一种流式细胞分选仪及流式细胞分选方法

摘要

本发明实施例公开了一种流式细胞分选仪及流式细胞分选方法，包括液滴延迟时间测量模块和液滴分流模块；所述液滴延迟时间测量模块用于根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间；所述液滴延迟时间测量模块前馈所述液滴延迟时间至所述液滴分流模块，以控制所述液滴被充电的时间。采用上述技术方案，通过液滴延迟时间测量模块根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间；并将液滴延迟时间前馈至液滴分流模块，保证液滴分流模块可以准确获知液滴的延迟时间，准确控制液滴被充电的时间，保证被充电的液滴可以准确进入液滴分选通道，保证液滴分选精确度高，进而保证位于液滴内的细胞分选精确度高。

说明书

技术领域

本发明实施例涉及细胞分选技术领域，尤其涉及一种流式细胞分选仪及流式细胞分选方法。

背景技术

流式细胞分选仪属于典型的颗粒分析分选设备，该设备依赖于液体流动流中的细胞或其他颗粒的流动确定所研究的颗粒的一个或多个特征。例如，将包含细胞的液体样品以快速移动的液体流形式通过流式细胞仪，使得每个细胞连续地通过感测区域获得细胞的特征信息，之后，通过对包含细胞的液滴充电，充电后的液滴在后续电场的作用下偏转，实现细胞分选。

液滴充电时间是通过液滴延迟时间确定的，现有技术中液滴延迟时间无法直接测量，是通过对分选得到的细胞中包含的信息进行大量数据处理来推断液滴延迟时间是否准确，耗时长，微球等实验用品消耗大，且效率低；同时无法实时获取液滴的延迟时间。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供一种流式细胞分选仪及流式细胞分选方法，用于直接测量液滴延迟时间，准确控制液滴的充电时间，细胞分选精确度高，提高分选效率。

第一方面，本发明实施例提供了一种流式细胞分选仪，包括液滴延迟时间测量模块和液滴分流模块；

所述液滴延迟时间测量模块用于根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间；

所述液滴延迟时间测量模块前馈所述液滴延迟时间至所述液滴分流模块，以控制所述液滴被充电的时间。

可选的，所述液滴延迟时间测量模块包括检测点测量子模块、断裂点测量子模块和液滴延迟时间计算子模块；

所述检测点测量子模块用于测量所述液流经过液流检测点的第一时间；

所述断裂点测量子模块用于测量所述液流断裂形成液滴的第二时间；

所述液滴延迟时间计算子模块用于根据所述第一时间和所述第二时间计算液滴延时时间。

可选的，所述检测点测量子模块用于探测所述液流经过所述液流检测点的第一检测信号；

所述断裂点测量子模块包括断裂位置监测单元；所述断裂位置监测单元用于确定所述液滴断裂点位置；所述断裂点测量子模块用于探测所述液滴经过所述液滴断裂点位置的第二检测信号；

所述液滴延迟时间计算子模块用于记录所述第一检测信号的第一接收时间以及所述第二检测信号的第二接收时间，并根据所述第一接收时间和所述第二接收时间计算液滴延时时间。

可选的，所述第一检测信号和所述第二检测信号均为探测颗粒所激发的荧光信号；

或者，所述第一检测信号和所述第二检测信号均为探测颗粒所激发的散射信号。

可选的，所述断裂位置监测单元包括监测相机和频闪光源；

所述监测相机用于获取液滴运动图像；

所述频闪光源用于为所述监测相机提供照明信号。

可选的，所述频闪光源包括发光二极管或者半导体激光器，且所述频闪光源的曝光时间与液流速度匹配。

可选的，所述曝光时间T满足T<5μs。

可选的，所述检测点测量子模块包括第一激光光源和前向检测信号接收单元。

可选的，所述断裂点测量子模块包括第二激光光源，所述第二激光光源的出射角度可调。

可选的，所述检测点测量子模块还包括遮光光阑，所述遮光光阑用于遮挡所述第一激光光源发出的激光光束直射至所述前向检测信号接收单元。

可选的，所述液滴延迟时间测量模块还包括光路反射镜组，所述光路反射镜组用于将所述第一激光光源反射至所述液滴断裂点，以激发经过所述液滴断裂点的探测颗粒；

所述光路反射镜组姿态可调整。

可选的，所述光路反射镜组包括第一反射镜和第二反射镜，所述第一反射镜位于所述第一激光光源的光路上，用于反射所述第一激光光源出射的激光光束形成第一反射光束；所述第二反射镜位于所述第一反射光束的光路上，用于反射所述第一反射光束形成第二反射光束，并控制所述第二反射光束至少入射至所述液滴断裂点。

可选的，所述第一反射镜和第二反射镜的角度可调整。

可选的，所述光路反射镜组还包括第一滤光片；

所述第一滤光片位于所述第一反射光束的光路上，用于滤除所述第一反射光束中的干扰光；或者所述第一滤光片位于所述第二反射光束的光路上，用于滤除所述第二反射光束中的干扰光。

可选的，述第一反射镜包括平面反射镜，所述第二反射镜包括平面反射镜，

或者所述第一反射镜包括球面反射镜，所述第二反射镜包括球面反射镜。

可选的，所述第一反射镜包括平面反射镜，所述第二反射镜包括平面反射镜，所述光路反射镜组还包括放大镜头；

所述放大镜头位于所述第一反射光束的光路上。

可选的，所述前向检测信号接收单元包括前向镜头，所述第一反射镜位于所述前向镜头的焦平面位置处。

可选的，所述第一激光光源用于出射第一激光光束和第二激光光束；

所述第一反射镜用于反射所述第一激光光束形成第三反射光束，反射所述第二激光光束形成第四反射光束；

所述第二反射镜分别位于所述第三反射光束和所述第四反射光束的光路上，用于反射所述第三反射光束至所述液流流动路径上的第一位置，反射所述第四反射光束至所述液流流动路径上的第二位置，其中，所述第一位置位于所述液流检测点和所述第二位置之间，所述第二位置位于所述液滴断裂点靠近所述液流检测点的一侧，或者所述第二位置与所述液滴断裂点重合。

