一种与子宫内膜容受性辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物，包括hsa‑miR‑16‑2‑3p、hsa‑miR‑92b‑5p、hsa‑miR‑130a‑3p、has‑miR‑9024‑3p的miRNA及其引物；本发明还提供一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物的应用，其特征在于：包括以下步骤：S1采集母本血液，制备上清液；S2离心柱过滤管中处理并分级过滤，制备miRNA粗品；S3制备miRNA样品；S4利用试剂盒将得到的miRNA合成cDNA，进行PCR扩增体系和程序，得到miRNA的含量数据；S5构建CT含量曲线，确定不同时期的不同miRNA含量；本发明的有益效果是：通过限定miRNA及其引物，以特异性筛选后的四个引物为检测基础，实现快速准确地鉴定子宫内膜容受期。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及生殖医学领域，具体是一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物及应用。

背景技术

目前，中国不孕症的发生率约在15-20％，而且不孕不育患者的数量每年以数十万的速度递增。婚育年龄的推迟、工作压力的堆积以及生活方式的改变等因素直接或间接地减低了人们的生育能力。随着世界上首例试管婴儿的降生，体外受精-胚胎移植（IVF-ET）已成为不孕女性尽快获得妊娠的有效途径。尽管辅助生殖技术的发展和技术革新，使得大部分不孕症患者已经能够通过胚胎体外培养技术获得优质胚胎进而妊娠，但是仍有一部分优质胚胎在妊娠早期甚至极早期发生丢失。研究表明，胚胎因素和子宫内膜容受性因素与胚胎成功种植存在着一定的相关性。

子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚胎的能力，即允许受精卵定位、黏附、侵入并使内膜间质发生改变从而植入子宫内膜的一种能力。子宫内膜容受性有一定的时间限制，这段时间被称为“种植窗”期（Windows of Implantation，WOI）。“种植窗”期也称为容受期，一般出现在排卵后的6~8 d 或受精后的5~7 d，需要由黄体分泌的雌、孕激素的支持，同时也受多种基因、蛋白质、细胞因子和粘附分子的影响，而在辅助生殖中的体外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）中，通常会建立人工模拟月经周期，在子宫内膜达到7毫米时，通过给与不同剂型的黄体酮，使子宫内膜从增殖状态转化分化状态，这个给黄体酮的时机被称为黄体转化期，黄体转化期后的第3-5天可以把胚胎放入子宫内。正常情况下，只有黄体转化期后第5天左右，子宫内膜能容受胚胎，其他时候胚胎不被容受也就不会着床。

胚胎植入与种植窗口开放的同步化，是着床成功的必要条件，2/3 的反复种植失败的是由于子宫内膜容受性不足引起，因此良好的子宫内膜容受性是成功的胚胎植入必备条件。而目前的常规检测手段是先对子宫内膜进行活检，因活检为有创手术，因此需要在下一个IVF-ET周期进行胚胎移植，而两个周期之间存在不同的周期其容受性的误差，消耗大量时间的同时对母体的损害也不可逆。

而大量研究表明，子宫内膜容受性和多个基因（如同源框基因A10、同源框基因C8、半乳糖凝集素-3、单外显子基因叉头框L2、人类与果蝇ems 的同源结构域基因Emx2 等）、蛋白（如IV 型胶原蛋白、妊娠相关蛋白、雌激素受体、孕激素受体、骨桥蛋白、整合素等）、细胞因子（如LIF 、IGF1、白细胞介素Ⅰ、集落刺激因子Ⅰ、血管内皮生长因子等）、卵巢甾体激素等有关。

miRNA 是一种非编码RNA，高度保守，长度约18~22 核苷酸，通过靶向mRNA 进行切割或转录抑制来调节转录后水平的基因表达。miRNA 广泛存在于细胞和组织中，参与多种生物过程。研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。现有的成熟的技术，包括定性和定量miRNA分子的技术，表明利用血清miRNAs作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分子标记方法将更加有效，为生物标志物开拓了新境界。并且已有研究表明miRNA 的调节与生殖障碍有关，如多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、子宫内膜息肉、输卵管积水等。

因此联合miRNA对子宫容受性进行检测，无害且准确检测不同时期的母体的miRNA含量并具体化，从而为后续的容受性时期的确定提供数据支撑。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物及应用，以至少达到快速无害且准确地确定子宫内膜容受性目的。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物，包括hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-92b-5p、hsa-miR-130a-3p、has-miR-9024-3p的miRNA及其引物。

