌病原体索兰尼链格孢(ALTESO)重复测定。如前所述进行该测定，不同之处在于评价六个重复样品而不是三个重复样品，并且以1.25％或0.625％施用全发酵液。表12中报告了由处理产生的平均防治百分比。在测定中，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615产生了相似水平的抗真菌活性。

表12.在1.25％和0.625％的稀释率下，用类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615获得的索兰尼链格孢(ALTESO)的防治

实施例6.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306和类芽孢杆菌属种菌株B-67304以及类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615对卵菌植物病原体的抗真菌活性

类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615在大豆基的培养基中培养以产生全发酵液。将全发酵液在水和有机溶剂的混合物中稀释至10％、5％、2.5％、1.25％和0.625％的浓度。将稀释的全发酵液施用于幼苗，随后将其暴露于古巴假霜霉菌(PSPECU)(也称为黄瓜霜霉病)或致病疫霉(PHYTIN)(也称为番茄晚疫病)的接种物。每个测定中都包含化学杀真菌剂，作为阳性对照。暴露于植物病原体接种物几天后，相对于未处理的对照植物，对每株植物的病原体防治百分比进行评分。评估每种处理，进行三次重复，并报告平均防治百分比(参见表13中的古巴假霜霉菌的结果和表14中的致病疫霉的结果)。0％是指对应于未处理的对照的效力，而100％的效力是指未观察到病害。所有三个类芽孢杆菌属种菌株都显示出对两种卵菌植物病原体的一致性防治。

表13.在稀释率分别为10％、5％、2.5％、1.25％和0.625％下，用类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615获得的古巴假霜霉菌(PSPECU)的防治

表14.在稀释率分别为10％、5％、2.5％、1.25％和0.625％下，用类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615获得的致病疫霉(PHYTIN)的防治

实施例7.感染早疫病(索兰尼链格孢)的马铃薯田间试验中类芽孢杆菌属菌株的比较。

对暴露于自然发生的早疫病(索兰尼链格孢)的马铃薯植物进行了田间试验。通过在大豆基的培养基中培养菌株并通过离心和移出上清液浓缩所得的全发酵液来制备类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306的液体发酵产物。如表16所示，在BBCH65至BBCH70的生长阶段，在7月20日至8月4日之间，将发酵产物以每公顷10升和每公顷20升施用于植物。在未经处理的植物中，病害的平均发生率约为13％。表15中所示的病害防治百分比是在最终施用后7天时通过目视观察病害症状进行评估的结果。0％是指对应于未处理的对照的效力，而100％的效力是指未观察到病害。

表15

表16

表15中的结果清楚地表明在该田间试验中，与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972相比，观察到的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306的活性更加优异。

实施例8.感染灰霉病(灰葡萄孢菌)的草莓田间试验中类芽孢杆菌属菌株的比较

对暴露于自然发生的灰霉病(灰葡萄孢菌)的草莓植物进行了田间试验。通过在大豆基的培养基中培养菌株并通过离心和移出上清液浓缩所得的全发酵液来制备类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的液体发酵产物。如表18所示，在BBCH67至BBCH87的生长阶段，在3月31日至4月18日之间，将发酵产物以每公顷10升和每公顷20升施用于植物。在未经处理的植物中，病害的平均发生率约为22％。表17中所示的病害防治百分比是在最终施用后2天时通过目视观察病害症状进行评估的结果。0％是指对应于未经处理的对照的效力，而100％的效力是指未观察到病害。

表17

表18

表17中的结果清楚地表明在该田间试验中，与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972相比，观察到的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的活性更加优异。

