一种玉米抗虫和/或耐除草剂基因定向表达的基因开关系统及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种玉米抗虫和/或耐除草剂基因定向表达的基因开关系统及其构建方法和应用。该基因开关系统包括含有抗虫和/或耐除草剂基因的锁定元件，以及如SEQ ID NO.1所示开启锁定元件，并使其在特定组织中表达的核苷酸序列；SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为位点特异性重组酶基因Cre。本发明利用玉米中内源绿色组织特异型启动子，并结合位点特异性重组系统及相关调控元件，构建玉米基因定向表达“基因开关”技术平台，实现外源基因的精准表达，为培育优质、安全、高效的转基因作物新品系提供强力技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种玉米抗虫和/或耐除草剂基因定向表达的基因开关系统及其构建方法和应用。

背景技术

玉米是集粮、经、饲、能四元一体的第一大粮食作物，在我国国民经济和农业生产上具有举足轻重的作用。保障粮食产量和绿色安全是我国的一项长期战略任务，而病虫害的发生直接威胁到玉米粮食产量和安全(卜华虎等，2019)。随着生物科学的发展，基因工程技术的发展为解决这一问题提供了参考，抗病害转基因玉米是有效抵制病虫害威胁的重要举措(王雪丽等，2020)。转基因粮食作物的使用安全性问题一直是公众争议的热点，也是转基因粮食作物迄今为止在全国乃至全球范围内尚未能得以充分认可或广泛商业化种植的重要原因。

从上个世纪90年代开始，基因工程技术取得了迅猛的发展，在改善作物抗逆性、提升营养品质、提高农作物产量等方面都发挥了重要作用，创造了巨大的经济效益和社会效益(James,2015)。传统的转基因技术包括利用组成型启动子驱动单个基因的表达获得相应的性状，或利用组成型启动子驱动两个甚至多个目标基因聚合表达获取复合性状。新一代基因工程技术通过发展组织特异性启动子及各种调控元件应用于基因的定向表达，使其趋向于智能化、有效化、精细化、安全化和环境友好化表达，可广泛应用于农业新品种改造。病虫害是影响作物产量的主要因素之一，多年来，育种家们一直致力于如何有效地降低病虫害对粮食产量的影响，随着Bt、Vip3ArLr1、RePAT等优异抗虫、耐除草剂基因的出现，将这些基因转育到作物中，取得了明显效果。然而，这又带来了一个新的问题，“转基因作物安不安全？”。

众所周知，由于传统转基因产品是胚乳表达型的，即转基因作物的食用部分中有外源蛋白产物的积累，以至于至今都无法让公众充分认可其食用安全性，这种状况不仅出现在中国，在世界其它一些地区和国家，如欧洲和日本同样如此。转基因粮食作物的生物安全性一直是公众关注的焦点，在一定程度上阻碍了转基因作物的推广和商业化种植。面对转基因作物困境，随着植物转基因技术不断革新，目前，我国科学家研制一种可以完全关闭外源目的基因在胚乳等非绿色组织中表达的“基因开关”技术，已实现在水稻上实现了精准调控单个Bt基因的定向表达，使抗虫基因只在害虫危害的绿色组织部位表达，在食用部分胚乳中完全不表达，有效的解决了常规育种不能解决的抗虫问题。该技术的成功应用，让广大公众能放心地食用转基因作物，而无须担心其安全性问题。该技术由能锁定外源目的基因表达的“锁定”元件和能在目标部位开启被锁定的外源目的基因表达的“钥匙”元件两个组件构成。在两者独立存在条件下，前者携带的外源基因是被永久锁定的，而后者携带的钥匙元件仅在害虫危害的叶片和茎秆等绿色组织表达。将这两个组件分别转化到受体中，然后通过杂交将其综合到一起，即调控外源目的基因只在绿色组织中表达，以致出现期望的叶片抗性性状，而在胚乳等非绿色组织中则始终关闭该外源目的基因的表达，从而育成在食用部分不含任何转基因蛋白成分的转基因抗虫杂交新品种或新品系。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种玉米抗虫和/或耐除草剂基因定向表达的基因开关系统及其构建方法和应用，本发明利用玉米中内源绿色组织特异型启动子，并结合位点特异性重组系统及相关调控元件，构建玉米基因定向表达“基因开关”技术平台，实现外源基因的精准表达，为培育优质、安全、高效的转基因作物新品系提供强力技术支撑。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种玉米抗虫和/或耐除草剂基因定向表达的基因开关系统，包括含有抗虫和/或耐除草剂基因的锁定元件，以及如SEQ ID NO.1所示开启锁定元件，并使其在特定组织中表达的核苷酸序列；SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为位点特异性重组酶基因Cre。