优选的，为了进一步实现快速准确的目的，所述的miRNA的引物包括hsa-miR-16-2-3p的引物如SEQ ID No.1所示，hsa-miR-92b-5p的引物如SEQ ID No.2所示，hsa-miR-130a-3p的引物如SEQ ID No.3所示，has-miR-9024-3p的引物如SEQ ID No.4所示；通过限定miRNA的标志引物，以特异性筛选后的四个引物为检测基础，构建复合检测的引物，从而能大量扩增出需要检测的miRNA序列，使检测的数据样本足够大，从而实现快速准确的目的。

优选的，为了进一步实现准确的目的，所述的miRNA包括hsa-miR-16-2-3p的标志物序列如SEQ ID No.5所示，hsa-miR-92b-5p的引物如SEQ ID No.6所示，hsa-miR-130a-3p的引物如SEQ ID No.7所示，has-miR-9024-3p的引物如SEQ ID No.8所示；通过再次限定标志物的DNA序列，从而与引物序列相适配，构建出完整的检测工具，进而配合引物，对待检测的miRNA进大量扩增，从而实现快速准确的目的。

优选的，为了进一步实现快速无害的目的，所述的引物在制备子宫内膜容受性辅助诊断试剂盒中的应用；所述的诊断试剂盒用于检测与子宫内膜容受性辅助诊断相关的血清/血浆miRNA标志物；所述的试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂；通过以设计的引物，构建检测试剂盒，以母体的外周血浆/血清为直接检测样品对象，从而避免对母体进行活检，避免对母体产生损害，同时PCR整体的检测周期较短，从而实现快速无害的目的。

本发明还提供一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物的应用，包括以下步骤：

S1以含EDTA抗凝因子的采血管采集不同母体黄体转化期的样品血液，静置后离心，收集上清液；

S2针对得到上清液，在室温的条件下加入QIAzol Lysis Reagent组织溶解试剂，静置后，再加入氯仿溶液，振荡后静置，离心，得到混合上清液，将得到的混合上清液中加入无水乙醇，混合均匀后，加入RNeasy MinElute spin column离心柱过滤管中，分级过滤，弃过滤液，得到在离心柱过滤管中的miRNA粗品；

S3将得到的miRNA粗品再次离心，离心后的离心柱过滤管转入miRNA收集管中，并加入RNase-free water至离心柱过滤管的过滤膜整个没入溶液中，离心收集，得到miRNA样品；

S4利用Takara Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis（Cat. No. 638313）试剂盒将得到的miRNA合成cDNA，选取hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-92b-5p、hsa-miR-130a-3p、has-miR-9024-3p的miRNA标志物的引物，与得到的cDNA混合，进行PCR扩增体系和程序，检测扩增后的miRNA的含量，得到miRNA的含量数据；

S5通过miRNA的含量数据，构建C

优选的，为了进一步实现快速准确的目的，所述的分级过滤为：

a.在离心柱过滤管中先加入700 μL Buffer BWT，随后采用8000 ×g的离心力，室温下离心15s，废弃过滤液；

b.再加入500μL Buffer RPE到离心柱过滤管中，随后采用8000 ×g的离心力，室温下离心15s，废弃过滤液；

c.再加入500μL 80%乙醇至离心柱过滤管中，随后采用8000 ×g的离心力，室温下离心2min，废弃过滤液，即完成所述的分级过滤；

通过进行多级过滤，使样品中的miRNA能够充分净化，从而防止其他DNA的干扰，从而实现快速准确的目的。

优选的，为了进一步实现快速准确的目的，所述的miRNA合成cDNA具体过程为，在所述的试剂盒中，将3.75μL的miRNA样品、5μL 的mRQ Buffer（2x）、1.25μL的 mRQ Enzyme加入200μL的 RNase-free的EP管中，混合均匀后，再将EP管加热37℃，保温1h，再加热至85℃，保温5min，随后加入90μL的ddH

优选的，为了进一步实现快速准确的目的，所述的PCR扩增体系为：2μL的cDNA溶液，0.5μL的miRNA标志物引物，0.5μL 的10 μmol/L的mRQ 3’ Primer ，12.5μL的 TB GreenAdvantage Premix（2X），0.5μL的ROX Dye（50X）以及9μL的ddH

所述的扩增程序为95℃预变性10min，40次循环95℃15s、60℃30s扩增目的序列，溶解反应为95℃ 15s，60℃ 60s、95℃ 15s；通过限定PCR扩增的体系和程序，大量扩增出cDNA的数量，从而方便扩增后整体的cDNA数量的测定，从而间接地推导出miRNA的含量，进而实现快速准确的目的。

