一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用

摘要

本发明涉及一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，其中菲和芘联合有氧降解的共生菌群使用四种菌株，分别为假单胞菌属(Pseudomonas.sp,GenBank:GCA_000006765.1)、芽孢杆菌属(Bacillus.sp,GenBank:AY881640.1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp,GenBank:AB000106.1)、无色杆菌属(achromobacter.sp,GenBank:GCA_004296055.1)，其中构建方法为包括每种菌株的扩增培养方法，和强化培养基配方以及培养条件和操作方法，其中菲和芘联合有氧降解的共生菌群应用于反应器装置中的生物胞外聚合物，其中反应器装置包括管道、菌剂球组，菌剂球组内部负载四种菌株制作的生物胞外聚合物，本发明的优点在于有氧环境下实现化工废水中菲和芘的生物降解，处理过程无二次污染，不仅可节约资源且有利于保护生态环境，最终达到治理难降解有机物菲和芘的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及化工废水生物处理领域，具体涉及一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用。

背景技术

在石化工业废水的处理工艺中，持久性有机污染物是一类重要的污染物，因其具有环境持久性、生物累积性、长距离迁移能力和高生物毒性的四个特性而备受国际关注，对人类的身体健康以及环境造成了极大的威胁，目前己成为世界各国高度重视的环境问题。2013年8月，十二届全国人大常委会第四次会议批准《〈关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约〉新增列九种持久性有机污染物修正案》，截至2011年5月，已经列入斯德哥尔摩公约受控物质清单的共有22种物质，其中，多环芳烃(是由两个和两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的稠环化合物，是一类广泛存在于环境中的重要的有毒有机污染物)，具有极强致癌性、致突变性及致畸性和生物积累效应，难降解，分布广泛，具有疏水性、蒸汽压小及辛醇——水分配系数高的特点，当连接的苯环数目越多，其脂溶性增强，水溶性减小，正辛醇-水的分配系数也越大，因此很容易被吸附在土壤或沉积物中。通常是以固体状态存在环境，其存在时间越长，遗传毒性越高，致癌性亦随苯环数增加而培强由丁脂溶性高而很容易被动物的肠同吸收，并能通过食物链在动植物体内逐级富集，对人类身体健康具有很大的危害。

菲和芘等多环芳烃的生物毒性主要作用机制是：由于其化学结构特性，能稳定地吸收可见光和紫外线，所以它对紫外线福射的光化学效应极其敏感。在细胞内，有氧呼吸产生超氧阴离子自由基、羟基自由基会，对细胞组织造成一定的损伤，长时间暴露在紫外线和菲、芘联合作用下，超氧由基的形成速度翻倍提升，对细胞造成极大损伤。另外，在脂质体的过氧化的代谢中，自由基对细胞膜造成损伤，严重的还会对细胞内的细胞器(如核糖体、线粒体)造成严重的损伤，在蛋白结构变异、酶失去活性、断链等的长期影响下，细胞组织器官便逐渐发生病变。第三，生物体尤其是高等生物接触到菲和芘之后，会被生物体内细胞色素依赖的混合氧化酶系所氧化和羟基化，葡萄糖醛酸、谷氨酰胺等这些内源性分子会与菲和芘的不完全代谢物结合，形成更高毒性而且不易排放的中间产物，这些大分子经过混合氧化酶系的氧化作用，很多会直接转化为致癌物。据有关芳香径类致癌物的活性与结构研宄报告显示，及其产物是通过蛋白质的酮一稀醇互变异构过程中某一种催化作用，从而导致蛋白的不可逆转变，最终导致细胞癌变。

目前菲和芘的污水处理主要是化工污水中常用的芬顿氧化法或臭氧氧化法等化学方法，这个过程虽然与常规加氧生物降解相比，化学降解的速率较高，成本低，但是由于氧化的作用产生的中间产物分子量比母体大，只有部分能被完全转化为无毒、低分子量的产物，其他大部分仍滞留在环境中，造成二次污染。同时，许多有毒中间产物在产生后很难被生物利用，甚至具有更大的毒性，例如，芘是会转化成一种更有毒的中间体二醇芘，并造成毒性累积。