进一步地，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

进一地，申请人还设计了用于扩增上述位点特异性重组酶基因Cre的引物对，其具体序列如下：

上游(F)：ACGACGGTGAAACGAAGGAA(SEQ ID No.3)

下游(R)：GTTCGAACGCTAGAGCCTGT(SEQ ID No.4)。

一种开启锁定元件的钥匙元件或载体，包括玉米绿色组织特异性启动子、核定位基因、SEQ ID NO.1所示核苷酸序列以及终止子。

进一步地，玉米绿色组织特异性启动子为Zm1rbcS启动子；核定位基因为Krp2；终止子为NosT。

进一步地，该钥匙元件或载体为pKEY(pZm1rbcS-Krp2-Cre-NosT)。

进一步地，锁定元件还包括组成型启动子；组成型启动子为ZmUbi。

进一步地，抗虫基因为Cry1Ab/1Ac和Vip3ArLr1基因；其中Cry1Ab/1Ac基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于扩增该基因的引物对具体序列如下：

上游(F)：TTTGTCGATGCTCACCCTGTTG(SEQ ID No.7)

下游(R)：ACCAAGTACTTCAACTTCTGGGT(SEQ ID No.8)；

Vip3ArLr1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；用于扩增该基因的引物对具体序列如下：

上游(F)：TTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCG(SEQ ID No.11)

下游(R)：TTGCGTTGGGAGGACTTGCTTAA(SEQ ID No.12)。

进一步地，锁定元件元件中含有Cry1Ab/1Ac和Vip3ArLr1基因中的至少一种。

进一步地，耐除草剂基因为RePAT基因；该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示；用于扩增该基因的引物对的具体序列如下：

上游(F)：ATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGA(SEQ ID No.15)

下游(R)：GATGCCGTTGAAGTAGTCGATGAA(SEQ ID No.16)。

进一步地，构建得到的含有抗虫基因、除草基因的锁定元件为：pLockBt(pZmUbi-loxP-NosT-B(Cry1Ab/1Ac)t-NosT)、pLockVip(pZmUbi-loxP-NosT-Vip3ArLr1-NosT)、pLockReP(pZmUbi-loxP-NosT-RePAT-NosT)。

一种转基因玉米、转基因玉米细胞或转基因玉米种子，包括上述基因开关系统，或上述锁定元件和钥匙元件或载体。

一种构建抗虫和耐除草剂基因定向表达的转基因玉米的方法，包括以下步骤：

(1)培育得到含有含有抗虫和/或耐除草剂基因锁定元件的转基因阳性植株；

(2)培育得到含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或上述钥匙元件或载体的转基因阳性植株；

(3)将步骤(1)所得转基因阳性植株分别与步骤(2)所述的转基因阳性植株进行组配杂交即可。

上述基因开关系统在玉米种质资源改良中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明利用玉米中内源绿色组织特异型启动子，并结合位点特异性重组系统及相关调控元件，构建玉米基因定向表达“基因开关”技术平台，实现外源基因的精准表达，创制出一批只在绿色组织表达且食用部分中不表达外源蛋白的抗虫、耐除草剂等转基因玉米新种质和杂交组合，具有广泛的应用前景，可有效解除公众对传统的胚乳表达型转基因玉米食用安全性的担忧，推进我国转基因粮食作物的产业化进程，为培育优质、安全、高效的转基因作物新品系提供强力技术支撑。玉米抗虫、耐除草剂基因定向表达技术体系的构建不仅在玉米生产上的具有极大的潜在应用价值，而且在粮食生产与安全上具有重要意义。