可选的，所述液滴延迟时间测量模块还包括液滴测速子模块，所述液滴测速子模块用于根据所述第一位置、第二位置、所述第三反射光束入射至所述第一位置的时间以及所述第四反射光束入射至所述第二位置的时间确定所述液流是否达到稳定稳定状态。

可选的，所述液滴测速子模块具体用于根据所述第三反射光束入射至所述第一位置的时间以及所述第四反射光束入射至所述第二位置的时间计算所述液滴在所述第一位置和所述第二位置之间的第一平均速度，并在所述第一平均速度满足预设要求时确定所述液流达到稳定运动状态。

可选的，所述液滴测速子模块包括第二滤光片、第一探测镜头、第一视场光阑、第二视场光阑、第一探测器和第二探测器；所述第二滤光片和所述第一探测镜头同时位于所述第一探测器和所述第二探测器的探测路径上；所述第一视场光阑位于所述第一探测器的探测路径上；所述第二视场光阑位于所述第二探测器的探测路径上。

可选的，所述检测点测量子模块包括前向检测信号接收单元和/或侧向检测信号接收单元；

所述前向检测信号接收子单元包括前向镜头和前向探测器；

所述侧向检测信号接收子单元包括侧向镜头和侧向探测器。

可选的，所述流式细胞分选仪还包括液流储存模块、液滴形成模块和液滴分选模块；

所述液流储存模块用于储存所述液流，所述液流流经所述液滴形成模块并在所述液滴断裂点位置断裂形成液滴；

所述液滴分选模块包括偏转电极板和液滴接收试管，所述偏转电极板用于控制充电后的所述液滴进行偏转，所述液滴接收试管用于接收偏转后的所述液滴。

第二方面，本发明实施例还提供了一种流式细胞分选仪，包括液滴测速模块；

所述液滴测速模块包括第三激光光源，所述第三激光光源用于出射第三激光光束和第四激光光束，所述第三激光光束入射至液流流动路径上液滴测速的第三位置，所述第四激光光束入射至所述液流流动路径上液滴测速的第四位置；

所述液滴测速模块用于根据所述第三位置、所述第四位置、所述第三激光光束入射至所述第三位置的时间以及所述第四激光光束入射至所述第四位置的时间确定液流是否达到稳定稳定状态。

可选的，所述液滴测速模块具体用于根据所述第三激光光束入射至所述第三位置的时间以及所述第四激光光束入射至所述第四位置的时间计算所述液滴在所述第三位置和所述第四位置之间的第二平均速度，并在所述第二平均速度满足预设要求时确定所述液流达到稳定运动状态。

可选的，所述液滴测速模块还包括第四滤光片、第二探测镜头、第三视场光阑、第四视场光阑、第四探测器和第五探测器；所述第四滤光片和所述第二探测镜头同时位于所述第四探测器和所述第五探测器的探测路径上；所述第三视场光阑位于所述第四探测器的探测路径上；所述第三视场光阑位于所述第五探测器的探测路径上。

第三方面，本发明实施例还提供了一种流式细胞分选方法，应用于流式细胞分选仪，所述流式细胞仪包括检测点测量模块、液滴延迟时间测量模块和液滴分流模块；所述流式细胞分选方法包括：

所述检测点测量模块在液流经液流检测点时获取样本的光学探测信号，根据所述光学探测信号获取分选目标信息；

所述液滴延迟时间测量模块根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间；所述液滴分流模块接收所述分选目标信息和所述液滴延迟时间，根据所述液滴延迟时间对分选目标进行分选充电。

可选的，所述流式细胞分选仪还包括液流测速模块，当所述液流测速模块测量液流速度达稳定状态时，确定所述液滴延迟时间测量模块所测得的液滴断裂点为准确的液滴断裂点。

本发明实施例提供的流式细胞分选仪及流式细胞分选方法，流式细胞分选仪包括液滴延迟时间测量模块和液滴分流模块；通过液滴延迟时间测量模块根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间；并将液滴延迟时间前馈至液滴分流模块，保证液滴分流模块可以准确了解液滴的延迟时间，准确控制液滴被充电的时间，保证被充电的液滴可以准确进入液滴分选通道，保证液滴分选精确度高，进而保证位于液滴内的细胞分选精确度高。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是现有技术中一种流式细胞分选仪的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的一种流式细胞分选仪的结构示意图；

图3是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的结构示意图；

图4是本发明实施例提供的一种流式细胞分选仪实体装置结构示意图；

图5是本发明实施例提供的一种液滴图像的示意图；

图6是本发明实施例提供的液滴延迟时间示意图；

图7是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图；

图8是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图；

图9是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图；

图10是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图；

图11是本发明实施例提供的另一种液滴图像的示意图；

图12是本发明实施例提供的液流流经第一位置和第二位置的时间示意图；

图13是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图；

图14是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图；

图15是本发明实施例提供的另一种液滴图像的示意图；

图16是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的结构示意图；

图17是本发明实施例提供的一种流式细胞分选方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下将结合本发明实施例中的附图，通过具体实施方式，完整地描述本发明的技术方案。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下获得的所有其他实施例，均落入本发明的保护范围之内。