基于上述缺陷，发明一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，利用生物处理方式对含有菲和芘等多环芳烃的化工污水进行有效处理。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，菲和芘联合生物降解，苯并吡喃-2-羧酸，且进入生物循环，不产生有毒副产物积累，无二次污染，成本低廉，相比较于氧化法降解有很大优势。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，所述菲和芘联合有氧降解的共生菌群使用四种菌株，分别为假单胞菌属(Pseudomonas.sp,GenBank:GCA_000006765.1)、芽孢杆菌属(Bacillus.sp,GenBank:AY881640.1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp,GenBank:AB000106.1)、无色杆菌属(achromobacter.sp,GenBank:GCA_004296055.1)，所述构建方法为包括每种菌株的扩增培养方法，和强化培养基配方以及培养条件和操作方法，如下所述：

先将四种菌株分别接菌复苏，并在牛肉膏蛋白胨培养基扩增培养，23-24小时，牛肉膏蛋白胨的组成为：牛肉浸膏5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l，然后四种菌株分别按照以下步骤进行强化：

(一)假单胞菌属(Pseudomonas.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基A：可溶性淀粉20g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间1-3小时后，转入培养基B；步骤二，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基B：可溶性淀粉10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间5-8小时后，转入培养基C；步骤三，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基C：可溶性淀粉5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10-18小时后，转入培养基D；步骤四，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基D：可溶性淀粉1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10-18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(二)芽孢杆菌属(Bacillus.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间1-3小时后，转入培养基B；步骤二，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间5-8小时后，转入培养基C；步骤三，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基C：无水葡萄糖5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间10-18小时后，转入培养基D；步骤四，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间10-18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(三)鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基A-D：

步骤一，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间1-3小时后，转入培养基B；步骤二，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间5-8小时后，转入培养基C；步骤三，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基C：无水葡萄糖5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间10-18小时后，转入培养基D；步骤四，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间10-18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(四)无色杆菌属(Achromobacter.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基A：无水葡萄糖20g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间1-3小时后，转入培养基B；步骤二，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基B：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间5-8小时后，转入培养基C；步骤三，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基C：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10-18小时后，转入培养基D；步骤四，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10-18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

以上培养条件均选择PH6.0-8.0，培养温度为16-27℃。

优选地，所述菲和芘联合有氧降解的共生菌群应用于反应器装置中的生物胞外聚合物，以四种菌属其中的一种为例，所述生物胞外聚合物的制作方法为：

步骤一，发酵培养：用所述芽孢杆菌(Bacillus.sp)制备生物胞外聚合物产品，发酵培养的接种量以发酵培养基总重量计为0.5-2％，接种入胞外聚合物产生培养基，其中芽孢杆菌属(Bacillus.sp)胞外聚合物产生培养基的配方为：葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾7g/l、氯化钠0.1g/l、硫酸铵0.2g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l、结晶硫酸镁0.2g/l，培养时间7-12天，优选8天后，离心收集上清液，去除沉淀物，胞外聚合物产生培养基的培养温度为20-35℃，培养时间为40-120小时；

步骤二，提纯：先加2倍体积乙醇，离心后得到的沉淀溶解于100ml的去离子水，同时加入50ml的2％的氯化十六烷吡啶CPC，震荡3小时，3小时后，收集沉淀并溶解于100ml的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀，用乙醇洗脱并溶于5ml的去离子水，真空干燥得到产物即为纯化的生物胞外聚合物产品。

优选地，所述菌株与上清液震荡混合均匀即可得到由生物胞外聚合物载体负载的菌剂。

优选地，所述反应器装置包括管道、菌剂球组，所述管道为“弓”字形结构，所述菌剂球组位于管道内，所述菌剂球组包括若干个菌剂球一、菌剂球二、菌剂球三、菌剂球四，所述菌剂球一、菌剂球二、菌剂球三、菌剂球四均为空心的球体，且外表面设有一定数量的孔洞，所述菌剂球一内部填充有芽孢杆菌属胞外聚合物，所述菌剂球二内部填充有假单胞菌属胞外聚合物，所述菌剂球三内填充有鞘氨醇单胞菌属胞外聚合物，所述菌剂球四内填充有无色杆菌属胞外聚合物，所述菌剂球一、菌剂球二、菌剂球三、菌剂球四均间隔位于管道内壁。