附图说明

图1为玉米基因定向表达载体的构建；其中，

A为利用玉米内源绿色组织特异启动子Zm1rbcS，构建了1个玉米绿色组织特异启动子Zm1rbcS和调控元件Cre基因的玉米基因定向表达“钥匙”载体pKEY；

B为利用玉米内源组成型启动子ZmUbi，构建了1个玉米内源性组成型启动子ZmUbi的抗虫Cry1Ab/1Ac基因“锁定”表达载体pLockBt；

C为利用玉米内源组成型启动子ZmUbi，构建了1个玉米内源性组成型启动子ZmUbi的抗虫Vip3ArLr1基因“锁定”表达载体pLockVip；

D为利用玉米内源组成型启动子ZmUbi，构建了1个玉米内源性组成型启动子ZmUbi的耐除草剂RePAT基因“锁定”表达载体pLockReP；

图2为玉米“基因开关”表达载体遗传转化；

图3为转基因T

B为T0代转基因植株成株；C为T0转基因植株试纸条检测；

D为玉米“钥匙”载体pKEY的T0代转基因植PCR鉴定；其中，M：DNA MarkerDL2000；-：玉米受体野生型材料为模板；H

E为玉米“锁定”载体pLockBt的T0代转基因植PCR鉴定；其中，M：DNA MarkerDL2000；-：玉米受体野生型材料为模板；H

F为玉米“锁定”载体pLockReP的T0代转基因植PCR鉴定；其中，M：DNA MarkerDL2000；-：玉米受体野生型材料为模板；H

G为玉米“锁定”载体pLockVip的T0代转基因植PCR鉴定；并以水、未转基因野生型材料为对照；其中，M：DNA Marker DL2000；-：玉米受体野生型材料为模板；H

图4为转基因玉米阳性植株检测；A为转基因植株移栽大田；B为转基因植株成株；

C为玉米“钥匙”Cre基因的转基因植PCR鉴定；其中，M2000：DL2000 DNA Maker；H

D为玉米“锁定”抗虫基因Cry1Ab/1Ac转基因株系PCR鉴定；其中，M2000：DL2000DNA Maker；H

E为玉米“锁定”耐除草剂基因RePAT转基因株系PCR鉴定；其中，M2000：DL2000 DNAMaker；H

F为玉米“锁定”抗虫基因Vip3ArLr1转基因株系PCR鉴定；并以水、未转基因野生型材料为对照；其中，M2000：DL2000 DNA Maker；H

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1玉米定向表达的“钥匙”和“锁定”表达载体构建

以植物表达载体pCOMBIA 3300为基础载体(购置于Sigma生物技术公司)，克隆玉米绿色组织启动子Zm1rbcS和位点特异性重组酶基因Cre，利用玉米绿色组织特异启动子Zm1rbcS、核定位基因Krp2、位点特异性重组酶基因Cre和终止子NosT，构建玉米“钥匙”载体pKEY(pZm1rbcS-Krp2-Cre-NosT)(图1A)，卡那霉素为选择标记基因，HindⅢ和SmaI为酶切位点，采用同源重组法构建“钥匙”pKEY过表达载体。同时，以植物表达载体pCOMBIA3300为基础载体，克隆玉米内源性组成型ZmUbi和抗虫基因Cry1Ab/1Ac、抗虫基因Vip3ArLr1、耐除草剂基因RePAT，分别构建玉米“锁定”基因载体pLockBt(pZmUbi-loxP-NosT-Bt-NosT)、pLockVip(pZmUbi-loxP-NosT-Vip3ArLr1-NosT)、pLockReP(pZmUbi-loxP-NosT-RePAT-NosT)。具体操作是：卡那霉素为选择标记基因，HindⅢ和SmaI为酶切位点，采用同源重组法构建pLockBt过表达载体(图1B)；卡那霉素为选择标记基因，HindⅢ和PstI为酶切位点，采用同源重组法构建pLockVip过表达载体(图1C)；卡那霉素为选择标记基因，HindⅢ和PstI为酶切位点，采用同源重组法构建pLockReP过表达载体(图1D)。