图1是现有技术中一种流式细胞分选仪的结构示意图，如图1所示，流式细胞分选仪包括充电单元1、偏转电极板2、收集试管3和废液收集仓4，液滴在液滴断裂点位置被充电单元1充电，充电后的液滴在偏转电极板2的作用下发生偏转，最终被收集试管3收集，未被充电的液滴落入废液收集仓4中。在细胞分选过程中，需要准确获知液滴延迟时间，保证准确获知液滴被充电的时间。如果液滴延时准确，则包含荧光信号的液滴只出现在分选通道；如果液滴延时不准确，则在非分选通道(即废液收集仓)中也能检测到荧光信号。现有技术中一种获知液滴延迟时间的方案是通过能量探测的方式来判断液滴延时是否正确，这种探测方式不是实时探测，而是通过统计的方法进行分析，这种方法的局限性在于需要不断调整液滴延时的时间，通过对大量数据进行统计分析来判断液滴充电是否正确，耗时长，探测颗粒等实验用品消耗大且效率低。现有技术中另一种获知液滴延迟时间的方案是通过废液收集仓中探测颗粒的荧光信号来自动获取液滴延时，具体是在指定的液滴延时范围内，测量不同液滴延时对应的废液中荧光信号强度，结合后续数据处理，荧光信号强度最低对应的液滴延时就是系统的最佳液滴延时时间。这种数据需要对大量的数据进行处理计算，不能直接测出液滴延时，耗时长，探测颗粒等实验用品消耗大且效率低。

基于此，本发明实施例提供一种流式细胞分选仪，包括液滴延迟时间测量模块和液滴分流模块；液滴延迟时间测量模块用于根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间；液滴延迟时间测量模块前馈所述液滴延迟时间至液滴分流模块，以控制液滴被充电的时间。本发明实施例提供的流式细胞分选仪，通过液滴延迟时间测量模块直接测量液滴延迟时间，并将液滴延迟时间前馈给液滴分选模块，液滴分选模块可以准确获知液滴延迟时间，保证准确在液滴断裂点对液滴进行充电，液滴充电时间控制准确，保证液滴分选准确，液滴分选效率高；并且区别于现有根据液滴的分选情况反向推测液滴延迟时间的方法无需多次重复操作反向推测液滴延迟时间，液滴延迟时间测量准确，液滴延迟时间测量简单且节省耗材。

以上是本发明的核心思想，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

图2是本发明实施例提供的一种流式细胞分选仪的结构示意图，如图2所示，本发明实施例提供的流式细胞分选仪包括液滴延迟时间测量模块10和液滴分流模块20；液滴延迟时间测量模块10用于根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间；液滴延迟时间测量模块10前馈液滴延迟时间至液滴分流模块20，以控制液滴被充电的时间。

示例性的，液滴断裂点可以理解为液体在流动过程中由液流形态变化为液滴形态的位置，液滴延迟时间测量模块10用于根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间。具体的，可以将液体进入液流储存模块的时间确定为液滴延迟时间的起始时刻，将液流流经检测点的时间确定为液滴延迟时间的起始时刻，将液体由液流形态变化为液滴形态的时间确定为液滴延迟时间的终止时刻，根据起始时刻与终止时刻确定液滴延迟时间；或者，将液体由液流形态变化为液滴形态的时间确定为液滴延迟时间的终止时刻，根据起始时刻与终止时刻确定液滴延迟时间，本发明实施例对如何确定液滴延迟时间的起始时刻不进行限定。液滴延迟时间测量模块10将获取的液滴延迟时间前馈给液滴分流模块20，液滴分流模块20准确掌握液滴延迟时间，在细胞分选开始时，根据液滴延迟时间确定液滴被充电的时间，保证液滴在液滴断裂点位置被充电，被充电的液滴在偏转电极板的作用下发生偏转，准确进入分选通道，保证液滴分选精确度高。

可以理解的是，本发明实施例提供的流式细胞分选仪，液滴延迟时间测量模块工作于细胞正式分选之前的过程中，液滴分流模块工作于细胞正式分选的过程中。通过液滴延迟时间测量模块在细胞分选正式开始之前确定液滴延迟时间，并将液滴延迟时间前馈给液滴分流模块，液滴分流模块在细胞分选正式过程中根据液滴延迟时间确定液滴被充电的时间，保证准确在液滴断裂点对液滴进行充电，液滴充电时间控制准确，保证液滴分选准确，液滴分选效率高。

综上，区别于现有技术中根据液滴的分选情况反向推测液滴延迟时间的方法，本发明实施例提供的流式细胞分选仪，通过液滴延迟时间测量模块直接测量液滴延迟时间，并将液滴延迟时间前馈给液滴分选模块，液滴分选模块可以准确掌握液滴延迟时间，保证准确在液滴断裂点对液滴进行充电，液滴充电时间控制准确，保证液滴分选准确，液滴分选效率高；并且区别于现有根据液滴的分选情况反向推测液滴延迟时间的方法无需多次重复操作反向推测液滴延迟时间，液滴延迟时间测量准确，液滴延迟时间测量简单且节省耗材。

可选的，图3是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的结构示意图，如图3所示，在上述实施例的基础上，液滴延迟测量模块10可以包括检测点测量子模块11、断裂点测量子模块12和液滴延迟时间计算子模块13；检测点测量子模块11用于测量液流经过液流检测点的第一时间；断裂点测量子模块12用于测量液流断裂形成液滴的第二时间；液滴延迟时间计算子模块13用于根据第一时间和第二时间计算液滴延时时间。