实施例9.感染炭疽病(辣椒刺盘孢菌(Colletotrichum capsici))的辣椒田间试验中类芽孢杆菌属菌株的比较。

对暴露于自然发生的炭疽病(辣椒刺盘孢菌)的辣椒植物进行了田间试验。通过在大豆基的培养基中培养菌株并通过离心和移出上清液浓缩所得的全发酵液来制备类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306的液体发酵产物。如表20所示，在BBCH75的生长阶段，在12月28日至1月2日之间，将发酵产物以每公顷10升和每公顷20升施用于植物。在未经处理的植物中，病害的平均发生率约为60％。表19中所示的病害防治百分比是在最终施用后2天时通过目视观察病害症状进行评估的结果。0％是指对应于未经处理的对照的效力，而100％的效力是指未观察到病害。

表19

表20

表19中的结果清楚地表明在该田间试验中，与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50972相比，观察到的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67306的活性更加优异。

实施例10.鉴定类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和NRRL B-67615的粘度差异的生长条件

如图1所示，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615是通过对类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的化学诱变产生的。这种化学诱变导致类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615具有显著降低的粘度，同时维持相对较高水平的杀镰孢菌素A(参见表10)。为了确定粘度差异的两个菌株的液体培养期间的时间点，每个菌株在大豆基的培养基中生长72小时。一组培养物以250rpm搅拌，另一组以300rpm搅拌。在第24小时、第32小时、第40小时、第48小时、第56小时和第72小时时取出每个液体培养物的样品。如实施例4所述，确定每个样品中的粘度和杀镰孢菌素A的相对水平。确定了在250rpm和300rpm下生长的培养物的平均值和标准差(n＝4)，并分别在图8A和8B中示出。

在72小时期间内，每种菌株产生的杀镰孢菌素A的相对水平是相当的，并且以相似的速率增加。在显微镜下目视评估所有样品中的孢子产生，并且在任何时间点均不存在孢子。选择40小时和48小时作为进一步实验的时间点是因为类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304的粘度显著增加，而类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615的粘度在该时间期间在较低水平上保持相对恒定(图8A和8B中比较显示粘度的实线)。在300rpm搅拌下生长的液体培养物的粘度值更加一致，因此也选择了该搅拌速率用于进一步实验。

实施例11.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和NRRL B-67615的液体培养物的蛋白质组学分析

使用类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)进行发现蛋白质组学和通路分析方法，以在分子水平深入了解粘度表型。菌株在摇瓶中在大豆基的培养基生长40小时和48小时，以捕获两种菌株的差异粘度表型。对于类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和NRRL B-67615，每种条件培养六个重复样品，总共24个样品。收获时，将样品立即在-80℃冷冻以停止生长，然后分批进行样品制备。在总发酵中进行蛋白提取，捕获分泌的和营养细胞蛋白。将总蛋白样品还原、烷基化并用胰蛋白酶消化，以产生用于蛋白质组学分析的总肽池。总肽样品通过液相色谱分离并用SCIEX 4600

为了创建离子库，首先在SCIEX’s Protein Pilot(5.0.1.0,4895)软件中对IDA运行进行了分析，以具有错误发现率(FDR)分析的完全ID模式运行。然后，使用SWATHmicroApp(2.0.1.2133)在SCIEX’sPeakView(2.2.0.11391)软件中创建了离子库，其总蛋白FDR为1％。使用SWATH microApp继续进行数据分析，SWATH运行的相对定量是以99％的肽置信度和1％的FDR阈值进行。然后将由每个肽的6个过渡和每个蛋白6个肽的总强度计算得出的蛋白质面积导出用于下游分析。蛋白质面积阈值设置为50,000。

主要目的是鉴定在单个时间点(40小时或48小时)在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304菌株(亲本)和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615菌株(子代)之间差异表达的蛋白质。目的是阐明被假设导致菌表多糖(EPS)产生和不同粘度表型的菌株之间的蛋白质水平的差异。首先使用SCIEX’s MarkerView(1.2.1)软件进行统计分析。探索性分析(包括绘制平均值1相对于平均值2以及Log(倍数变化)对于p值)未显示主要数据异常，且主成分分析显示样品按菌株和时间进行分组。为了确定菌株之间的差异蛋白表达，在Markerview中进行t检验，然后调整p值以进行R中的多重比较(FDR/BH校正)。在P(FDR/BH校正)<0.05且最小倍数变化＝1.5时，认为蛋白质差异表达。在第40小时检测到的442种蛋白质中，有54种蛋白质符合差异表达标准(参见表21)。在第48小时检测到的422种蛋白质中，有94种蛋白质被差异表达(参见表22)。

