一种靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物医学技术领域，具体提供了一种靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针及其制备方法和应用，并将其应用于肿瘤靶向荧光成像，由肿瘤酪氨酸激酶识别基团(TKP)、近红外二区荧光基团(SQ1050)、肿瘤靶向多肽基团(PEP)通过化学键连接而成。该试剂基于肿瘤的酪氨酸激酶高表达，可在具有酪氨酸激酶高表达的肿瘤中应用，结合近红外二区荧光成像仪，可用于肿瘤靶向荧光成像，肿瘤酪氨酸激酶的动态示踪等应用。该试剂在应用中实现了高灵敏度，高特异性，为医学上研究肿瘤和临床上监测、治疗肿瘤提供了有效的工具，因此在肿瘤靶向荧光成像，肿瘤酪氨酸激酶动态示踪等方面具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一类检测试剂及其制备方法和应用，具体为靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针及其制备方法和用于肿瘤靶向荧光成像和监测肿瘤酪氨酸激酶含量的应用。

背景技术

酪氨酸激酶是许多生长因子，细胞因子和激素的高亲和性细胞表面受体。在人类基因组中鉴定的90种独特的酪氨酸激酶基因中，有58种编码受体酪氨酸激酶蛋白。具有细胞外受体结构域的酪氨酸激酶，膜外信号物质结合受体部分后激活其细胞内的激酶活性域，从而对底物的酪氨酸残基进行磷酸化。受体酪氨酸激酶不仅被证明是正常细胞过程的关键调节因子，而且还在许多类型的癌症的发展和恶化中起关键作用。受体酪氨酸激酶的突变会激活一系列信号级联反应，这些级联反应对蛋白质表达有很多影响。与配体结合后酪氨酸激酶会发生自发聚合，激活其激酶活性而自磷酸化，并传导到细胞内的多条信号通路，如MAPK、PI3K-Akt信号通路等。自从酪氨酸激酶被发现以来，大量的临床数据证明其对多种疾病，尤其是癌症有重要的影响。酪氨酸激酶会在癌症组织中发生大量的扩增和多位点的突变。近年来，随着精准医疗的迅猛发展，针对酪氨酸激酶的分子靶向药物开始进入市场。进一步对酪氨酸激酶进行各个方面的研究仍旧有很大的需求。

小分子荧光探针被广泛的应用于化学分析，生物分析以及生物动态过程实时、非侵入性监测。因此，小分子荧光探针被广泛用于药物筛选和治疗效果的评估，实现了肿瘤治疗效果的早期监测。新近发展的以近红外二区荧光分子成像技术，突破了光学组织穿透深度的限制，能够在活体水平上获得高于传统光学分辨率的荧光图像。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于制备了一类靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针及制备方法和应用。该分子探针与酪氨酸激酶结合后，近红外二区荧光强度具有明显的增强，且荧光可由近红外二区荧光检测器检测，利用该分子探针反应可对多种生物体系中酪氨酸激酶的含量及分布进行评价。

本发明第二个目的提供一种肿瘤靶向近红外二区荧光成像和监测肿瘤转移的试剂，可作为手术导航的试剂。

本发明第三个目的提供所述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针在制备用于肿瘤靶向近红外二区荧光成像和监测肿瘤转移的试剂上的应用。

本发明第四个目的提供所述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针在制备用于监测肿瘤酪氨酸激酶的含量及分布的试剂上的应用。

本发明的技术方案如下：

靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针，该探针由酪氨酸激酶识别基团(TKP)、近红外二区荧光基团(SQ1050)通过化学键连接而成；其结构为：结构I 型TKP-SQ1050或结构II型TKP-SQ1050-PEP。

所述酪氨酸激酶识别基团(TKP)结构为：

所述近红外二区荧光基团(SQ1050)结构为：

所述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针，优选，所述结构I型TKP-SQ1050 的结构为下式TFPSQ-1所示：

所述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针，优选，所述结构II型 TKP-SQ1050-PEP的结构为下式TFPSQ-2所示：

本发明所述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针，本身荧光量子产率低，分子探针与酪氨酸激酶结合后具有很高的荧光量子产率，可采用荧光检测器实现酪氨酸激酶含量及分布的快速、灵敏检测。

