一株高效降解驴毛的坚强芽孢杆菌

摘要

本发明涉及一株高效降解驴毛的坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419，该菌株能以未经处理的干燥驴毛为唯一碳源和氮源生长，高效降解驴毛并且产生复合氨基酸、多肽和可溶性蛋白，能够特异性降解驴毛，对驴毛的降解率可达91.8％，降解效果显著。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株分泌角蛋白酶高效降解驴毛的坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419及其应用。

背景技术

阿胶加工会产生大量的驴毛废料，这些废弃的驴毛大部分被丢弃，这些材料的局部积累和不适当的管理除了会损失富含蛋白质的材料外，还会导致严重的环境问题。

驴毛主要由坚硬的角蛋白组成，角蛋白是不溶性结构蛋白家族，是哺乳动物的毛发、指甲、蹄、角等的主要成分。角蛋白废弃物构成严重的环境污染物；驴毛由90％以上的角蛋白组成，角蛋白主要由氨基酸残基组成，例如甘氨酸，缬氨酸，丝氨酸和半胱氨酸，这些氨基酸残基和其他残基通过二硫键、氢键和疏水键交联，并紧密堆积在超卷曲多肽中，形成不溶的高度稳定的结构。机械稳定性使角蛋白高度抵抗胰蛋白酶，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的蛋白水解降解。结果，驴毛的降解非常缓慢，会造成严重的环境污染，如何处理废弃驴毛是一个需要关注的问题。

角蛋白酶在许多领域都有潜在的应用前景。角蛋白酶降解驴毛对氨基酸的破坏相对机械法降解和化学法降解较小，但其降解速度慢，生产成本高，应用范围不广。因此，获得高效的驴毛降解菌，实现高活性角蛋白酶的低成本生产对规模化生产具有重要意义。

当前的处理方法是通过使用常规的物理和化学处理将驴毛转化为可消化的粉末，然而这一过程不仅破坏角蛋白氨基酸并且会降低蛋白质质量，而且会消耗大量能量。通过发展无污染工艺，角蛋白分解酶可能在生物技术工艺中具有重要用途。

大部分角蛋白酶底物范围非常广泛，既能水解明胶、酪蛋白、牛血清蛋白等可溶性蛋白，也能水解头发、羽毛、指甲、膦、胶原蛋白及弹性蛋白等不可溶蛋白；各类蛋白酶的活性不同，表明角蛋白酶具有底物特异性、多样性；目前研究较多的是以降解禽类羽毛为目的的微生物，对于驴毛降解菌剂的研究报道较少，由于羽毛结构复杂，除了主要成分角蛋白以外，还含有约15％的复杂成分，称为基质，由于与羽毛与驴毛的结构组成相差较大，所以对于微生物降解效果的影响较大。

中国专利文献CN108004169A(申请号：201711364361.4)公开了地衣芽孢杆菌ZL-1及其应用，该专利中表述了地衣芽孢杆菌ZL-1，在20-60℃温度条件内均可以生长，生长温度能达到角蛋白酶的最适反应温度40-60℃，在45-55℃条件下具有高角蛋白酶活(角蛋白酶活为52.14U/mL)，对羽毛的降解率高(降解率为90.15％)，能在羽毛和菇渣的高温快速堆肥发酵中生长量好；但是该发明并未涉及本发明所要解决的对驴毛的降解作用。

中国专利文献CN110819572A(申请号：201911232925.8)公开了一种拟蕈状芽孢杆菌，该文献表述了接种拟蕈状芽孢杆菌，发酵两天后，羽毛所剩无几，测量羽毛降解后的产物，羽毛降解液中含有0.98％的粗蛋白、有机质含量31.9g/L、游离氨基酸4.02g/L，钾6.2g/L等成分，而这些成分都是从羽毛上分解出来的，从而进一步证明该菌种具有高效降解羽毛的作用；但是该发明并未涉及本发明所要解决的对驴毛的降解作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株高效降解驴毛的坚强芽孢杆菌Bacillusfirums R419，该菌能以未经处理的干燥驴毛为唯一碳源和氮源生长，高效降解驴毛并且产生复合氨基酸、多肽和可溶性蛋白。

本发明的技术方案如下：

一种坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419，该菌株于2020年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市，武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2020666。

所述坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419，以下简称Bacillus firums R419。

所述菌种Bacillus firums R419由实验室筛选自济南大学甲子湖湖底污泥。

上述坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419的培养方法，包括如下步骤：

将菌种Bacillus firums R419涂布于LB固体平板上活化，挑取活化菌种接种于LB液体培养基培养制得种子液，再将制得种子液接种于LB液体培养基发酵制得菌种Bacillusfirums R419发酵液。

