一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21B及在提高植物低温胁迫中的应用

摘要

本发明属于植物基因工程领域，公开了一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21B及其在提高植物低温胁迫中的应用。该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。通过Gateway系统构建CaMV 35S启动子驱动的过量表达载体转化植物，能够显著提高转基因植物的抗冻能力，后续可通过基因工程的手段将AhRD21B基因转化花生或者其他作物，从而提高植物在低温下的抗逆性，可为植物的抗冷害胁迫基因工程育种提供理论基础和基因资源。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因

背景技术

花生是我国重要的油料作物之一，营养价值丰富。我国花生种植面积达7500多万亩，产量约1700万吨，占世界总产量约40%，占全国油料作物总产（不含大豆）近50%，其种植业产值达1200亿元，居全国农作物（水稻、小麦、玉米之后）的第四位，在我国国民经济发展中起着举足轻重的地位。

花生作为喜温作物，在整个生长发育过程中对温度的要求较高，花生在萌发期若遭遇12℃以下的低温，发芽率降低，种子腐烂甚至死亡；幼苗期遭遇14-16℃以下的低温时，植株生长缓慢甚至停止生长，叶片发生脱水，萎蔫，枯死等症状。但是目前由于市场需求、土地利用效率以及规避生长和收获阶段不良气候影响等因素的共同影响，近年来我国各春花生生产区的播种时间逐渐提前，花生种植区域的变化和春花生播种时间的提前导致我国各产区的花生在播种后遇到低温天气的概率日益增大。因此筛选获得花生响应低温胁迫相关基因，明确花生的耐冷机理，实现花生耐低温特性的遗传改良对我国花生生产至关重要。

木瓜类半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine proteases, PLCPs）是蛋白酶家族的重要成员之一，在植物响应非生物胁迫中起重要作用。Northern印迹分析显示，拟南芥的两个与干旱相关的基因

本发明针对以上背景技术，以花生在4℃低温处理花生后进行转录组测序分析发现半胱氨酸蛋白酶基因

发明内容

本发现提供了一种受低温胁迫表达量显著上调的花生半胱氨酸蛋白酶编码基因

本发明提供了一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因，在4℃低温处理花生后的转录组数据分析发现一个半胱氨酸蛋白酶基因的表达量显著上调，命名为

本发明还提供了包含所述花生半胱氨酸蛋白酶编码基因

最后，对转基因拟南芥株系进行低温胁迫处理的功能验证，结果表明花生

有益效果：

本发明是通过花生在4℃低温处理花生后进行转录组测序数据分析发现半胱氨酸蛋白酶基因

附图说明

图1为低温胁迫下花生

图2为pEarleyGate201-AhRD21B过量表达载体构建过程示意图。

图3是低温胁迫中

图4花生

具体实施方式

【实施例1】花生

根据花生闽花8号品种在4℃低温处理前后的转录组测序数据分析发现一个半胱氨酸蛋白酶基因

【实施例2】花生

为了探究

【实施例3】

根据

【实施例4】过表达

将实施例2中超标表达载体转化农杆菌GV3101，鉴定阳性克隆，置于YEB液体培养基中（含有终浓度50 mg/L的利福平以及终浓度50 mg/L卡那霉素），于28℃培养过夜，至OD600值为1.5～2.0，4℃，4,000 rpm离心10 min，菌体沉淀悬浮于5 %的蔗糖溶液（含有0.5% Silwet L-77（V/V），终浓度100 mM 乙酰丁香酮），至OD600值为0.6-0.8，待转化备用。参照浸花法转化一月龄的野生型Col 0型拟南芥，具体做法是：取生长状况良好的植株，去除大部分已经开放的花朵和结实的果荚，转化前一天浇足水，将将拟南芥花序浸泡于上述制备的农杆菌菌液中30 s，用吸水纸吸去多余的菌液，将转化的植株用保鲜膜包裹并黑色塑料袋罩住培养过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到22℃温室内继续生长。根据情况可以将拟南芥侵染一到两次，每次侵染的时间间隔在一周左右。将转

【实施例5】过表达

分别将野生型拟南芥Col0和三个T3代转

【实施例6】

分别将野生型拟南芥Col0和OE-13的T3代基因拟南芥纯合株系经消毒处理后种植在1/2MS培养基上，每个材料种植三个平板，于4℃下低温胁迫处理，以拟南芥

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修改，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种花生半胱氨酸蛋白酶编码基因AhRD21B及在提高植物低温胁迫中的应用