所述探针本身没有近红外二区荧光，探针中的酪氨酸激酶识别基团与酪氨酸激酶结合后的探针具有很强的近红外二区荧光，可采用荧光检测器实现底物荧光变化的快速、灵敏检测。

所述探针作为酪氨酸激酶的配体，通过定量检测荧光强度来定量测定不同生物体系中酪氨酸激酶的含量。

本发明还提供所述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针的制备方法，该方法为:a)通过在无水条件下将酪氨酸激酶识别基团TKP与近红外二区荧光基团SQ1050 以1:1比例通过化学键偶联制备得到靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针TKPSQ-l；b)通过在无水条件下将上述探针TKPSQ-1与肿瘤靶向多肽基团PEP以1:1比例通过化学键偶联制备得到靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针TKPSQ-2。

本发明还提供一种靶向肿瘤荧光成像和动态示踪酪氨酸激酶的试剂，所述试剂含有上述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针。

本发明还提供一种肿瘤靶向近红外二区荧光成像和监测肿瘤转移的试剂，可作为手术导航的试剂。

本发明还提供一种动态示踪肿瘤酪氨酸激酶的试剂，所述试剂含有上述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针。

本发明还提供所述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针在制备用于肿瘤靶向近红外二区荧光成像和监测肿瘤转移的试剂上的应用。

本发明还提供所述靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针在制备用于监测肿瘤酪氨酸激酶的含量及分布的试剂上的应用。

发明详述

该探针由检测团和荧光基团通过化学键连接而成，概述为结构I型，其可表示为TKP-SQ1050。

靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针具体实例为:

结构I型：TKP-SQ1050

I型结构作为靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针，本身由于聚集诱导荧光猝灭效应，导致分子荧光猝灭，当其与酪氨酸激酶结合后，荧光强度大大增强。通过定量检测荧光强度来测定酪氨酸激酶溶液及细胞中酪氨酸激酶的含量。

本发明试剂做为靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光分子探针在酪氨酸激酶溶液及细胞中实施的技术方案如下：

1)在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20℃至45℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.0-8.5之间，优选pH 7.4为最优反应pH值；反应时间为5-30分钟，优选反应时间为20min。

2)通过测定荧光强度的增加倍数评价酪氨酸激酶的含量，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长950nm，在1000-1100nm 进行荧光发射谱的检测。

本发明的又一目的，提供了一种手术导航的试剂和方法。该试剂可以由I型试剂连接肿瘤靶向多肽基团(PEP)制备而成，可实时靶向荧光成像肿瘤细胞或组织，该试剂可概述为结构II型，其可表示为TKP-SQ1050-PEP。

实时靶向荧光成像肿瘤细胞或组织的试剂具体实例为：

结构II型：TKP-SQ1050-PEP

上述荧光探针的制备方法如下：

TKPSQ-1的制备方法：

TKPSQ-2的制备方法：

在生物体中，II型试剂既是酪氨酸激酶的靶向识别基团，又可以特异性靶向集聚到肿瘤组织。所以II型试剂可应用在外科肿瘤切除手术过程中，肿瘤边界鉴别，残余肿瘤组织识别和肿瘤转移淋巴结的追踪，为肿瘤外科手术的荧光导航系统提供了一种新的荧光导航试剂。该试剂注射入患有肿瘤疾病的活体后，机体手术视野杂特定波长光波照射下，肿瘤细胞或组织会发出一定波长的荧光，在成像系统下指导医生进行外科手术，有效提高手术治疗效果，降低肿瘤患者死亡率。

本发明试剂做为外科手术荧光导航试剂在荷瘤小鼠内实施的技术方案如下：

1)II型试剂可溶于含DMS00％-5％的PBS溶液或生理盐水溶液，配制成工作液，尾静脉注射或局部注射至小鼠体内；

2)II型试剂经血液循环，可特异性聚集靶向到肿瘤部位；

3)II型试剂在非肿瘤组织区域无荧光信号或荧光信号强度较弱，在肿瘤组织部位荧光信号强度很强。

4)利用活体近红外二区荧光成像技术，根据荧光信号，精确成像肿瘤位置，为外科手术提供导航。

本发明创新之处还在于，1、利用酪氨酸激酶识别基团与酪氨酸激酶的特异性结合，使该探针具有高特异性；2、该探针所以报告基团为近红外二区荧光基团SQ1050，该基团为自主设计合成，具有原创性。此外，近红外二区荧光成像技术是一种近年来兴起的新型成像技术，在成像灵敏度及分辨率方面远优于传统的可见光及近红外一区荧光成像；3、II型试剂所用肿瘤靶向基团为自主设计合成的环状多肽，为首次设计合成，对肿瘤细胞尤其是乳腺癌细胞表面的纤连蛋白具有靶向性。