本发明的有益效果是：

1. 通过限定miRNA及其引物，以特异性筛选后的四个引物为检测基础，构建复合检测的引物，从而能大量扩增出需要检测的miRNA序列，使检测的数据样本足够大，从而实现快速准确的目的。

2. 通过以设计的引物，构建检测试剂盒，以母体的外周血浆/血清为直接检测样品对象，从而避免对母体进行活检，避免对母体产生损害，同时PCR整体的检测周期较短，从而实现快速无害的目的。

3. 通过再次限定标志物的DNA序列，从而与引物序列相适配，构建出完整的检测工具，进而配合引物，对待检测的miRNA进大量扩增，从而实现快速准确的目的。

4. 通过进行多级过滤，使样品中的miRNA能够充分净化，从而防止其他DNA的干扰，从而实现快速准确的目的。

5. 通过将miRNA逆转录成互补的DNA，从而利用互补链直接进行PCR扩增，得到大量样本，从而实现快速准确的目的。

6. 通过限定PCR扩增的体系和程序，大量扩增出cDNA的数量，从而方便扩增后整体的cDNA数量的测定，从而间接地推导出miRNA的含量，进而实现快速准确的目的。

附图说明

图1为不同时期的不同miRNA含量的hsa-miR-16-2-3p的C

图2为不同时期的不同miRNA含量的hsa-miR-92b-5p的CT曲线示意图；

图3为不同时期的不同miRNA含量的hsa-miR-130a-3p的C

图4为不同时期的不同miRNA含量的has-miR-9024-3p的CT曲线示意图；

其中，*表示p值＜0.05；

图5为ROC曲线示意图。

具体实施方式

下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1

一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物，包括hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-92b-5p、hsa-miR-130a-3p、has-miR-9024-3p的miRNA及其引物。

为了进一步实现快速准确的目的，所述的miRNA的引物包括hsa-miR-16-2-3p的引物如SEQ ID No.1所示，hsa-miR-92b-5p的引物如SEQ ID No.2所示，hsa-miR-130a-3p的引物如SEQ ID No.3所示，has-miR-9024-3p的引物如SEQ ID No.4所示；通过限定miRNA的标志引物，以特异性筛选后的四个引物为检测基础，构建复合检测的引物，从而能大量扩增出需要检测的miRNA序列，使检测的数据样本足够大，从而实现快速准确的目的。

为了进一步实现准确的目的，所述的miRNA包括hsa-miR-16-2-3p的标志物序列如SEQ ID No.5所示，hsa-miR-92b-5p的引物如SEQ ID No.6所示，hsa-miR-130a-3p的引物如SEQ ID No.7所示，has-miR-9024-3p的引物如SEQ ID No.8所示；通过再次限定标志物的DNA序列，从而与引物序列相适配，构建出完整的检测工具，进而配合引物，对待检测的miRNA进大量扩增，从而实现快速准确的目的。

上述的miRNA及其引物的寡核苷酸序列如表1所示。

表1 各miRNA序列及其引物序列情况表

其中，由于miRNA单链在合成cDNA时，可以在miRNA的序列3端添加AAAAAAAA这样的单一重复核苷酸序列，因此可以不需要3端的引物序列。

为了进一步实现快速无害的目的，所述的引物在制备子宫内膜容受性辅助诊断试剂盒中的应用；所述的诊断试剂盒用于检测与子宫内膜容受性辅助诊断相关的血清/血浆miRNA标志物；所述的试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂；通过以设计的引物，构建检测试剂盒，以母体的外周血浆/血清为直接检测样品对象，从而避免对母体进行活检，避免对母体产生损害，同时PCR整体的检测周期较短，从而实现快速无害的目的。

本发明还提供一种辅助诊断子宫内膜容受性的miRNA标志物的应用，包括以下步骤：

S1以含EDTA抗凝因子的采血管采集不同母体黄体转化期的样品血液2ml，其中不同母体的黄体转化期为黄体转化期（LH=0）、黄体转化后第4天（LH=4）、黄体转化后第5天（LH=5）以及黄体转化后第6天（LH=6），采血完成后，轻柔地上下颠倒采血管5次，室温条件下静置30min后，以1200×g的离心力在24℃条件下离心10min，采用1.5 ml的EP管收集，随后再次以1200×g的离心力在4℃条件下离心15min，收集离心后的浅黄色上清液并于-80℃条件下保存；