优选地，所述管道中菌剂球组沿水流方向按照菌剂球一、菌剂球二、菌剂球三、菌剂球四的顺序依次排列。

本发明的有益效果为：

1.本发明克服了有许多菲芘化学氧化处理后，中间产物在产生后很难被生物利用，而且在单菌株好氧生物处理后，由于加氧酵的作用产生的中间产物分子量比母体大，只有部分能被完全转化为无毒、低分子量的产物，其他大部分仍滞留在环境中，甚至造成更大的危害。

2.本发明菲和芘联合生物降解，苯并吡喃-2-羧酸，且进入生物循环，后续循环可以被其他微生物好氧利用，最终分解，不产生有毒副产物积累，无二次污染，成本低廉，相比较于化学氧化法降解有很大优势。

3.本发明中的反应器装置占地面积小，内置载体球，内外装载菌剂，与同类反应器相比，接触面积最大化；同时实现菌剂灵活装载填充，内部小球数量可以自由增减，依据污染物和处理量进行灵活调整；小球载体负载菌剂装置可以实现回流及菌剂回收，利于运行过程中检测、调试和菌种优化。

4.本发明的生物胞外聚合物主要用于负载四种降解菌剂，具有多种用途，能够改善污泥的沉降性能，去除废水中的悬浮颗粒，处理含有高悬浮物的建筑材料加工废水，作用广泛，应用于多种污水处理领域。

附图说明

图1为本发明中反应器装置的结构示意图；

图2为本发明中反应器装置具体实施时的结构示意图；

图中所示附图标记为：1-菌剂球一、2-菌剂球二、3-菌剂球三、4-菌剂球四、5-管道、6-SBR反应器、7-阀门、8-排放水池、9-回流池、10-出水口、11-污泥回流口。

具体实施方式

以下结合附图对本设计方案进行详细说明。

一种菲和芘联合有氧降解的共生菌群的构建方法及其应用，其中菲和芘联合有氧降解的共生菌群使用四种菌株，分别为假单胞菌属(Pseudomonas.sp,GenBank:GCA_000006765.1)、芽孢杆菌属(Bacillus.sp,GenBank:AY881640.1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp,GenBank:AB000106.1)、无色杆菌属(achromobacter.sp,GenBank:GCA_004296055.1)，其中构建方法为包括每种菌株的扩增培养方法，和强化培养基配方以及培养条件和操作方法，如下所述：

先将四种菌株分别接菌复苏，并在牛肉膏蛋白胨培养基扩增培养，23-24小时，牛肉膏蛋白胨的组成为：牛肉浸膏5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l，然后四种菌株分别按照以下步骤进行强化：

(一)假单胞菌属(Pseudomonas.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基A：可溶性淀粉20g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间1-3小时后，转入培养基B；步骤二，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基B：可溶性淀粉10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间5-8小时后，转入培养基C；步骤三，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基C：可溶性淀粉5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10-18小时后，转入培养基D；步骤四，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基D：可溶性淀粉1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10-18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(二)芽孢杆菌属(Bacillus.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间1-3小时后，转入培养基B；步骤二，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间5-8小时后，转入培养基C；步骤三，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基C：无水葡萄糖5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间10-18小时后，转入培养基D；步骤四，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间10-18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(三)鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基A-D：

步骤一，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间1-3小时后，转入培养基B；步骤二，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间5-8小时后，转入培养基C；步骤三，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基C：无水葡萄糖5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间10-18小时后，转入培养基D；步骤四，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间10-18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(四)无色杆菌属(Achromobacter.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基A：无水葡萄糖20g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间1-3小时后，转入培养基B；步骤二，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基B：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间5-8小时后，转入培养基C；步骤三，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基C：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10-18小时后，转入培养基D；步骤四，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间10-18小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

以上培养条件均选择PH6.0-8.0，培养温度为16-27℃。

其中，菲和芘联合有氧降解的共生菌群应用于反应器装置中的生物胞外聚合物，以四种菌属其中的一种为例，生物胞外聚合物的制作方法为：

步骤一，发酵培养：用芽孢杆菌(Bacillus.sp)制备生物胞外聚合物产品，发酵培养的接种量以发酵培养基总重量计为0.5-2％，接种入胞外聚合物产生培养基，其中芽孢杆菌属(Bacillus.sp)胞外聚合物产生培养基的配方为：葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾7g/l、氯化钠0.1g/l、硫酸铵0.2g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l、结晶硫酸镁0.2g/l，培养时间7-12天，优选8天后，离心收集上清液，去除沉淀物，胞外聚合物产生培养基的培养温度为20-35℃，培养时间为40-120小时；