本发明有益技术效果：

本发明提供了靶向酪氨酸激酶的近红外二区荧光探针，该探针可以与生物体系中的酪氨酸激酶结合增强荧光，因此可用于检测生物体内的酪氨酸激酶；该探针可特异性靶向到肿瘤组织，与酪氨酸激酶结合后，荧光增强，因此该探针可以用于肿瘤靶向荧光成像，又可以用于酪氨酸激酶表达含量及其分布的动态示踪。实验发现，探针本身的荧光强度较弱，与酪氨酸激酶结合后，荧光显著增强。

本发明中，检测肿瘤靶向试剂识别肿瘤后荧光信号变化，操作简单、对身体无害；该试剂在应用中实现了高灵敏度、高特异性，为医学上研究肿瘤和临床上监测、治疗肿瘤转移提供了有效的工具，因此在肿瘤靶向荧光成像、酪氨酸激酶表达含量及其分布的动态示踪等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为探针TKPSQ-1的高效液相色谱(HPLC)和飞行时间质谱分析谱图；

图2为探针TKPSQ-2的高效液相色谱(HPLC)和飞行时间质谱分析谱图；

图3为探针TKPSQ-1与酪氨酸激酶反应前后的荧光光谱图；

图4为探针TKPSQ-1与酪氨酸激酶作用的动力学实验。

图5为探针TKPSQ-1与各种干扰物种和酪氨酸激酶反应的荧光光谱；

图6为探针TKPSQ-2与各种干扰物种和酪氨酸激酶反应的荧光光谱；

图7为探针TKPSQ-2在乳腺癌荷瘤小鼠模型上的示踪酪氨酸激酶的荧光成像。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

本发明所用试剂：

本发明所用仪器：

实施例1.

TKPSQ-1探针的合成工艺为：

首先，本发明自主设计合成的近红外二区荧光基团SQ1050的合成步骤如下式所示：称取原料7.0mmol化合物1和3.5mmol化合物2置入茄形瓶中，再各加入50mL 的正丁醇和甲苯，加热回流8小时，旋蒸掉溶剂，得中间体化合物3。然后，上述中间体化合物3加入3.5mmol茚三酮及50mL无水乙醇，加热回流1小时，旋蒸掉溶剂，再用甲醇重结晶得到近红外二区荧光基团SQ1050，产率47.9％。

最后，TKPSQ-1的合成步骤如下式所示：

称取0.50mmol化合物TKP，0.50mmol化合物SQ1050，0.6mmol DIEA，0.6mmolEDC.HC1于50mL三口瓶中，加入25mL DMF溶解，氩气保护，室温搅拌10小时。减压蒸馏，除去溶剂，粗产物通过高效液相色谱分离提纯，得产物TKPSQ-1，产率92.5％，如图1所示，HPLC纯度99％，MALDI-TOF(m/z)：理论值999.05，实验值 [M+H]

实施例2.

TKPSQ-2探针的合成工艺为：

首先，本发明自主设计环状多肽PEP的合成步骤如下式所示：

(1)将2-氯三苯甲基氯树脂(309mg,0.810mmol/g,0.25mmol,1equiv.)置于反应瓶中加入DCM溶胀，加入Fmoc-D-Glu(OBn)-OH(0.75mmol,3.0equiv)和DIEA(2.5mmol,10equiv)反应3小时得到与D-Glu(OBn)-OH偶联的树脂；

(2)加入有机碱六氢哌啶，在DMF溶液中，室温条件下反应3小时后，再脱除 Fmoc保护基团；加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.75mmol,3.0equiv)、缩合剂DIC(1.5mmol, 6.0equiv)，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH与上述树脂偶联；

(3)依次重复步骤(2)，其中氨基酸依次替换为Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂A。

(4)加入有机碱六氢哌啶，在DMF溶液中，室温条件下反应3小时后，再脱除 Fmoc保护基团；加入含有2.5％TFA的DCM裂解树脂A，抽滤得到线性多肽B。

(5)将上述线性多肽B，0.5mmol NHS，0.5mmol EDC.HC1置于500mL三口瓶中，加入250mL DMF溶解，氩气保护，室温搅拌10小时，将线性多肽B首位氨基酸偶联，环化形成环状多肽C。

(6)将上述环状多肽C，0.1mmol Pd/C催化剂置于50mL三口瓶中，加入25mL DMF溶解，通入氢气，室温搅拌2小时，将保护基团苄基Bn脱除，经C18制备柱分离制备得到环状多肽PEP。