示例性的，本发明实施例以液流流经检测点的时间确定为液滴延迟时间的起始时刻。具体的，检测点测量子模块11用于测量液流流经液流检测点的第一时间，液流检测点可以为液流储存模块中位于液滴断裂点之前的一个检测位置，将液流流经液流检测点的时间记录为第一时间；断裂点测量子模块12用于测量液流断裂形成液滴的第二时间，将液流流经液滴断裂点的时间记录为第二时间；液滴延迟时间计算子模块13用于根据第一时间和第二时间计算液滴延时时间，具体用于根据第二时间与第一时间的差值计算液滴延迟时间。

在上述实施例的技术上，图4是本发明实施例提供的一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图，图5是本发明实施例提供的一种液滴图像的示意图，图6是本发明实施例提供的液滴延迟时间示意图，结合图4-图6所示，检测点测量子模块11用于探测液流经过液流检测点的第一检测信号；断裂点测量子模块12包括断裂位置监测单元121；断裂位置监测单元121用于确定液滴断裂点位置；断裂点测量子模块12用于探测液滴经过液滴断裂点位置的第二检测信号；液滴延迟时间计算子模块用于记录第一检测信号的第一接收时间以及第二检测信号的第二接收时间，并根据第一接收时间和第二接收时间计算液滴延时时间。

示例性的，如图4所示，检测点测量子模块11可以包括第一激光光源111和前向检测信号接收单元112，第一激光光源111用于向液流检测点A1出射第一激光信号，第一激光信号激发液流中的探测颗粒产生第一荧光信号，前向检测信号接收单元112用于接收第一荧光信号，其中，第一荧光信号即为第一检测信号。其中，第一激光光源111可以是1个单波长激光器，通过更换不同波长的激光器选择照明激发波长；也可以是多个激光器，同时用作照明激发光源，或者选择特定波长组合作为照明激发光源；也可以是白光激光器，通过分光/滤光装置，选择特定波长作为照明激发光源，本发明实施例对此不进行限定。探测颗粒可以为标准尺寸的微球，微球直径可以为1μm、3μm、5μm或者其它尺寸，本发明实施例对此不进行限定。

断裂点测量子模块12可以包括断裂位置监测单元121、第二激光光源122和第二检测信号接收单元123；断裂位置监测单元121用于确定液滴断裂点A2位置。第二激光光源122用于向液滴断裂点A2位置处出射第二激光信号，第二激光信号激发液滴中的探测颗粒产生第二荧光信号，第二检测信号接收单元123用于接收第二荧光信号，其中，第二荧光信号即为第二检测信号。

液滴延迟时间计算子模块(图中未示出)分别与前向检测信号接收单元112和第二检测信号接收单元123通信连接，用于记录第一检测信号的第一接收时间T1以及第二检测信号的第二接收时间T2，并将第一接收时间T1和第二接收时间T2之间的差值△T确定为液滴延时时间，如图6所示。进一步的，液滴延迟时间计算子模块还用于将液滴延时时间△T前馈给液滴分流模块20，在细胞分选正式开始时，液滴分流模块20中可以预存第一检测信号的第一接收时间T1，并在液滴延时时间△T到达时，在液滴断裂点对液滴进行充电，液滴充电时间控制准确。

可选的，如上所述，第一检测信号和第二检测信号可以均为探测颗粒所激发的荧光信号，或者，第一检测信号和第二检测信号还可以为探测颗粒所激发的散射信号，散射信号中可以包括偏振信息，例如第一检测信号还可以为探测颗粒在液流检测点A1所激发的第一前向散射信号，第二检测信号还可以为探测颗粒在液滴断裂点A2所激发的第二前向散射信号。本发明实施例对第一检测信号和第二检测信号的具体类型不进行限定，只要保证前向检测信号接收单元112在液流检测点A1可以接收到探测颗粒基于第一激光信号的激发信号即可，第二检测信号接收单元123在液滴断裂点A2可以接收到探测颗粒基于第二激光信号的激发信号即可。

可选的，继续参考图4所示，断裂位置检测单元121可以包括监测相机1211和频闪光源1212；其中，监测相机1211可以用于获取液滴运动图像；频闪光源1212用于为监测相机1211提供照明信号。

示例性的，为了准确确定液滴断裂点A2的位置，可以采用监测相机1211在液滴断裂点附近区域对液流流动情况进行监测，获取液滴运动图像，根据液滴运动图像，清楚地确定液滴断裂点的位置。液滴运动图像包括液滴断裂前运动和液滴断裂后运动图像两部分，其中断裂点为正好要断裂的液滴。进一步的，第二激光光源122的出射角度可调，通过调整第二激光光源122的出射角度，使得第二激光信号的照射光斑正好位于液滴断裂点A2位置处液滴的正中心，如图5所示。第二激光信号照射到液滴时，液滴的散射光被监测相机1211接收，使得液滴断裂点A2中心出现一个亮光斑。当探测颗粒流经照射光斑时，被激发的荧光信号被第二检测信号接收单元123接收。

进一步的，在监测相机1211的监测过程中，为了获取清晰的液滴运动图像，断裂位置检测单元121还可以包括频闪光源1212，频闪光源1212用于为监测相机1211提供照明信号，保证监测相机1211的监测区域处于明场状态下，保证液滴运动图像清晰。可选的，频闪光源1212可以包括发光二极管或者半导体激光器，且频闪光源1212的曝光时间与液流速度匹配，保证在频闪光源1212的曝光时间内，监测相机1211可以获取清晰的液滴运动图像。进一步的，曝光时间T可以满足T<5μs。

可选的，继续参考图4所示，本发明实施例提供的检测点测量子模块11还可以包括第一遮光光阑113，第一遮光光阑113用于遮挡第一激光光源111发出的激光光束直射至前向检测信号接收单元112，保证前向检测信号接收单元112接收到的第一检测信号仅为探测颗粒基于第一激光信号激发得到的荧光信号或者前向散射光信号，避免第一激光光源111发出的激光光束直射至前向检测信号接收单元112，对第一检测信号造成干扰，保证第一接收时间T1准确。

