一种基于环境DNA技术监测淡水底栖动物群落多样性的方法

摘要

本发明公开一种基于环境DNA技术监测淡水底栖动物群落多样性的方法，包括步骤：(1)采集表层水样；(2)水样过滤与eDNA提取；(3)PCR扩增；(4)高通量测序，获得OTU的代表序列；(5)底栖动物比对数据库的建立；(6)比对建立的底栖动物数据库，对待测样品OTUs代表性序列进行物种注释。本发明取样简单、人力成本低，检测方便快捷，无需对底栖动物进行形态学鉴定。

说明书

技术领域

本发明属于分子生态学领域，具体涉及一种基于环境DNA技术监测淡水底栖动物群落多样性的方法。

背景技术

大型底栖无脊椎动物(Benthic macroinvertebrates)，通常简称为底栖动物，系指生活史的全部或者大部分时间生活于水体底部，体长超过0.5mm的水生无脊椎动物群。水环境中的底栖动物分布广泛且种类繁多，主要包括环节动物门的寡毛纲和蛭纲，软体动物门的腹足纲和双壳纲，节肢动物门的昆虫纲和甲壳纲等。由于底栖动物具有个体较大，易于采集、固定和鉴定，活动场所较固定，寿命较长，对环境变化反应敏感等优点，常作为指示生物在水环境生态系统健康评价中发挥重要作用。

传统的底栖动物多样性监测流程主要包括沉积物样品采集、人工样品分拣、形态学鉴定等过程，其不足之处在于样品采集与分拣过程时间和人力成本高，种类鉴定则需要具备较高的专业要求。环境DNA(Environmental DNA,eDNA)是指生物体生活环境中直接提取到的DNA片段的总和，包括不同生物体释放到环境中的胞内DNA和细胞裂解或死亡后的胞外DNA等。通过提取环境DNA样本，利用分子手段监测底栖动物多样性可以有效克服传统底栖动物监测中存在的一些弊端。

利用环境样本监测水生生物多样性的技术已有相关专利申请公开。中国专利申请201910216942.6公开了一种基于环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法，包括取样、提取eDNA、PCR扩增、回收和纯化目的片段、构建目的片段文库、OTU聚类、建立鱼类比对数据库、OTUs代表性序列与建立的鱼类数据库的数据信息进行比对分析，确定待测水域中鱼类的物种多样性组成。该专利申请方法取样简单，检测方便、快速、精度高，检测结果准确。

中国专利申请202010530165.5公开了一种利用环境沉积物样品监测淡水底栖动物的方法，包括步骤：(1)采集环境沉积物样本，清洗后保存；(2)向步骤(1)保存的环境沉积物样本中加入无水乙醇进行浸提处理，处理一段时间后取混合均匀的浸提液，将所述浸出液进行真空离心，弃上清液，获得干燥的组织残渣，进行DNA提取；(3)利用提取得到的DNA条形码片段进行扩增，得到扩增产物；(4)将扩增产物进行测序与分析。该专利申请方法可实现大范围环境样品的准确监测。

上述方法也还存在一些缺陷，比如在实际水环境中，由于受采样设备、岸边条件等的限制，往往不一定能够采集到沉积物，故难以通过沉积物样本提取到eDNA。此外，上述方法针对底栖动物鉴定技术领域，缺乏构建一套基于eDNA技术的底栖动物采集-样品前处理-基因测序-物种注释的完整监测体系。

发明内容

为解决现有技术中存在的不足，本发明的目的在于，提供一种取样简单、检测方便快捷的、基于环境DNA技术监测淡水底栖动物多样性的完整监测方法，并对其中关键步骤进行优化。

本发明采用如下的技术方案：

一种基于环境DNA技术监测淡水底栖动物群落多样性的方法，所述方法包含：步骤1.采集监测区域的表层水样；步骤2.水样过滤与eDNA提取；步骤3.PCR扩增；步骤4.高通量测序，获得OTU的代表序列；步骤5.底栖动物比对数据库的建立；步骤6.比对建立的底栖动物数据库，对待测样品OTUs代表性序列进行物种注释。

所述步骤1：表层水样采集量为4.5L，4℃冷藏保存。

所述步骤2：采集的水样通过0.7μm的玻璃纤维滤膜过滤。

使用DNeasy PowerSoil试剂盒对所述过滤过水样的滤膜进行DNA提取，提取的DNA保存于-80℃。

所述步骤3：以提取得到的DNA为模板，以通用引物COlintF和HCO2198进行PCR扩增，得到扩增产物；用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，利用Takara MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction kit Ver.4.0试剂盒对PCR产物进行切胶回收和纯化。