根据本发明优选的，所述种子液与发酵液的培养条件为35-37℃、180-200rpm培养。

上述坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419在制备角蛋白酶中的应用。

上述坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419在降解驴毛中的应用。

根据本发明优选的，坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419降解驴毛生产氨基酸、多肽和/或可溶性蛋白。

上述坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419在生产肥料中的应用。

根据本发明优选的，坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419在降解驴毛生产肥料中的应用。

有益效果

1、本发明涉及的菌株Bacillus firums R419能以未经处理的干燥驴毛为唯一碳源和氮源生长，高效降解驴毛并且产生复合氨基酸、多肽和可溶性蛋白，对于降解驴毛具有一定的特异性，对驴毛的降解率可达91.8％，降解效果显著。

2、本发明涉及的菌株Bacillus firums R419降解驴毛获得的提取液中，驴毛降解液中相对含量较高的氨基酸是谷氨酸与脯氨酸，含量均超过25mg/kg，其余的氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸的含量能达到6-8mg/kg；总氨基酸含量，以每kg驴毛计，约为1400mg/kg驴毛。

3、每kg驴毛的降解液中还含有289.5g的肽和含量高达319.5g的可溶性蛋白，多肽有很好的抗氧化能力，可溶性蛋白在视频、生物医药等方面都有一定价值。

4、驴毛降解液可直接作为微生物菌肥，可增加土壤肥力。

附图说明

图1为菌种Bacillus firums R419的系统发育树；

图2为实施例1中菌种Bacillus firums R419对驴毛的降解图片；

图3为对比例1中涉及的微生物对驴毛的降解图片；

图中：2号瓶是菌种Bacilllus nitratireducens(硝酸盐还原芽胞杆菌)的将降解效果；

3号瓶是菌种Bacilllus cereus(蜡样芽孢杆菌)的降解效果；

4号瓶是菌种Bacilllus tequilensis(特基拉芽孢杆菌)的降解效果。

图4为对比例2中Bacillus firums R419对人的头发的降解图片。

具体实施方式

下面结合实施例与附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。

菌种Bacilllus nitratireducens(硝酸盐还原芽胞杆菌)、Bacilllus cereus(蜡样芽孢杆菌)以及Bacilllus tequilensis(特基拉芽孢杆菌)由实验室筛选获得，也可由市场购买。

实验例

坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419的筛选获得方法，包括如下步骤：

(1)选择产角蛋白酶能力较强的菌株，来验证微生物对于驴毛的降解能力，首先配制基础的无机盐培养基，其中不含任何碳源和氮源,因此微生物如果生长，只能通过降解驴毛中的角蛋白获得碳源、氮源和能源；

基础无机盐培养基成分为：

MgSO

每个三角瓶中分装的无机盐培养基体积为50mL，灭菌备用。

(2)菌种的活化：首先将实验室筛选自济南大学甲子湖湖底污泥中的菌种涂布于LB(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，余量水，121℃高压蒸汽灭菌20min)固体平板上，挑取长出的菌落三区划线以获得菌种的纯培养。

(3)种子培养液的制备：将步骤(2)获得菌种的纯培养接种到LB的液体培养基中，置于37℃摇床中200rpm振荡培养12-14h。

(4)发酵以降解驴毛：将种子培养液接种到预先配置好的基础无机盐培养基中，每个三角瓶中加入2g的无菌干燥驴毛，置于37℃摇床中200rpm振荡培养48h后，离心收集固体物质并干燥，计算固体物质去除率。

(5)根据驴毛固体物质去除率筛选出降解驴毛效率最高的一株菌Bacillusfirums R419。

对实验组中的菌株进行菌种鉴定：通过PCR鉴定将其命名为Bacillus firumsR419。使用通用引物27F/1492R，通过菌液PCR扩增，扩增产物送往北京擎科生物科技有限公司青岛分公司测序得其16S rDNA序列，PCR程序为94℃5min,94℃30s、58℃30s、72℃2min30s 35个循环，72℃10min,4℃保存，测序结果得其16S rDNA序列长度为1449bp，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，使用NCBI 16S ribosomal RNA sequences数据库比对得到与其相似度最高得菌株为Bacillus firums NBRC 15306，通过软件MEGA 7.0运用Neighbor-Joining法构建了系统发育树如图1所示，根据NCBI比对结果和进化树所显示的进化地位将其命名为Bacillus firums R419。

该坚强芽孢杆菌Bacillus firums R419，该菌株于2020年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市，武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2020666。

实施例1

菌种Bacillus firums R419以无菌干燥驴毛为唯一碳源来降解驴毛，包括如下步骤：

(1)首先配制基础的无机盐培养基，其中不含任何碳源和氮源,因此微生物如果生长，只能通过降解驴毛中的角蛋白获得碳源、氮源和能源；

基础无机盐培养基成分为：MgSO

每个三角瓶中分装的无机盐培养基体积为50mL，灭菌备用。

(2)菌种的活化：首先将保藏的菌种Bacillus firums R419涂布于LB(酵母粉5g/L，蛋白胨105g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，余量水，121℃高压蒸汽灭菌20min)固体平板上，挑取长出的菌落三区划线以获得菌种的纯培养的活化菌种。