步骤二，提纯：先加2倍体积乙醇，离心后得到的沉淀溶解于100ml的去离子水，同时加入50ml的2％的氯化十六烷吡啶CPC，震荡3小时，3小时后，收集沉淀并溶解于100ml的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀，用乙醇洗脱并溶于5ml的去离子水，真空干燥得到产物即为纯化的生物胞外聚合物产品。

其中，菌株与上清液震荡混合均匀即可得到由生物胞外聚合物载体负载的菌剂。

其中，如图1-图2所示，反应器装置，包括管道5、菌剂球组，其中管道5为“弓”字形结构，菌剂球组位于管道5内，菌剂球组包括若干个菌剂球一1、菌剂球二2、菌剂球三3、菌剂球四4，菌剂球一1、菌剂球二2、菌剂球三3、菌剂球四4均为空心的球体，且外表面设有一定数量的孔洞，菌剂球一1内部填充有芽孢杆菌属胞外聚合物，菌剂球二2内部填充有假单胞菌属胞外聚合物，菌剂球三3内填充有鞘氨醇单胞菌属胞外聚合物，菌剂球四4内填充有无色杆菌属胞外聚合物，菌剂球一1、菌剂球二2、菌剂球三3、菌剂球四4均间隔位于管道5内壁。

其中，管道5中菌剂球组沿水流方向按照菌剂球一1、菌剂球二2、菌剂球三3、菌剂球四4的顺序依次排列。

其中，本装置应用时前端与SBR反应器6相连，尾端与排放水池8相连。

其中，菌剂球一1、菌剂球二2、菌剂球三3、菌剂球四4为了辨识，单独在其外表面进行标号。

其中，菌剂球一1、菌剂球二2、菌剂球三3、菌剂球四4数量可以自由增减，依据污染物和处理量进行灵活调整。

实施例

本发明经过广泛而深入的研究，经过大量的菌种筛选，和培养条件研究，最终确定四种菲和芘的优势降解菌，经过基因组测序，确定了GENEBANK ID，如下：假单胞菌属(Pseudomonas.sp,GenBank:GCA_000006765.1)、芽孢杆菌属(Bacillus.sp,GenBank:AY881640.1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp,GenBank:AB000106.1)、无色杆菌属(achromobacter.sp,GenBank:GCA_004296055.1)，假单胞菌为直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，可以用极生形式的鞭毛运动，不形成芽孢，化能异养，好氧。芽孢杆菌，杆状，能形成芽孢(内生孢子)，革兰氏阳性。鞘氨醇单胞菌为革兰氏阴性，无孢子，以单侧生极性鞭毛运动，呈黄色，专性需氧且过氧化氢酶呈阳性。无色杆菌为革兰染色阴性、杆状、无芽孢、菌落形态轻微隆起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑。

先将四种菌株分别接菌复苏，并在牛肉膏蛋白胨培养基扩增培养，23-24小时，牛肉膏蛋白胨的组成为：牛肉浸膏5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l，然后四种菌株分别按照以下步骤进行强化：

(一)假单胞菌属(Pseudomonas.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基A：可溶性淀粉20g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间2小时后，转入培养基B；步骤二，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基B：可溶性淀粉10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间6小时后，转入培养基C；步骤三，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基C：可溶性淀粉5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间12小时后，转入培养基D；步骤四，假单胞菌属(Pseudomonas.sp)培养基D：可溶性淀粉1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间12小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(二)芽孢杆菌属(Bacillus.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间小时后，转入培养基B；步骤二，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间6小时后，转入培养基C；步骤三，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基C：无水葡萄糖5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间12小时后，转入培养基D；步骤四，芽孢杆菌属(Bacillus.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钠2g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、无水葡萄糖30g/l，培养时间12小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(三)鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基A-D：

步骤一，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基A：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间2小时后，转入培养基B；步骤二，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基B：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间6小时后，转入培养基C；步骤三，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基C：无水葡萄糖5g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间12小时后，转入培养基D；步骤四，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、磷酸二氢钾7g/l、结晶硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.1g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l，培养时间112小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；