所述PCR扩增体系为20μL，包括4μL 5×FastPfu Buffer，2μL 2.5mM dNTPs，0.8μLForward Primer 5μM，0.8μL Reverse Primer 5μM，0.4μL FastPfu Polymerase，0.2μLBSA和10ng Template DNA，补ddH

所述步骤4：纯化后的PCR产物片段进行高通量测序，数据结果经优化后获得高质量序列，优化标准为(1)去除3’端adoptor,保留序列长度≥20bp，且质量≥20的序列；(2)去除含N碱基序列，对序列3’端和5’端进行质量剪切；(3)去除剪切后长度＜20bp及质量＜20的序列，保留高质量的pair序列和single序列。使用Uparse 7.1按照97％相似性对高质量序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。

所述高通量测序是：对纯化后的PCR产物片段用QuantiFluorTM-ST荧光定量系统进行定量检测，纯化后的PCR产物经等比例混合后使用Illumina Miseq平台进行双端测序。

所述步骤7：底栖动物比对数据库构建方法是从NCBI Nucleotide数据库中下载COI基因序列，关键词设置为“Oligochaeta”、“Polychaeta”、“Hirudinea”、“Viviparidae”、“Neritidae”、“Valvatidae”、“Bithyniidae”、“Hydrobiidae”、“Ancylidae”、“Acroloxidae”、“Planorbidae”、“Lymnaeidae”、“Physidae”、“Corbiculidae”、“Sphaeriidae”、“Dreissenidae”、“Unionidae”、“Margaritanidae”、“Hydrachnidia”、“Assimineidae”、“Plenroseridae”、“Mytilidae”、“Solecurtidae”、“Spongillidae”、“Hydridae”、“Clavidae”、“Petasidae”、“Turbellaria”、“Nemertea”、“Nemathelminthes”、“Polyzoa”、“Crustacea”、“Ephemeroptera”、“Plecoptera”、“Odonata”、“Aphelocheiridae”、“Gelastocoridae”、“Corixidae”、“Nepidae”、“Belostomatidae”、“Notonectidae”、“Naucoridae”、“Pleidae”、“Helotrephidae”、“Ochteridae”、“Leptopododae”、“Saldidae”、“Hebridae”、“Mesvoveliidae”、“Hydrometridae”、“Veliidae”、“Gerridae”、“Corydalidae”、“Sialidae”、“Sisyridae”、“Neurorthidae”、“Osmlylidae”、“Pyralidae”、“Crambidae”、“Nymphulinae”、“Trichoptera”、“Lepiceridae”、“Hydroscaphidae”、“Sphaerlidae”、“Torridinicolidae”、“Hydroscaphidae”、“Gyrinidae”、“Haliplidae”、“Amphizoidae”、“Omophronidae”、“Carabidae”、“Hydrobiidae”、“Phreatodytidae”、“Noteridae”、“Dytiscidae”、“Hydraenidae”、“Spercheidae”、“Georissidae”、“Hydrochidae”、“Hydrophilidae”、“Ptiliidae”、“Staphylinidae”、“Lampyridae”、“Melyridae”、“Histeridae”、“Phycosecidae”、“Scirtidae”、“Heteroceridae”、“Ptilodactylidae”、“Psephenidae”、“Limnichidae”、“Dryopidae”、“Elmididae”、“Anthicidae”、“Tenebrionidae”、“Elacatidae”、“Chrysomeiidae”、“Curculionidae”、“Apionidae”、“Tipulidae”、“Blephariceridae”、“Nymphomyiidae”、“Deuterophlebiidae”、“Corethrellidae”、“Chaobodidae”、“Culicidae”、“Ptychopteridae”、“Dixidae”、“Tanyderidae”、“Simuliidae”、“Thaumaleidae”、“Ceratopogonidae”、“Chironomidae”、“Psychodidae”、“Stratiomyidae”、“Tabanidae”、“Athericidae”、“Pelecorhynchidae”、“Dolichopodidae”、“Empididae”、“Canacidae”、“Syrphidae”、“Phoridae”、“Sciomyzidae”、“Dryomyzidae”、“Ephydridae”、“Muscidae”、“Scathophagidae”、“COI”和“cytochrome c oxidase subunit I gene”，构成序列集。