可选的，继续参考图4所示，本发明实施例提供的检测点测量子模块11还可以包括照明镜头114，照明镜头114用于对第一激光信号进行调整，例如调整第一激光信号的聚焦度和发散角，保证第一激光信号聚焦效果良好。进一步的，照明镜头114可以包括柱面镜、棱镜或者衍射光学元件，本发明实施例对照明镜头114的具体类型不进行限定。

可选的，继续参考图4所示，本发明实施例提供的断裂点测量子模块12还可以包括第二遮光光阑124，第二遮光光阑124位于第二激光信号的出射路径上，第二遮光光阑124可以自动切换为打开和关闭两种状态。当第二遮光光阑124处于打开状态，通过调整第二激光光源122的出射角度可以在液滴断裂点A2中心出现一个亮光斑，监测相机1211才能获得液滴断裂点A2中心亮光斑的图案。

可选的，图7是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图，如图7所示，本发明实施例提供的液滴延迟时间测量模块10还可以包括光路反射镜组115，光路反射镜组115用于将第一激光光源111反射至液滴断裂点A2，以激发经过液滴断裂点A2的探测颗粒；光路反射镜组115姿态可调整。

示例性的，如图7所示，除了可以设置第一遮光光阑避免第一激光光源111发出的第一激光信号直射至前线检测信号接收单元112之外，还可以在第一激光信号的传播路径上设置光路反射镜组115，光路反射镜组115将第一激光信号反射至液滴断裂点A2，在液滴断裂点A2激光探测颗粒产生第二检测信号，如此不仅可以得到第二接收时间，同时第一激光光源111复用为第二激光光源122，保证节省一套激光设备，简化流式细胞分选仪的结构，降低流式细胞分选仪的成本。

进一步的，光路反射镜组115姿态可调整，通过调整光路反射镜组115姿态，使得经光路反射镜组115的第一激光信号的照射光斑正好位于液滴断裂点A2位置处液滴的正中心，使得液滴断裂点A2中心出现一个亮光斑，保证监测相机1211可以获得液滴断裂点A2中心亮光斑的图案；并且当探测颗粒流经照射光斑时，被激发的荧光信号被第二检测信号接收单元123接收。

具体的，继续参考图7所示，光路反射镜组115可以包括第一反射镜1151和第二反射镜1152，第一反射镜1151位于第一激光光源的光路上，用于反射第一激光光源111出射的激光光束形成第一反射光束；第二反射镜1152位于第一反射光束的光路上，用于反射第一反射光束形成第二反射光束，并控制第二反射光束至少入射至液滴断裂点A2。

示例性的，可以设置光路反射镜组115包括至少两个反射镜实现将第一激光光源111发出的激光光束反射至液滴断裂点，图7以光路反射镜组115包括第一反射镜1151和第二反射镜1152为例进行说明。如图7所示，光路反射镜组115可以包括第一反射镜1151和第二反射镜1152，第一反射镜1151用于将第一激光光源111出射的激光光束形成第一反射光束并控制第一反射光束入射至第二反射镜1152上，第二反射镜1152上用于反射第一反射光束形成第二反射光束并静止第二反射光速入射至液滴断裂点A2。

进一步的，第一反射镜1151和第二反射镜1152的角度均可调整，通过调整第一反射镜1151和第二反射镜1152的角度，保证第二反射光束的照射光斑正好位于液滴断裂点A2位置处液滴的正中心，保证监测相机1211可以获得液滴断裂点A2中心亮光斑的图案；并且当探测颗粒流经照射光斑时，被激发的荧光信号被第二检测信号接收单元123接收。

可选的，继续参考图7所示，光路反射镜组115还可以包括第一滤光片1153；第一滤光片1153可以位于第一反射光束的光路上，用于滤除第一反射光束中的干扰光；或者第一滤光片1153还可以位于第二反射光束的光路上，用于滤除第二反射光束中的干扰光，图7仅以第一滤光片1153位于第一反射光束的光路上为例进行说明。通过设置第一滤光片1153，保证滤除干扰光，保证第二检测信号接收单元123接收到的第二检测信号均为探测颗粒基于第二反射光束的激发信号，保证基于第二检测信号的第二接收时间T2接收准确。可选的，第一滤波片1153可以为带通滤光片，也可以是短通滤光片，本发明实施例对此不进行限定，只需保证可以滤除干扰光例如探测颗粒激发的荧光或者散射光，保证入射至液滴断裂点A2的光线只包括第二反射光束，保证第二接收时间T2准确。

可选的，本发明实施例提供的光路反射镜组中，第一反射镜1151可以包括平面反射镜，第二反射镜1152可以包括平面反射镜，如图7所示；或者，第一反射镜1151可以包括球面反射镜，第二反射镜1152可以包括球面反射镜，如图8所示。本发明实施例对第一反射镜1151和第二反射镜1152的类型不进行限定，例如，第一反射镜1151和第二反射镜1152还可以为反射棱镜，只需保证可以将第一激光光源111发出的激光光束反射至液滴断裂点A2即可。

进一步的，由于球面反射镜本身具备放大功能，因此当第一反射镜1151包括平面反射镜，第二反射镜1152包括平面反射镜时，光路反射镜组115还可以包括放大镜头1154；放大镜头1154位于第一反射光束的光路上，并且第二反射镜1152可以位于放大镜头1154的焦平面位置处。通过增设放大镜头1154对第一反射光束进行汇聚，保证第二反射镜1152接收到的光强较大，如此第二反射光束强度较大，保证位于液滴断裂点A2位置的照射光斑亮度较大，有利于监测相机1211获知液滴断裂点A2的位置；同时强度较大的第二反射光束激发探测颗粒，可以保证第二检测信号强度较大，保证基于第二检测信号的第二接收时间T2准确度较高。

