犬钩端螺旋体检测用引物组、检测试剂盒和快速检测方法

摘要

本发明公开了犬钩端螺旋体检测用引物组、检测试剂盒和快速检测方法，涉及生物检测技术领域。本发明引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示的四条引物，对犬钩端螺旋体具有高特异性。本发明的快速检测方法是利用上述引物组对待测样品DNA进行LAMP反应，通过显色结果判断样品中是否含有犬钩端螺旋体；本发明还根据上述引物组和快速检测方法设计出检测试剂盒，可对待测样品进行快速、准确、专一性地鉴别。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及犬钩端螺旋体检测用引物组、检测试剂盒和快速检测方法。

背景技术

钩端螺旋体病是一种人兽共患病，病原体是钩端螺旋体犬对本病易感，世界各国都有发生，目前被认为是最广泛的人畜共患病之一。钩端螺旋体的菌型不下数十种，犬型最常见，其次为黄疸出血型及波摩那型，可以长期存在于感染动物体内，成为主要的贮存宿主。如鼠类感染后，大多是健康带菌者，带菌时间长，并可通过尿液向外排菌，而成为重要的传染源。家畜中，猪、犬也是重要的传染源。带菌的动物，可随尿排菌，污染水源、土壤。当犬接触这些染菌的水、土壤或尿后，就可通过破损的皮肤、粘膜及消化道感染。通过性交感染钩体病的病原体会持续存在于宿主机体内，会进一步扩散污染环境，感染其他人和动物，危害严重。因而，犬患该病后，在危害其本身的健康的同时，还会威胁到其主人的安全。因此，需要在早期对该病作出诊断，尽早控制该病。

世界上很多国家包括我国都是采取疫苗进行预防，但很多流浪犬只及部分家养犬没有及时进行免疫注射，如感染后不及时处理，对犬及人类的自身安全和健康都会造成极大的损害。

目前，诊断犬钩体病的方法有直接镜检、分离培养、血清学检测、动物接种等实验室检测方法以及分子生物学方法，与这些方法相比，环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)方法更省时省力，特异性和敏感性优异，并且可用于钩体病的早期诊断。LAMP因其自身的优点，现已被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。现尚未见有LAMP用于犬钩端螺旋体检测的相关文献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种犬钩端螺旋体检测用引物组，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

为解决上述技术问题所采用的技术方案：

一种犬钩端螺旋体检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的犬钩端螺旋体基因序列，选取犬钩端螺旋体基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别犬钩端螺旋体的特异性引物组，通过PCR来鉴定犬钩端螺旋体基因，该引物组包括如下四条引物：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的第二个目的在于提供一种利用上述所述引物组对犬钩端螺旋体进行高效和高特异性的检测方法，包括如下步骤：

(1)样品处理：处理待测样品并采用本领域的高温煮沸法在100℃下处理20-30min，提取样品的DNA；待测样品通常是选择尿液或血液样品；

(2)环介导等温扩增技术反应过程：采用上述所述的引物组对待测样品DNA进行LAMP反应，扩增犬钩端螺旋体的特异性片段；

(3)反应后处理：LAMP扩增反应结束后，向LAMP扩增体系中加入显色剂，根据所观察的颜色判断结果。

上述步骤(2)中，LAMP的反应体系采用本领域技术人员进行LAMP反应时常用的反应体系，如LAMP反应一般都包含Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲液、25～30mmol/μLMgSO4、5～7μmol/μL甜菜碱和4种dNTP等，可参考教科书以及LAMP试剂盒中的反应体系配制，均可实现本发明。

上述步骤(2)中，LAMP反应的反应条件可采用本领域人员操作LAMP反应时的常规反应条件，优选恒温反应温度为60～63℃，恒温反应时间为50～60min，然后于80℃恒温6～10min终止反应。

上述步骤(3)中，显色剂可选择任何一种常用的荧光染料，优选SYBR Green I。

上述步骤(3)中，当荧光染色剂加入反应液后不变色，则说明为阴性，如果变色则为阳性，以SYBR Green I为例，SYBR Green I为橙色，若SYBR Green I加入到LAMP反应液后依然显橙色，则说明待测样品中不含有犬钩端螺旋体，若SYBR Green I加入到LAMP反应液后变成绿色，则说明待测样品中含有犬钩端螺旋体。

本发明的第三个目的在于提供一种对待测样品是否含有犬钩端螺旋体进行检测的检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述所述的引物组以及阳性对照组，所述阳性对照组为犬钩端螺旋体基因组DNA。使用该检测试剂盒时，将待测样品DNA与引物组进行常规的LAMP反应扩增目的片段，可优选在63～65℃的恒温条件，反应时间为55～60min，然后于80℃恒温6～10min终止反应。扩增产物后用显色剂染色，将染色结果和阳性对照组的染色结果进行比较，从而判断待测样品是否含有犬钩端螺旋体。

上述所述检测试剂盒还可以包括Bst DNA聚合酶、显色剂和LAMP反应液，所述显色剂可选择任何一种常用的荧光染料，优选SYBR Green I，所述LAMP反应液可参考本领域人员进行LAMP反应时常用的反应液配方，如LAMP反应液可含有内引物BIP和内引物FIP 40～45pmol/μL、外引物F3和外引物B3 5～6pmol/μL、MgSO