<130> 12

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcttcat ccttcaccat cctcctcttc ttcttcactc tcttcactct ttcatatgca 60

tcagacatgt ccataatctc gtacgacaaa acccactcca acacatggag aaccgatgag 120

gaagtcatgg ctatgtacga ggaatggctt gtgaagcatg gaaagaaacc aagtaacggt 180

ctcttgagtg gtgagagcaa gaatcggttc gagatcttta aggataacct ccggttcatt 240

gatgaacaga acagtttacc gaaccggact ttccagctcg gtctgaaccg gttcgccgat 300

ctgaccaacg aggagtacag ggctaagtat ttgggtacca ggatggatcc taaccgtcgg 360

atgatgaagg ctaagaccag gagcaaccga tacgcgccac gtgtcgggga caagttgccg 420

gagagtgttg attggaggaa ggaaggtgct gttgttggag tcaaagacca aggaggatgt 480

gggagttgtt gggcattctc aacaattgct gcagtggaag gaataaacaa gatcgtaaca 540

ggggatctga tttcactgtc agagcaagaa cttgtggact gtgatacatc atacaatgaa 600

gatgttcctg cctatgatga attggcattg aaaaaggccg ttgccaatca gcccgtggca 660

gttgccattg aaggaggtgg cagggaattc cagttatatg tatctggtgt attcacagga 720

aaatgtggaa cagcattgga ccatggagtt gctgctgtag ggtatgggtc agaaggtggg 780

catgagtatt ggattgtgag gaactcatgg ggagctagct ggggagagga cggttacatc 840

cgaatggagc ggaatcttgg taacagcaga gcaggcaagt gtggaatcgc catcgagcct 900

tcttacccta ttaagaatgg ccccaatcct cctaaccccg gaccatctcc gccgtcgcct 960

gtgaggccgc cgtcggtgtg tgataactac ttcagctgcc aatctggaaa cacatgctgc 1020

tgccttttcc agtttggaaa tgcatgcttt gaatggggat gctgccctct tgaaggtgct 1080

acctgctgtg atgatcacta cagctgctgc cctgccgact accctgtttg tgacacttac 1140

agaggtcttt gcctcaagaa caagaacaac ccatttggag tgaaggcgtt gaagagaact 1200

gcagctaaac ctcactgggc cttcaatggt gtgagcagtg ct 1242

<210> 2

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Ser Ser Phe Thr Ile Leu Leu Phe Phe Phe Thr Leu Phe Thr

1 5 10 15

Leu Ser Tyr Ala Ser Asp Met Ser Ile Ile Ser Tyr Asp Lys Thr His

20 25 30

Ser Asn Thr Trp Arg Thr Asp Glu Glu Val Met Ala Met Tyr Glu Glu

35 40 45

Trp Leu Val Lys His Gly Lys Lys Pro Ser Asn Gly Glu Val Met Ala

50 55 60

Met Tyr Glu Glu Trp Leu Val Lys His Gly Lys Lys Pro Ser Asn Gly

65 70 75 80

Glu Val Met Ala Met Tyr Glu Glu Trp Leu Val Lys His Gly Lys Lys

85 90 95

Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg Ala Lys Tyr Leu Gly

100 105 110

Thr Arg Met Asp Pro Asn Arg Arg Met Met Lys Ala Lys Thr Arg Ser

115 120 125

Asn Arg Tyr Ala Pro Arg Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu Ser Val Asp

130 135 140

Trp Arg Lys Glu Gly Ala Val Val Gly Val Lys Asp Gln Gly Gly Cys

145 150 155 160

Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Thr Ile Ala Ala Val Glu Gly Ile Asn

165 170 175

Lys Ile Val Thr Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Thr Ile Ala Ala Val

180 185 190

Glu Gly Ile Asn Lys Ile Val Thr Asp Val Pro Ala Tyr Asp Glu Leu

195 200 205

Ala Leu Lys Lys Ala Val Ala Asn Gln Pro Val Ala Val Ala Ile Glu

210 215 220

Gly Gly Gly Arg Glu Phe Gln Leu Tyr Val Ser Gly Val Phe Thr Gly

225 230 235 240

Lys Cys Gly Thr Ala Leu Asp His Gly Val Ala Ala Val Gly Tyr Gly

245 250 255

Ser Glu Gly Gly His Glu Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Gly Ala

260 265 270

Ser Trp Gly Glu Asp Gly Tyr Ile Arg Met Glu Arg Asn Leu Gly Asn

275 280 285

Ser Arg Ala Gly Lys Cys Gly Ile Ala Ile Glu Pro Arg Met Glu Arg

290 295 300

Asn Leu Gly Asn Ser Arg Ala Gly Lys Cys Gly Ile Ala Ile Glu Pro

305 310 315 320

Val Arg Pro Pro Ser Val Cys Asp Asn Tyr Phe Ser Cys Gln Ser Gly

325 330 335

Asn Thr Cys Cys Cys Leu Phe Gln Phe Gly Asn Ala Cys Phe Glu Trp

340 345 350

Gly Cys Cys Pro Leu Glu Gly Ala Thr Cys Cys Asp Asp His Tyr Ser

355 360 365

Cys Cys Pro Ala Asp Tyr Pro Val Cys Asp Thr Tyr Arg Gly Leu Cys

370 375 380

Leu Lys Asn Lys Asn Asn Pro Phe Gly Val Lys Ala Leu Lys Arg Thr

385 390 395 400

Ala Ala Lys Pro His Trp Ala Phe Asn Gly Val Ser Ser Ala

405 410

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcttcat ccttcaccat cc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcactgctc acaccattga ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaggctaag accaggagca ac 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catcttcatt gtatgatgta tc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaggagaagc agaagcaagt tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agacagcata tcggcactca tc 22

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggcttca tccttcacca tcc 53

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agcactgctc acaccattga ag 52

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgatgtgata tctccactga cgtaag 26

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cacatcctcc ttggtctttg actc 24