图9是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图，如图9所示，前向检测信号接收单元112可以包括前向镜头1121，第一反射镜1151位于前向镜头1121的焦平面位置处。

示例性的，由于第一激光光源111发出的激光光束为平行光束，平行光束经前向镜头1121后在前向镜头1121的焦平面位置汇聚，设置第一反射镜1151位于前向镜头1121的焦平面位置处，保证第一反射镜1151可以将第一激光光源111发出直射光束全部反射，如此前向检测信号接收单元112接收到的第一检测信号均为探测颗粒基于第一激光光源111发出的激光光束的荧光信号或者前向散射光信号，保证基于第一检测信号的第一接收时间不会受直射光干扰，第一接收时间准确。进一步的，由于探测颗粒基于第一激光光源111发出的激光光束的前向散射光或者荧光基于直射激光光束的传播方向发生改变，因此前向散射光或者荧光不会在前向镜头1121的焦平面位置处汇聚，第一反射镜1151对前向散射光或者荧光的影响较大，不会影响前向检测信号接收单元112接收检测信号。

可以理解的是，在监测相机1211根据液滴运动图像确定液滴断裂点A2之前，监测相机1211需要首先获得稳定的液流图像，只有根据液流图像确定液流处于稳定状态时，此时确定的液滴断裂点A2才是正确的液滴断裂点，否则可能存在因为偶然因素造成液滴意外中断形成液滴断裂点，造成液滴断裂点判断错误问题。接下来对如果确定监测相机1211获得稳定的液流图像进行说明。

图10是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图，图11是本发明实施例提供的另一种液滴图像的示意图，图12是本发明实施例提供的液流流经第一位置和第二位置的时间示意图，如图10、图11和图12所示，第一激光光源111用于出射第一激光光束和第二激光光束；第一反射镜1151用于反射第一激光光束形成第三反射光束，反射第二激光光束形成第四反射光束；第二反射镜1152分别位于第三反射光束和第四反射光束的光路上，用于反射第三反射光束至液流流动路径上的第一位置A3，反射第四反射光束至液流流动路径上的第二位置A4，其中，第一位置A3位于液流检测点A1和第二位置A4之间，第二位置A4位于液滴断裂点A2靠近液流检测点A1的一侧，或者第二位置A4与液滴断裂点A2重合。进一步的，液滴延迟时间测量模块11还包括液滴测速子模块116，液滴测速子模块116用于根据第一位置A3、第二位置A4、第三反射光束入射至所述第一位置A3的时间T3以及第四反射光束入射至第二位置A4的时间T4确定液流是否达到稳定状态。

图10以第一位置A3位于液流检测点A1和第二位置A4之间，第二位置A4位于液滴断裂点A2靠近液流检测点A1的一侧为例进行说明。如图10所示，第一激光光源111出射第一激光光束和第二激光光束，其中第一激光光束和第二激光光束可以是第一激光光源111直接出射得到的，此时，第一激光光源111可以包括两个或者多个激光器，保证可以同时出射两束激光光束；或者，第一激光光束和第二激光光束可以是第一激光光源111出射的单束激光光束通过分束获得的，例如在第一激光光源111出射的单束激光光束的路径上设置分束装置，将单束激光光束分束形成第一激光光束和第二激光光束。本发明实施例对第一激光光源111如何得到第一激光光束和第二激光光束不进行说明。继续参考图10所示，第一激光光束和第二激光光束分别经第一反射镜1151和第二反射镜1152反射后分别入射至液流流动路径上的第一位置A3和第二位置A4，其中，第一位置和第二位置均位于液流检测点A1和液滴断裂点A2之间，且第二位置A4位于第一位置A3靠近液滴断裂点A2的一侧。液滴测速子模块116用于根据第一位置A3、第二位置A4、第三反射光束入射至所述第一位置A3的时间T3以及第四反射光束入射至第二位置A4的时间T4确定液流是否达到稳定稳定状态。

具体的，液滴测速子模块116具体用于根据第三反射光束入射至第一位置A3的时间T3以及第四反射光束入射至第二位置A4的时间T4计算液滴在第一位置A3和第二位置A4之间的第一平均速度，并在第一平均速度满足预设要求时确定液流达到稳定运动状态。

示例性的，如图11所示，第一位置A3对应监测相机1211上的第一检测位置A3’，第二位置A4对应监测相机1211上的第二检测位置A4’，其中，检测位置A3’和第二检测位置A4’之间的距离d满足d＝n*u/M；液滴在第一位置A3和第二位置A4之间的第一平均速度v满足v＝d/(T4-T3)。其中，其中，n表示第一检测位置A3’和第二检测位置A4’之间的像素数量；u表示监测相机1211中单个像素的尺寸；M表示监测相机的放大倍率。根据上述计算得到的第一平均速度确定第一平均速度满足预设要求时，可以确定液流达到稳定运动状态。这里第一平均速度满足预设要求可以是第一平均速度维持在一个数值范围内，例如10m/s；或者说任意两个第一平均速度v1和v2之间的差值维持在一个数值范围内，例如1m/s；或者说任意两个第一平均速度v1和v2之间的差值百分比维持在一个数值范围内，例如(v1-v2)/v2≤10％。