最后，TKPSQ-2探针的合成步骤如下式所示：

称取0.20mmol PEP多肽，0.20mmol TKPSQ-1，0.6mmol DIEA，0.6mmol EDC.HC1 于50mL三口瓶中，加入25mL DMF溶解，氩气保护，室温搅拌10小时。减压蒸馏，除去溶剂，粗产物加入95％三氟乙酸，室温搅拌3小时后，减压蒸馏，除去溶剂，得黑色粘稠状粗产物，高效液相色谱分离提纯，得产物TKPSQ-2，产率84.2％。如图 2所示，HPLC纯度99％，MALDI-TOF(m/z)：理论值1580.67，实验值[M+H]

实施例3.

探针TKPSQ-1与酪氨酸激酶反应前后吸收光谱与荧光光谱变化：

称取1mg探针TKPSQ-1，配成1mL的1mM二甲亚砜母液。将25μL的上述母液滴加到0.5mL磷酸盐缓冲溶液中，然后加入60μL的100μg/mL的酪氨酸激酶溶液，再用磷酸盐缓冲溶液定容到1mL，在37℃下反应30min，同时每隔5min测量上述溶液的荧光光谱。

图3结果表明，随着酪氨酸激酶的加入，本发明中的探针TKPSQ-1荧光光谱在1050nm处逐渐增强，且荧光强度增强了约10倍。

实施例4.

探针TKPSQ-1与不同浓度的酪氨酸激酶反应后的荧光强度曲线：

将25μL的上述母液滴加到0.5mL磷酸盐缓冲溶液中，然后加入0-100μL的100 μg/mL的酪氨酸激酶溶液，再用磷酸盐缓冲溶液定容到1mL，在37℃下充分反应 30min后，测量上述溶液的荧光光谱。

图4结果表明，随着不同浓度的酪氨酸激酶的加入，本发明中的探针TKPSQ-1 荧光光谱在1050nm处逐渐增强，且荧光增强与酪氨酸激酶的浓度在0-10μg/mL范围内呈线性关系，表明该探针对酪氨酸激酶具有高灵敏度。

实施例5.

探针TKPSQ-1与生物体中其他物种反应情况(选择性研究)

将25μL的上述母液滴加到0.5mL磷酸盐缓冲溶液中，然后分别加入10μg/mL 酪氨酸激酶或生物体中其他物种，再用磷酸盐缓冲溶液定容到1mL，在37℃下充分反应30min后，测量上述溶液的荧光光谱。

图5结果表明，只有酪氨酸激酶可引起探针TKPSQ-1产生明显的荧光增强，证明该探针对酪氨酸激酶具有高特异性，而其他物种的存在不干扰酪氨酸激酶的测定。

实施例6.

探针TKPSQ-2与生物体中其他物种反应情况(选择性研究)

称取1.6mg探针TKPSQ-2，配成1mL的1mM二甲亚砜母液。将25μL的上述母液滴加到0.5mL磷酸盐缓冲溶液中，然后分别加入10μg/mL酪氨酸激酶或其他生物分子，再用磷酸盐缓冲溶液定容到1mL，在37℃下充分反应30min后，测量上述溶液的荧光光谱。

图6结果表明，酪氨酸激酶可引起探针TKPSQ-2产生显著的荧光增强，其他生物分子的加入基本不会引起探针TKPSQ-2荧光增强，说明该探针对酪氨酸激酶具有高特异性。

实施例7.

探针TKPSQ-2在乳腺癌荷瘤小鼠模型中对肿瘤的靶向成像。

首先建立人乳腺癌小鼠模型，大量培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞，收集对数生长期的细胞，去除培养液，用PBS洗涤两次，将细胞密度调整到lx 10

本发明探针做为外科手术荧光导航试剂在荷瘤小鼠内实施的技术方案如下：

1)探针TKPSQ-2可溶于PBS溶液或生理盐水溶液，配制成工作液，尾静脉注射或局部注射至小鼠体内；

2)探针TKPSQ-2经血液循环，可特异性聚集靶向到肿瘤部位；

3)探针TKPSQ-2在非肿瘤组织区域无荧光信号或荧光信号强度较弱，在肿瘤组织部位荧光信号强度很强。

4)利用活体近红外二区荧光成像技术，根据荧光信号，精确成像肿瘤位置，为外科手术提供导航。