细菌菌表多糖的结构多样，由多种结构单元组成，并通过多种通路合成。表达也随菌株和环境(例如发酵过程)而变化。例如，已将类芽孢杆菌属的不同菌株表征为制备凝胶多糖(curdlan)型EPS和果聚糖型(levan)EPS，其分别由葡萄糖或葡萄糖和果糖组成。最初的蛋白质组学分析表明，鉴定为类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304菌株(亲本)和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615菌株(子代)中差异表达的蛋白质均不直接参与EPS合成，其通过与文献中所述蛋白质的同源性鉴定。

需要对蛋白质组学数据做进一步分析以解释类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和NRRL B-67615菌株之间的粘度表型差异。为了对由蛋白质组学分析观察到的蛋白质水平差异进行背景分析，蛋白质在KEGG(BLASTKOALA算法)中被进一步注释，并映射到KEGG通路。观察到，在48小时的时间点，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615菌株(子代)中参与糖酵解和三羧酸(TCA)循环的几种蛋白质均显著升高(参见表22中“子代中上调”一栏下带下划线的蛋白质)。这表明与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)相比，在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)中发生了升高的碳水化合物代谢。EPS产生依赖于与初级代谢相同的己糖单体(例如葡萄糖和果糖)。因此，初级代谢的增加将导致起始底物水平降低，从而导致类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)中EPS产生和粘度降低。

相反，当碳水化合物来源过多且起始底物丰富时，EPS产生和粘度将提高。与此想法相一致，在第40小时和第48小时，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)中两个不同的α-淀粉酶蛋白显著升高(参见表21和表22中在“亲本中上调”一栏下带下划线的蛋白质)。两种淀粉酶的氨基酸序列如表23所示。这两种淀粉酶具有“α-淀粉酶家族”(糖苷水解酶家族13)特有的蛋白质结构域。参见Cockburn et al.,Biologia 69(6):705-712,2014。

用在第40小时和第48小时时间点采集的样品定量了两种α-淀粉酶(即“α-淀粉酶#1”和“α-淀粉酶#2”)的相对表达，并呈现于图9A和9B中。相对蛋白质定量证明类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)始终比类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615菌株(子代)表达显著更多的α-淀粉酶。不希望受任何理论的束缚，其中培养菌株的大豆基的培养基含有多糖，这些淀粉酶将多糖转化为EPS产生所需的己糖单体。然后，丰富的底物可驱动类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)的液体培养物中的EPS产生和粘度增加。

表21.在第40小时，在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304菌株(亲本)和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)中差异表达的蛋白质[t-检验，P(FDR/BH-校正)<0.05；最小倍数变化＝1.5]。在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)中，两种α-淀粉酶(带下划线)的蛋白水平显著增加

表22.在第48小时，在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304菌株(亲本)和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)中差异表达的蛋白质[t-检验，P(FDR/BH-校正)<0.05；最小倍数变化＝1.5]。在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)中，两个α-淀粉酶(带下划线)的蛋白水平显著增加。在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)中，参与糖酵解或三羧酸(TCA)循环的几种酶(带下划线)上调

表23.在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)中上调的两种淀粉酶的氨基酸序列

实施例12.用类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)确认增加的淀粉酶活性

为了确认类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)的液体培养物具有比类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)更高水平的淀粉酶活性，这两种菌株均在大豆基的培养基中生长，并在第40小时和第48小时取出样品。将样品离心，保留上清液并无菌过滤以从培养基中除去所有细胞并留下细胞蛋白，包括淀粉酶和未消耗的多糖。上清液中的任何淀粉酶都将继续分解多糖并生成葡萄糖。从开始以及在28℃孵育5小时后，测量这些无细胞上清液中的葡萄糖量。