综上，上述实施例对如何确定液流处于稳定状态进行了说明，当确定液流处于稳定状态时，此时通过监测相机1211确定的液滴断裂点A2为准确的液滴断裂点。

可选的，继续参考图10所示，液滴测速子模块116可以包括第二滤光片1161、第一探测镜头1162、第一视场光阑1163、第二视场光阑1164、第一探测器1165和第二探测器1166；第二滤光片1161和第一探测镜头1162同时位于第一探测器1165和第二探测器1166的探测路径上；第一视场光阑1163位于第一探测器1165的探测路径上；第二视场光阑1164位于第二探测器1166的探测路径上。

可选的，第二滤光片1161可以是带通滤光片，也可以是长通滤光片，其功能是不让第三反射光束和第四反射光束通过，只通过探测颗粒基于第三反射光束和第四反射光束激发的荧光信号。第一视场光阑1163和第二视场光阑1164用于消除荧光信号之外的干扰光，从而保证第一探测器1165和第二探测器1166接收到的信号完全是探测颗粒基于第三反射光束和第四反射光束激发的荧光信号。第一探测器1165和第二探测器1166可以是光电二极管，可以是雪崩二极管，也可以是光电倍增管，其特点是灵敏度高，能探测微弱的荧光信号，并且响应速度很快，ns量级的响应速度。

可选的，继续参考图4、图7、图8和图9所示，第二检测信号接收单元123可以包括第三滤光片1231、第三视场光阑1232和第三探测器1233，第三滤光片123以及第三视场光阑1232依次位于第三探测器1233的探测路径上，第三滤光片126可以是带通滤光片，也可以是长通滤光片，其功能是只允许透过第二检测信号，第三视场光阑125用于遮挡第二检测信号之前的其他光信号，保证基于第二检测信号的第二接收时间T2接收准确。第三探测器1233可以是光电二极管，可以是雪崩二极管，也可以是光电倍增管，其特点是灵敏度高，能探测微弱的荧光信号，并且响应速度很快，ns量级的响应速度。

进一步的，结合图4、图7、图8、图9和图10所示，当第三反射光束或者第四反射光束被第二反射镜1152反射至液滴断裂点A2，即第二位置A4与液滴断裂点A2重合时，例如第四反射光束被第二反射镜1152反射至液滴断裂点A2，此时，第二滤光片1161可以复用为第三滤光片1231，第二视场光阑1164可以复用为第三视场光阑1232，第二探测器1166可以复用为第三探测器1233，保证流式细胞仪结构简单。

可选的，本发明实施例提供的检测点测量子模块11可以包括前向检测信号接收单元112和/或侧向检测信号接收单元117，图4、图7、图8、图9和图10均以检测点测量子模块11包括前向检测信号接收单元112为例进行说明，图13以检测点测量子模块11包括侧向检测信号接收单元11为例进行说明。如图4、图7、图8、图9和图10所示，前向检测信号接收单元112可以包括前向镜头1121和前向探测器1122，前向镜头1121用于对探测颗粒基于第一激光信号激发的荧光信号或者前向散射光信号进行聚焦，保证荧光信号或者前向散射光信号可以更多地进入前向检测信号接收单元112，保证基于第一检测信号的第一接收时间T1接收准确；前向探测器1122为光电探测器或者光电倍增管，本发明实施例对前向检测信号接收单元112的具体不进行限定。如图13所示，侧向检测信号接收单元117可以包括侧向镜头1171和侧向探测器1172，侧向镜头1171用于对探测颗粒基于第一激光信号激发的荧光信号或者侧向散射光信号进行聚焦，保证荧光信号或者侧向散射光信号可以更多地进入侧向探测器1172，保证基于第一检测信号的第一接收时间T1接收准确；可选的，侧向镜头1171可以为显微物镜，其数值孔径NA满足NA>0.6，视场大于0.5mm。。侧向探测器1172为光电探测器或者光电倍增管，本发明实施例对侧向探测器1172的具体不进行限定。

可选的，继续参考图4所示，本发明实施例提供的流式细胞分选仪还可以包括液流储存模块13、液滴形成模块14和液滴分选模块15；液流储存模块13用于储存液流，液流流经液滴形成模块14并在液滴断裂点A2位置断裂形成液滴；液滴分选模块15包括偏转电极板151和液滴接收试管152，偏转电极板151用于控制充电后的液滴进行偏转，液滴接收试管152用于接收偏转后的所述液滴，完成细胞分选操作。

综上所述，本发明实施例提供的流式细胞分选仪，通过液滴延迟时间测量模块直接测量液滴延迟时间，并将液滴延迟时间前馈给液滴分选模块，液滴分选模块可以准确掌握液滴延迟时间，保证准确在液滴断裂点对液滴进行充电，液滴充电时间控制准确，保证液滴分选准确，液滴分选效率高；并且液滴延迟时间测量准确，液滴延迟时间测量简单且节省耗材；进一步的，通过合理设置流式细胞分选仪中的器件以及器件的设置位置，可以保证流式细胞分选仪结构简单，流式细胞分选仪集成度高。

图14是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的实体装置结构示意图，如图14所示，本发明实施例提供的流式细胞分选仪可以包括液滴测速模块30，液滴测速模块30包括第三激光光源301，第三激光光源301用于出射第三激光光束和第四激光光束，第三激光光束入射至液流流动路径上液滴测速的第三位置A5，第四激光光束入射至液流流动路径上液滴测速的第四位置A6；液滴测速模块30用于根据第三位置A5、第四位置A6、第三激光光束入射至所述第三位置的时间以及第四激光光束入射至所述第四位置的时间确定液流是否达到稳定稳定状态。