(四)无色杆菌属(Achromobacter.sp)驯化改良培养基A-D：

步骤一，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基A：无水葡萄糖20g/l、菲和芘各5mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间2小时后，转入培养基B；步骤二，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基B：无水葡萄糖15g/l、菲和芘各10mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间56小时后，转入培养基C；步骤三，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基C：无水葡萄糖10g/l、菲和芘各50mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间12小时后，转入培养基D；步骤四，无色杆菌属(Achromobacter.sp)培养基D：无水葡萄糖1g/l、菲和芘各500mg/L(溶于乙醇溶液10ml)、硝酸钾1g/l、氯化钠0.5g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、结晶硫酸镁1g/l、硫酸亚铁0.01g/l，培养时间112小时后，离心收集菌株；步骤五，将培养基D中的菌液进行离心收集，离心条件为：转数值1000-1200rpm，时长10分钟，或离心力1400-1600g，离心时长10分钟；以上培养条件均选择PH6.5-7.5，培养温度为23℃。

然后制作生物胞外聚合物：

步骤一，发酵培养：分别用四种经过驯化改良后的菌株制备生物胞外聚合物产品，发酵培养的接种量以发酵培养基总重量计为0.8-1.5％，接种入胞外聚合物产生培养基，其中胞外聚合物产生培养基的配方为：葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾7g/l、氯化钠0.1g/l、硫酸铵0.2g/l、尿素0.5g/l、酵母浸膏粉0.5g/l、结晶硫酸镁0.2g/l。培养时间7-12天，优选8天后，离心收集上清液，去除沉淀物，胞外聚合物产生培养基的培养温度为25-30℃，培养时间为80-100小时；

步骤二，提纯：先加2倍体积乙醇，离心后得到的沉淀溶解于100ml的去离子水，同时加入50ml的2％的氯化十六烷吡啶CPC，震荡3小时，3小时后，收集沉淀并溶解于100ml的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀，用乙醇洗脱并溶于5ml的去离子水，真空干燥得到产物即为纯化的生物胞外聚合物产品。

最后分别将四种生物胞外聚合物注入单独标号的菌剂球一1、菌剂球二2、菌剂球三3、菌剂球四4中，并按照顺序将这些菌剂球依次填充到管道5内，将管道5的前端与SBR反应器6通过阀门7相连，管道5的尾端与排放水池8相连，排放水池8上部设有出水口10，下部设有污泥回流口11，污泥回流口11与回流池9相连。

打开阀门7，污水进入，菌剂球组通过与污水接触，微生物繁殖，在球的内部形成膜结构，同时，随之膜增长，菌剂通过球体表面的孔洞繁殖于球的表面，形成网状致密表面，构成内外部三维立体结构，最大增加了污染物吸附接触面积，污水通过本装置后，菌剂球组发生作用，芘首先经过芘双加氧酶生成顺-5-二羟基-4,5-二氢芘。其经过二苯并噻吩二氢二醇脱氢酶生成顺式-1,2-二氢-1.2-二羟基芘。再经过4,5二羟基芘双加氧酶催化生成菲-4,5-二羧酸。再经过一个脱羧酶的催化生成菲-4-单羧酸。再经过双加氧酶催化生成菲二氢二醇-4-羧酸盐。产物经过脱氢酶的催化生成3,4-二羟基菲。产物在雌二醇双加氧酶作用下生成2-羟基·2H-苯并[h]苯并吡喃-2-羧酸。最终经过一些列酶的催化进入苯甲酸降解途径被彻底水解。而菲的降解首先经PAH双加氧酶的大亚基催化而生成顺式-3,4-二羟基-3-二氢菲。而该物质经双脱氢酶催化生成3,4-二羟基菲。最终与芘的降解信号通路汇合，经过相同的酶催化经由苯甲酸降解途径被水解，经过吸附分解污染物，污水进入排放水池8，经过沉淀，净化的水从出水口10排出，经过一定的时间，菌剂球组效果失效，吸附效果下降，菌剂球组伴随着污泥沉淀于排放水池8底部，并排放到回流池9中，沉淀的污泥和污泥回流是伴随菌剂球组回收，最大程度减少深度处理过程中污泥量，增大污泥回流和回收，同时菌剂球组可以回收再次培养驯化，四种不同菌剂负载于单独标号的菌剂球内部，可以分类单独回收不同菌剂，有利于再循环的实现。