利用CD-HIT(v 4.6.1)软件对所得序列集去冗余处理，其相似性阈值和序列对齐度均设置为100％。

所述步骤7：根据NCBI物种分类信息手动剔除错误序列。

所述步骤8：采用RDP classifier贝叶斯算法将97％相似水平的OTU代表序列与建立的底栖动物数据库的数据信息进行比对分析，确定待测水域中底栖动物群落组成。

本发明方法具体如下：

(1)采集研究区域内的表层水；

(2)将采集的水样进行过滤预处理，并提取eDNA；

(3)以提取得到的DNA为模板，COlintF和HCO2198为引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

(4)使用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用Takara MiniBEST Agarose GelDNA Extraction kit Ver.4.0试剂盒对PCR产物进行回收、纯化；

(5)纯化后的片段进行高通量测序，数据结果经优化后获得高质量序列；

(6)使用Uparse 7.1按照97％相似性对高质量序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列；

(7)建立底栖动物比对数据库；

(8)采用RDP classifier贝叶斯算法将97％相似水平的OTU代表序列与建立的底栖动物数据库的数据信息进行比对分析，确定待测水域中底栖动物群落组成。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明仅需采集表层水样即可监测淡水环境中存在的底栖动物群落，取样简单，操作方便；

2.本发明无需对底栖动物进行形态学鉴定，检测便捷、精度高、结果可靠。

附图说明

图1本发明基于环境DNA技术的淡水底栖动物群落多样性监测体系方法关键步骤优化内容图示；

图2为使用COlintF和HCO2198引物扩增水体eDNA样品的凝胶图谱；

图3为基于环境eDNA技术检测所取水样的底栖动物相对丰度组成。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本申请的保护范围。

本发明一种基于环境DNA技术监测淡水底栖动物群落多样性的方法，所述方法包含：步骤1.采集监测区域的表层水样；步骤2.水样过滤与eDNA提取；步骤3.PCR扩增；步骤4.高通量测序，获得OTU的代表序列；步骤5.底栖动物比对数据库的建立；步骤6.比对建立的底栖动物数据库，对待测样品OTUs代表性序列进行物种注释。

所述步骤1：表层水样采集量为4.5L，4℃冷藏保存。

所述步骤2：采集的水样通过0.7μm的玻璃纤维滤膜过滤。

使用DNeasy PowerSoil试剂盒对所述过滤过水样的滤膜进行DNA提取，提取的DNA保存于-80℃。

所述步骤3：以提取得到的DNA为模板，以通用引物COlintF和HCO2198进行PCR扩增，得到扩增产物；用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，利用Takara MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction kit Ver.4.0试剂盒对PCR产物进行切胶回收和纯化。

所述PCR扩增体系为20μL，包括4μL 5×FastPfu Buffer，2μL 2.5mM dNTPs，0.8μLForward Primer 5μM，0.8μL Reverse Primer 5μM，0.4μL FastPfu Polymerase，0.2μLBSA和10ng Template DNA，补ddH

所述步骤4：纯化后的PCR产物片段进行高通量测序，数据结果经优化后获得高质量序列；使用Uparse 7.1按照97％相似性对高质量序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。

所述高通量测序是：对纯化后的PCR产物片段用QuantiFluorTM-ST荧光定量系统进行定量检测，纯化后的PCR产物经等比例混合后使用Illumina Miseq平台进行双端测序。