使用上述所述检测试剂盒时可按照如下步骤操作：

(1)处理待测样品，提取样品的DNA；

(2)采用所述检测试剂盒中的引物组对样品DNA进行环介导等温扩增反应，扩增犬钩端螺旋体的特异性片段；

(3)向上述环介导等温扩增反应体系和检测试剂盒中的阳性对照组分别加入荧光染色剂，观察颜色变化，如果样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。选择染色剂SYBR Green I为例，SYBR Green I为橙色，加入到反应体系和阳性对照组后，阳性对照组中的颜色变为绿色，如果反应体系的颜色还是橙色那么就说明待测样品中没有感染犬钩端螺旋体，如果反应体系的颜色变成和阳性对照组一样的绿色，就说明待测样品感染。

为了检测时更加迅速方便，本发明的检测试剂盒除了上述4条引物、Bst DNA聚合酶、荧光染色剂、阳性对照液和LAMP反应液外，还可以包括样品DNA提取液。所述样品DNA提取液，是提取待测样品(如尿液或血液样品等)中的DNA，其提取液的配制可参考常规的DNA提取液的配制方法，并可根据不同待测样品进行稍微的改动。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明根据已公开的犬钩端螺旋体基因序列，选取犬钩端螺旋体基因的特异性序列，然后分析设计出犬钩端螺旋体检测用引物组，具有高特异性，能够准确且专一性地鉴别犬钩端螺旋体。

2.本发明的快速检测方法可快速高效扩增待测样品，整个扩增在1h内即可完成，且产率高，所使用的犬钩端螺旋体检测用引物组特异性高，可大大提高其扩增效率。

3.本发明的快速检测方法只需一个恒定温度就能扩增反应，且灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少。

4.本发明的检测试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性。

5.本发明的检测试剂盒鉴定简便，通过荧光染色剂的颜色变化，可通过肉眼观察鉴定，且阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

采用检测试剂盒对犬钩端螺旋体进行快速检测，检测试剂盒由犬钩端螺旋体检测用引物组、阳性对照组、显色剂、Bst DNA聚合酶和LAMP反应液组成，五种液体分别置于不同容器中，其中：

a.犬钩端螺旋体检测用引物组由如下四条引物组成：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

b.Bst DNA聚合酶8U；

c.阳性对照组为犬钩端螺旋体基因组DNA；

d.显色剂为SYBR Green I；

e.LAMP反应液含有内引物BIP和内引物FIP 40pmol/μL、外引物F3和外引物B35pmol/μL、MgSO

本实施例1的检测步骤如下：

(1)样品处理

准备待检样品犬尿液样品(-70℃低温冰箱保存)。

尿液样品DNA提取：100℃煮沸30min，-20℃保存。

(2)LAMP反应

向反应管中加入上述样品DNA 2μL，Bst DNA聚合酶1μl，LAMP反应液22μL，60℃水浴40min，80℃水浴10min终止反应。

(3)反应后处理

向上述反应液和阳性对照组中分别加入显色剂SYBR Green I，显色剂为橙色，加入到阳性对照组后变为绿色，而加入到样品反应液后依然为橙色，由此说明本实施例的样品中含有犬钩端螺旋体。

同时采用Real-time PCR对本实施例提取的样品DNA进行检测，检测结果为样品中含有犬钩端螺旋体，这一结果和本实施例的结果相吻合。

本实施例1的检测结果与相应的传统荧光定量PCR结果具有一致性，说明本发明的方法可以准确快速检测样品中是否含有犬钩端螺旋体。

实施例2

采用检测试剂盒对犬钩端螺旋体进行快速检测，检测试剂盒由犬钩端螺旋体检测用引物组、阳性对照组、显色剂、Bst DNA聚合酶和LAMP反应液组成，五种液体分别置于不同容器中，其中：

a.犬钩端螺旋体检测用引物组由如下四条引物组成：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

b.Bst DNA聚合酶8U；

c.阳性对照组为犬钩端螺旋体基因组DNA；

d.显色剂为SYBR Green I；

e.LAMP反应液含有内引物BIP和FIP 45pmol/μL、外引物F3和外引物B3 6pmol/μL、MgSO

本实施例2的检测步骤如下：

(1)样品处理

准备待检样品犬血液样品(-70℃低温冰箱保存)。

尿液样品DNA提取：100℃煮沸30min，-20℃保存。

(2)LAMP反应

向反应管中加入上述样品DNA 2μL，Bst DNA聚合酶1μl，LAMP反应液22μL，60℃水浴40min，80℃水浴10min终止反应。

(3)反应后处理

向上述反应液和阳性对照组中分别加入显色剂SYBR Green I，显色剂为橙色，加入到阳性对照组后变为绿色，而加入到样品反应液后依然为橙色，由此说明本实施例的样品中含有犬钩端螺旋体。

同时采用Real-time PCR对本实施例提取的样品DNA进行检测，检测结果为样品中含有犬钩端螺旋体，这一结果和本实施例的结果相吻合。

本实施例2的检测结果与相应的传统荧光定量PCR结果具有一致性，说明本发明的方法可以准确快速检测样品中是否含有犬钩端螺旋体。

以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东科贸职业学院

<120> 犬钩端螺旋体检测用引物组、检测试剂盒和快速检测方法

<130> 2020

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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