(3)种子培养液的制备：将步骤(2)获得的活化菌种接种到LB的液体培养基中，置于37℃摇床中200rpm振荡培养14h。

(4)发酵以降解驴毛：将步骤(3)获得的种子培养液以3％的接种量接种至预先配置好的基础无机盐培养基中，每个三角瓶中培养基体积为50ml,每个三角瓶加入2g的无菌干燥驴毛，置于37℃摇床中200rpm振荡培养48h，获得驴毛降解液。

对比例1

与实施例1的不同之处在于，分别用实验室筛选得到的菌种Bacilllusnitratireducens(硝酸盐还原芽胞杆菌)、Bacilllus cereus(蜡样芽孢杆菌)以及Bacilllus tequilensis(特基拉芽孢杆菌)代替实施例1中的Bacillus firums R419降解驴毛，其他均相同。

对比例2

与实施例1的不同之处在于，用2g无菌干燥的人的头发，并将头发的长度剪至于驴毛长度相当，代替实施例1中的2g无菌干燥的驴毛，其他均相同。

效果例

1、观察分析实施例1与对比例1-2对底物的降解情况，具体结果如下：

上述实施例1与对比例1-2获得的毛发降解液，通过离心收集固体物质并干燥，计算三角瓶中固体物质的降解率。

图2显示了实施例1中菌种Bacillus firums R419对驴毛的降解图片。

图3显示了对比例1中涉及的微生物对驴毛的降解图片；

图中：2号瓶是菌种Bacilllus nitratireducens的将降解效果；

3号瓶是菌种Bacilllus cereus的降解效果；

4号瓶是菌种Bacilllus tequilensis的降解效果。

图4显示了对比例2中菌种Bacillus firums R419对人的头发的降解图片。

表1显示了实施例1与对比例1-2对固体物的降解效果。

固体物降解率＝(添加毛发总量-剩余毛发干重)/添加毛发总量×100％

表1

由表1可以看出，实施例1中通过本发明涉及的菌种Bacillus firums R419的降解，三角瓶中除了瓶壁上粘附一些驴毛之外，液体中的驴毛几乎已经全部被降解，驴毛降解率(固体物降解率)达91.6；而对比例1分别利用菌种Bacilllus nitratireducens、Bacilllus cereus以及Bacilllus tequilensis对驴毛进行降解，降解率低，最大降解率仅达到28.5％；对比例2利用本发明涉及的菌种Bacillus firums R419对头发进行降解，则该菌种完全没有降解人的头发的能力；进一步验证本发明涉及的菌种Bacillus firums R419对驴毛具有特异性降解功能，并且降解效果显著。

2、将实施例1获得的驴毛降解液，通过离心方法去除未降解的固体，获得驴毛降解液然后；利用氨基酸分析仪检测驴毛降解液中的成分及含量。

经过上述检测，可以得出驴毛降解液中相对含量较高的氨基酸是谷氨酸与脯氨酸，含量均超过25mg/kg，其余的氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸的含量能达到6-8mg/kg。另外，还含有一定量的蛋白质和多肽；所述驴毛提取液中的总氨基酸含量，以每kg驴毛计，约为1400mg/kg，并且每kg驴毛的降解液中还含有289.5g的肽和319.5g的可溶性蛋白。

综上，本发明涉及的菌株Bacillus firums R419能以未经处理的干燥驴毛为唯一碳源和氮源生长，高效降解驴毛并且产生复合氨基酸、多肽和可溶性蛋白，对头发没有降解作用，能够特异性降解驴毛，对驴毛的降解率可达91.8％，降解效果显著。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 一株高效降解驴毛的坚强芽孢杆菌

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgggcggggt gctatactgc agtcgagcgg acaggatggg agcttgctcc ctgaagtcag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggcaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120

accggggcta ataccggata actcttttcc tcacatgagg aaaagctgaa agatggtttc 180

ggctatcact tacagatggg cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggccacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

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acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540

aagcgcgcgc aggcggttcc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg 600

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taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag caaacgcatt 840

aagcactccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900

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tgacatctcc tgacaaccct agagataggg cgttcccctt cgggggacag gatgacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200

gtgctacaat ggatggtaca aagggctgca agaccgcgag gttaagcgaa tcccataaaa 1260

ccattctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat gaagccggaa tcgctagtaa 1320

tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt ggggtaacct tttggagcca gccgcctaag 1440

gtacagatt 1449