所述步骤7：底栖动物比对数据库构建方法是从NCBI Nucleotide数据库中下载COI基因序列，关键词设置为“Oligochaeta”、“Polychaeta”、“Hirudinea”、“Viviparidae”、“Neritidae”、“Valvatidae”、“Bithyniidae”、“Hydrobiidae”、“Ancylidae”、“Acroloxidae”、“Planorbidae”、“Lymnaeidae”、“Physidae”、“Corbiculidae”、“Sphaeriidae”、“Dreissenidae”、“Unionidae”、“Margaritanidae”、“Hydrachnidia”、“Assimineidae”、“Plenroseridae”、“Mytilidae”、“Solecurtidae”、“Spongillidae”、“Hydridae”、“Clavidae”、“Petasidae”、“Turbellaria”、“Nemertea”、“Nemathelminthes”、“Polyzoa”、“Crustacea”、“Ephemeroptera”、“Plecoptera”、“Odonata”、“Aphelocheiridae”、“Gelastocoridae”、“Corixidae”、“Nepidae”、“Belostomatidae”、“Notonectidae”、“Naucoridae”、“Pleidae”、“Helotrephidae”、“Ochteridae”、“Leptopododae”、“Saldidae”、“Hebridae”、“Mesvoveliidae”、“Hydrometridae”、“Veliidae”、“Gerridae”、“Corydalidae”、“Sialidae”、“Sisyridae”、“Neurorthidae”、“Osmlylidae”、“Pyralidae”、“Crambidae”、“Nymphulinae”、“Trichoptera”、“Lepiceridae”、“Hydroscaphidae”、“Sphaerlidae”、“Torridinicolidae”、“Hydroscaphidae”、“Gyrinidae”、“Haliplidae”、“Amphizoidae”、“Omophronidae”、“Carabidae”、“Hydrobiidae”、“Phreatodytidae”、“Noteridae”、“Dytiscidae”、“Hydraenidae”、“Spercheidae”、“Georissidae”、“Hydrochidae”、“Hydrophilidae”、“Ptiliidae”、“Staphylinidae”、“Lampyridae”、“Melyridae”、“Histeridae”、“Phycosecidae”、“Scirtidae”、“Heteroceridae”、“Ptilodactylidae”、“Psephenidae”、“Limnichidae”、“Dryopidae”、“Elmididae”、“Anthicidae”、“Tenebrionidae”、“Elacatidae”、“Chrysomeiidae”、“Curculionidae”、“Apionidae”、“Tipulidae”、“Blephariceridae”、“Nymphomyiidae”、“Deuterophlebiidae”、“Corethrellidae”、“Chaobodidae”、“Culicidae”、“Ptychopteridae”、“Dixidae”、“Tanyderidae”、“Simuliidae”、“Thaumaleidae”、“Ceratopogonidae”、“Chironomidae”、“Psychodidae”、“Stratiomyidae”、“Tabanidae”、“Athericidae”、“Pelecorhynchidae”、“Dolichopodidae”、“Empididae”、“Canacidae”、“Syrphidae”、“Phoridae”、“Sciomyzidae”、“Dryomyzidae”、“Ephydridae”、“Muscidae”、“Scathophagidae”、“COI”和“cytochrome c oxidase subunit I gene”，构成序列集。

利用CD-HIT(v 4.6.1)软件对所得序列集去冗余处理，其相似性阈值和序列对齐度均设置为100％。

所述步骤7：根据NCBI物种分类信息手动剔除错误序列。

所述步骤8：采用RDP classifier贝叶斯算法将97％相似水平的OTU代表序列与建立的底栖动物数据库的数据信息进行比对分析，确定待测水域中底栖动物群落组成。

更具体地，按照如下步骤进行操作：

一、水样采集

在南水北调输水干线选取1个监测站点开展底栖动物群落监测，采集该监测站点表层混合水样4.5L，4℃冷藏运回实验室以备后续分析。

二、水样预处理及DNA提取

对采集到的水样进行抽滤处理，滤膜采用0.7μm的玻璃纤维滤膜。使用QIAGEN公司生产的DNeasy PowerSoil Pro Kit试剂盒对滤膜上的DNA进行提取，提取好的DNA保存于-80℃冰箱内。

三、PCR扩增

采用COlintF和HCO2198引物对DNA进行扩增。其中，COlintF的引物序列为GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC，HCO2198的引物序列为TAAACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA。20μLPCR扩增体系包括4μL 5×FastPfu Buffer，2μL 2.5mM dNTPs，0.8μL Forward Primer(5μM)，0.8μL Reverse Primer(5μM)，0.4μL FastPfu Polymerase，0.2μL BSA和10ngTemplate DNA，补ddH

四、回收、纯化目的片段及测序

利用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.4.0试剂盒对合格的PCR产物进行回收、纯化，并用QuantiFluorTM-ST荧光定量系统进行定量检测，纯化后的PCR产物经等比例混合后使用Illumina Miseq平台进行双端测序。

五、数据优化及OTU聚类

测序结束后，得到的原始FASTQ序列使用FLASH和Trimmomatic软件进行质控，使用UCHIME去除单序列和嵌合体，使用Uparse 7.1按照97％相似性对优化序列进行OTU聚类。