图10中呈现的葡萄糖测量值证实，当菌株在相似条件下生长时，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)的淀粉酶活性水平高于类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)。

实施例13.在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304和NRRL B-67615的液体培养物中添加葡萄糖

如果类芽孢杆菌属种菌株的液体培养物中己糖单体(例如葡萄糖、果糖)的可利用性限制了EPS的产生，其导致了这些培养物的粘度增加，则向培养物中添加葡萄糖应导致EPS的产生和粘度增加，并且这种效果对于类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)将最明显。为了检验该假设，在40小时时间点，向类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)的液体培养物分别添加0g/L葡萄糖(即对照)、2g/L葡萄糖、5g/L葡萄糖或10g/L葡萄糖。使对照和补充葡萄糖的液体培养物继续生长6小时，这时测定每种培养物中的粘度和残余葡萄糖浓度。

在除补充有10g/L葡萄糖的那些培养物以外的所有培养物中，残余葡萄糖浓度接近0g/L，这表明添加的葡萄糖被细胞消耗。培养物的粘度测量结值示于图11中。向类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304(亲本)培养物中添加葡萄对粘度影响很小，这可能是因为其高水平的淀粉酶活性以及可以从培养基中获得大量的葡萄糖。相比之下，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)补充葡萄糖的培养物的粘度增加，且由于添加的葡萄糖量增加而粘度增加(参见图11的右侧柱状图)。

总体而言，实验结果表明与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67304菌株(亲本)相比，类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67615(子代)中淀粉酶的表达和活性较低，这导致用于EPS产生的单糖(例如葡萄糖)减少和低粘度表型。

除非另外定义，否则本文中的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。所引用的所有出版物、专利和专利出版物因全部目的以引用的方式全文纳入本文。

应理解，所公开的发明不限于所述特定的方法、方案和材料，因为它们能够发生变化。还应理解，本文中所用的术语仅用于描述特定的实施方案，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅通过所附权利要求来限定。

本领域技术人员仅使用常规实验方法，就将了解或能够确定本发明的特定实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被以下权利要求所涵盖。

序列表

<110> Bayer CropScience LP

<120> 类芽孢杆菌属的突变体及其使用方法

<130> BCS169009 WO

<150> 62671067

<151> 2018-05-14

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 229

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 1

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<212> PRT

<213> 类芽孢杆菌属种（Paenibacillus sp.）

<400> 2

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<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

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<212> PRT

<213> 类芽孢杆菌属种

<400> 4

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aacgtaaatg gtgtggaagc tacaaaacag cttgtagagc tgtatcctga atctaaagta 240

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gctgagggcg gatcttacct ccatccgaag gttactcaca acctcgttaa cgaattccgc 420

cgccttgcaa caagcggagt ttctgcacac cctcaacatg aggtttaccc tgaaatccgc 480

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<213> 枯草芽孢杆菌

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<213> 类芽孢杆菌属种

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aatcaggaac tccagagcgt cctgaaggaa acggcagaaa cgattgaaaa ggtggaccag 180

ttggaaatga actatcggcg gtcccgtatt cggctgactg aggtcagccg tgactttgtc 240

cgctattcgg aagaggatat caagcaggct tacgagaaag caacacagct tcagctcgat 300

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<213> 类芽孢杆菌属种

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Lys Gly Lys Trp Lys Val Val Phe Ser Thr Ser Lys Asp Met Lys Val

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Lys Lys Gly Thr Val Val Ile Pro Ala Tyr Gly Ser Leu Ile Thr Lys

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530

<210> 10

<211> 949

<212> PRT

<213> 类芽孢杆菌属种

<400> 10

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945