示例性的，第三激光光源301出射第三激光光束和第四激光光束，其中第三激光光束和第四激光光束可以是第三激光光源301直接出射得到的，此时，第三激光光源301可以包括两个或者多个激光器，保证可以同时出射两束激光光束；或者，第三激光光束和第四激光光束可以是第三激光光源301出射的单束激光光束通过分束获得的，例如在第三激光光源301出射的单束激光光束的路径上设置分束装置，将单束激光光束分束形成第三激光光束和第四激光光束。本发明实施例对第三激光光源301如何得到第三激光光束和第四激光光束不进行说明。继续参考图14所示，第三激光光束入射至液流流动路径液滴测速上的第三位置A5，第四激光光束入射至液流流动路径上液滴测速的第四位置A6。液滴测速模块30用于根据第三位置A5、第四位置A6、第三激光光束入射至所述第三位置A5的时间T5以及第四激光光束入射至第四位置A6的时间T5确定液流是否达到稳定稳定状态。

具体的，液滴测速模块30具体用于根据第三激光光束入射至第三位置A5的时间T5以及第四激光光束入射至第四位置A6的时间T6计算液滴在第三位置A5和第四位置A6之间的平均速度第二平均速度，并在第二平均速度满足预设要求时确定液流达到稳定运动状态。

示例性的，图15是本发明实施例提供的另一种液滴图像的示意图，如图15所示，第三位置A5对应监测相机上的第三检测位置A5’，第四位置A6对应监测相机1211上的第四检测位置A6’，其中，第三检测位置A5’和第四检测位置A6’之间的距离d’满足d’＝n*u/M；液滴在第三位置A5和第四位置A6之间的平均速度第二平均速度v’满足v’＝d’/(T6-T5)。其中，其中，n表示第三检测位置A5’和第四检测位置A6’之间的像素数量；u表示监测相机中单个像素的尺寸；M表示监测相机的放大倍率。根据上述计算得到的第二平均速度确定第二平均速度满足预设要求时，可以确定液流达到稳定运动状态。这里第二平均速度满足预设要求可以是第二平均速度维持在一个数值范围内，例如10m/s；或者说任意两个第二平均速度v1’和v2之’间的差值维持在一个数值范围内，例如1m/s；或者说任意两个平均速度第二平均速度v1’和v2’之间的差值百分比维持在一个数值范围内，例如(v1’-v2’)/v2’≤10％。

可选的，继续参考图14所示，液滴测速模块30可以包括第四滤光片302、第二探测镜头303、第三视场光阑304、第四视场光阑305、第四探测器306和第五探测器307；第四滤光片302和第二探测镜头303同时位于第四探测器306和第五探测器307的探测路径上；第三视场光阑304位于第四探测器306的探测路径上；第四视场光阑305位于第五探测器307的探测路径上。

可选的，第四滤光片302可以是带通滤光片，也可以是长通滤光片，其功能是不让第三激光光束和第四激光光束通过，只通过探测颗粒基于第三激光光束和第四激光光束激发的荧光信号。第三视场光阑304和第四视场光阑305用于消除荧光信号之外的干扰光，从而保证第四探测器306和第五探测器307接收到的信号完全是探测颗粒基于第三激光光束和第四激光光束激发的荧光信号。第四探测器306和第五探测器307可以是光电二极管，可以是雪崩二极管，也可以是光电倍增管，其特点是灵敏度高，能探测微弱的荧光信号，并且响应速度很快，ns量级的响应速度。

综上，本发明实施例提供的细胞分选仪，可以准确测量液滴的运动速度，且结构简单，实用性强。

可选的，图16是本发明实施例提供的另一种流式细胞分选仪的结构示意图，图17是本发明实施例提供的一种流式细胞分选方法的流程示意图，在上述实施例的基础上，本发明实施例还提供了一种流式细胞分选方法，应用于图16所示的流式细胞分选仪，如图16和图17所示，本发明实施例提供的流式细胞分选仪可以包括检测点测量模块40、液滴延迟时间测量模块41和液滴分流模块42；所流式细胞分选方法包括：

S110、所述检测点测量模块在液流经液流检测点时获取样本的光学探测信号，根据所述光学探测信号获取分选目标信息。

S120、所述液滴延迟时间测量模块根据液流经过液滴断裂点的时间测量液滴延迟时间。

S130、所述液滴分流模块接收所述分选目标信息和所述液滴延迟时间，根据所述液滴延迟时间对分选目标进行分选充电。

示例性的，检测点测量模块在液流流经检测点获得样本的光学探测信号，并根据光学探测信号分析获得分选目标信息。在液流流经断裂点时，液滴延迟时间测量模块获得准确的延迟时间。液滴分流模块与检测点测量模块和液滴延迟时间测量模块通信连接，接收分选目标信息和液滴延迟时间，并在液滴延迟时间到达后需要对分选目标进行充电，以控制分选目标在偏转电场的作用下偏转，完成分选。

综上，本发明实施例提供的流式细胞分选方法，分许目标和液滴延迟时间确定准确，保证分选结果准确。

可选的，在上述实施例的基础上，本发明实施例提供的流式细胞分选仪还可以包括液流测速模块，当液流测速模块测量液流速度达稳定状态时，确定液滴延迟时间测量模块所测得的液滴断裂点为准确的液滴断裂点。

示例性的，本发明例提供的流式细胞分选仪还可以包括液流测速模块，并且上述实施例对如何确定液流处于稳定状态进行了说明。可选的，本发明实施例提供的流式细胞分选方法还可以包括当确定液流处于稳定状态时，液滴延迟时间测量模块确定的液滴断裂点为准确的液滴断裂点，液滴分流模块根据液滴延迟时间在液滴断裂点对分选目标进行分选充电，保证细胞分选精确。

注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，本发明的各个实施方式的特征可以部分地或者全部地彼此耦合或组合，并且可以以各种方式彼此协作并在技术上被驱动。对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整、相互结合和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。