六、底栖动物数据库建立

构建底栖动物比对数据库，具体方法为从NCBI Nucleotide数据库中下载COI基因序列，关键词设置为“Oligochaeta”、“Polychaeta”、“Hirudinea”、“Viviparidae”、“Neritidae”、“Valvatidae”、“Bithyniidae”、“Hydrobiidae”、“Ancylidae”、“Acroloxidae”、“Planorbidae”、“Lymnaeidae”、“Physidae”、“Corbiculidae”、“Sphaeriidae”、“Dreissenidae”、“Unionidae”、“Margaritanidae”、“Hydrachnidia”、“Assimineidae”、“Plenroseridae”、“Mytilidae”、“Solecurtidae”、“Spongillidae”、“Hydridae”、“Clavidae”、“Petasidae”、“Turbellaria”、“Nemertea”、“Nemathelminthes”、“Polyzoa”、“Crustacea”、“Ephemeroptera”、“Plecoptera”、“Odonata”、“Aphelocheiridae”、“Gelastocoridae”、“Corixidae”、“Nepidae”、“Belostomatidae”、“Notonectidae”、“Naucoridae”、“Pleidae”、“Helotrephidae”、“Ochteridae”、“Leptopododae”、“Saldidae”、“Hebridae”、“Mesvoveliidae”、“Hydrometridae”、“Veliidae”、“Gerridae”、“Corydalidae”、“Sialidae”、“Sisyridae”、“Neurorthidae”、“Osmlylidae”、“Pyralidae”、“Crambidae”、“Nymphulinae”、“Trichoptera”、“Lepiceridae”、“Hydroscaphidae”、“Sphaerlidae”、“Torridinicolidae”、“Hydroscaphidae”、“Gyrinidae”、“Haliplidae”、“Amphizoidae”、“Omophronidae”、“Carabidae”、“Hydrobiidae”、“Phreatodytidae”、“Noteridae”、“Dytiscidae”、“Hydraenidae”、“Spercheidae”、“Georissidae”、“Hydrochidae”、“Hydrophilidae”、“Ptiliidae”、“Staphylinidae”、“Lampyridae”、“Melyridae”、“Histeridae”、“Phycosecidae”、“Scirtidae”、“Heteroceridae”、“Ptilodactylidae”、“Psephenidae”、“Limnichidae”、“Dryopidae”、“Elmididae”、“Anthicidae”、“Tenebrionidae”、“Elacatidae”、“Chrysomeiidae”、“Curculionidae”、“Apionidae”、“Tipulidae”、“Blephariceridae”、“Nymphomyiidae”、“Deuterophlebiidae”、“Corethrellidae”、“Chaobodidae”、“Culicidae”、“Ptychopteridae”、“Dixidae”、“Tanyderidae”、“Simuliidae”、“Thaumaleidae”、“Ceratopogonidae”、“Chironomidae”、“Psychodidae”、“Stratiomyidae”、“Tabanidae”、“Athericidae”、“Pelecorhynchidae”、“Dolichopodidae”、“Empididae”、“Canacidae”、“Syrphidae”、“Phoridae”、“Sciomyzidae”、“Dryomyzidae”、“Ephydridae”、“Muscidae”、“Scathophagidae”、“COI”和“cytochrome c oxidase subunit I gene”。利用CD-HIT(v 4.6.1)软件对上述所得序列集进行去冗余处理，其相似性阈值和序列对齐度均设置为100％。使用BLAST软件参考NCBINucleotide数据库对得到的COI基因序列集进行物种分类，并且手动剔除错误的序列。

七、底栖动物分类学注释

采用RDP classifier贝叶斯算法将97％相似水平的OTU代表序列与建立的底栖动物数据库的数据信息进行比对，得到监测站点的底栖动物群落。结果如表1：

表1：基于环境eDNA技术检测的底栖动物物种名录

同时如附图2所示：共注释到底栖动物10属，分别隶属于5门6纲6目9科。海绵动物门相对丰度最高，占37％；其次为软体动物门(25％)与节肢动物门(19％)。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明仅需采集表层水样即可监测淡水环境中存在的底栖动物群落，取样简单，操作方便；

2.本发明无需对底栖动物进行形态学鉴定，检测便捷、精度高、结果可靠。

本发明申请人结合说明书附图对本发明的实施示例做了详细的说明与描述，但是本领域技术人员应该理解，以上实施示例仅为本发明的优选实施方案，详尽的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明的保护范围之内。