S2针对得到上清液，使用Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) CatNo.21784对血浆样本中的miRNA进行提取，具体为：在室温的条件下，取200μL室温下保存的上清液，再加入1000μl的QIAzol Lysis Reagent组织溶解试剂，以移液枪反复吹打10次后，在室温条件下静置5min后，再加入200μL的氯仿溶液，并经过涡旋震荡混合15s后在室温条件下静置3min，以1200×g的离心力在4℃条件下离心15min，得到混合上清液，将得到的混合上清液转入1.5ml 的EP管中并加入900μl无水乙醇，混合均匀后，取700μl加入RNeasyMinElute spin column离心柱过滤管中，以8000×g的离心力在室温条件下离心15s，分级过滤，弃过滤液，得到在离心柱过滤管中的miRNA粗品；

S3将得到的miRNA粗品打开离心柱过滤管的盖子后，放置在全新的2ml收集管中，以14000×g的离心力在室温条件下再次离心5min，废弃2ml收集管，离心后的离心柱过滤管转入miRNA收集管中，并加入14μl的 RNase-free water至离心柱过滤管的过滤膜整个没入溶液中，以14000×g的离心力在室温条件下离心1min后收集，得到miRNA样品；

S4利用Takara Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis（Cat. No. 638313）试剂盒将得到的3.75μl的miRNA合成cDNA，选取hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-92b-5p、hsa-miR-130a-3p、has-miR-9024-3p的miRNA标志物的引物，与2μl的得到的cDNA混合，进行PCR扩增体系和程序，检测扩增后的miRNA的含量，得到miRNA的含量数据；

S5通过miRNA的含量数据，如图1至图4所示，构建C

为了进一步实现快速准确的目的，所述的分级过滤为：

a.在离心柱过滤管中先加入700 μL Buffer BWT，随后采用8000 ×g的离心力，室温下离心15s，废弃过滤液；

b.再加入500μL Buffer RPE到离心柱过滤管中，随后采用8000 ×g的离心力，室温下离心15s，废弃过滤液；

c.再加入500μL 80%乙醇至离心柱过滤管中，随后采用8000 ×g的离心力，室温下离心2min，废弃过滤液，即完成所述的分级过滤；

通过进行多级过滤，使样品中的miRNA能够充分净化，从而防止其他DNA的干扰，从而实现快速准确的目的。

为了进一步实现快速准确的目的，所述的miRNA合成cDNA具体过程为，在所述的试剂盒中，将3.75μL的miRNA样品、5μL 的mRQ Buffer（2x）、1.25μL的 mRQ Enzyme加入200μL的 RNase-free的EP管中，混合均匀后，再将EP管加热37℃，保温1h，再加热至85℃，保温5min，随后加入90μL的ddH

为了进一步实现快速准确的目的，所述的PCR扩增体系为：2μL的cDNA溶液，0.5μL的miRNA标志物引物，0.5μL 的10 μmol/L的mRQ 3’ Primer ，12.5μL的 TB GreenAdvantage Premix（2X），0.5μL的ROX Dye（50X）以及9μL的ddH

所述的扩增程序为95℃预变性10min，40次循环95℃变性15s、60℃退火30s，制备溶解反应曲线95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s；通过限定PCR扩增的体系和程序，大量扩增出cDNA的数量，从而方便扩增后整体的cDNA数量的测定，从而间接地推导出miRNA的含量，进而实现快速准确的目的。

实施例2

通过最终确定不同时期的不同miRNA含量数据，以多重回归分析构筑四种miRNA标志物的组合的ROC曲线，四种miRNA（hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-92b-5p、hsa-miR-130a-3p、has-miR-9024-3p）的组合在ROC曲线（AUC）下产生的最大面积如图5所示，图中曲线的AUC值为0.857、界限值为2.51、敏感性为83.33、特异性为85.71，同时针对曲线进行推导，得到预测指数为：

预测指数=0.4167*(miR-16-2-3p)的CT值 + 0.1651*(miR-92b-5p) 的CT值+0.3273*(miR-130a-3p) 的CT值 + 0.0909*(miR-9025-3p) 的CT值。

通过预测指数进行整个样本的容受性预测，以LH=5当天样本进行检测，随机抽取200个样品，对比实际检测数据，准确率可达到85%明了本发明的优越性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都西囡妇科医院有限公司

<120> 一种与子宫内膜容受性辅助诊断相关的miRNA标志物及其应用

<130> 2021.02.07

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<170> PatentIn version 3.3

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