实施例2玉米受体遗传转化

采用农杆菌介导法侵染玉米幼胚获得转化体。具体过程是：将构建好的玉米基因定向表达“钥匙”载体pKEY和玉米基因表达“锁定”载体pLockBt、pLockVip、pLockReP转到农杆菌EHA105，经转入、冰浴(10min)、液氮速冻(5min)、37℃水浴(5min)、冰浴(5min)、活化(加入YEP液体28℃振荡培养2-3h)、涂板培养(28℃、48-72h)、挑单克隆菌检等步骤得到的阳性克隆。将确定的阳性单克隆接种于含卡那霉素和利福霉素的液体YEP培养基中，于28℃摇床中200r/min过夜振荡培养12-16h。用分光光度计在波长600nm下测量菌液的OD值，OD值达到0.2-0.4时，在超净台中分装入无菌离心管，3000r/min下离心10min，弃上清液，加入等量的含AS的侵染液重悬备用。挑取授粉后11-13天玉米受体材料幼胚，大小1.2-1.5mm，加入孵育好的农杆菌侵染液1-1.5mL，轻轻上下颠倒混匀20次，然后锡箔纸包好离心管并静置10min，中间再摇晃一次；静置后，直接将侵染液带着幼胚一起倒入共培养的培养基中，迅速用移液器将侵染液吸掉，然后将幼胚的盾牌朝上并在培养基上均匀摆好，在23℃恒温培养箱中黑暗培养3天；将共培养后玉米幼胚转移到恢复培养基上，在28℃恒温培养箱中黑暗培养一周；然后依次转移到筛选培养基(梯度：草铵膦浓度1.5mg/L、草铵膦浓度3.0mg/L、草铵膦浓度5.0mg/L)上28℃黑暗分别培养20天；将愈伤组织转到再生或者分化培养基继续培养直至出苗，最后将长出的苗子转移到生根培养基上生根和转移到盆栽，具体遗传转化过程如图2所示。

实施例3转基因阳性植株获得

取遗传转化获得玉米植株叶片，对T

表1 PCR检测获得的T

将获得的T

Cr e基因：

上游(F)：ACGACGGTGAAACGAAGGAA(SEQ ID No.3)

下游(R)：GTTCGAACGCTAGAGCCTGT(SEQ ID No.4)

抗虫基因Cry1Ab/1Ac：

上游(F)：TTTGTCGATGCTCACCCTGTTG(SEQ ID No.7)

下游(R)：ACCAAGTACTTCAACTTCTGGGT(SEQ ID No.8)

耐除草剂基因RePAT：

上游(F)：TTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCG(SEQ ID No.11)

下游(R)：TTGCGTTGGGAGGACTTGCTTAA(SEQ ID No.12)

抗虫基因Vip3ArLr1：

上游(F)：ATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGA(SEQ ID No.15)

下游(R)：GATGCCGTTGAAGTAGTCGATGAA(SEQ ID No.16)

用设计的引物进行PCR扩增，PCR反应体系为：Taq Mix 7.5μL，上下游引物分别为0.75μL，cDNA模板1μL，用双蒸水定容至15μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸5s；共35个循环；68℃再延伸10min。

通过对各材料进行检测鉴定，获得纯合转基因阳性植株(图4)，最终获得了玉米“钥匙”Cre基因的转基因株系、玉米“锁定”抗虫基因Cry1Ab/1Ac转基因株系、玉米“锁定”抗虫基因Vip3ArLr1转基因株系和玉米“锁定”耐除草剂基因RePAT转基因株系。

上述结果说明，构建了玉米基因定向表达“钥匙”载体和“锁定”载体，并成功导入到玉米受体材料中，获得转基因阳性植株，该玉米基因定向表达体系的构建在玉米转基因作物新品种培育中具有较好的应用潜力。本发明获得的玉米“钥匙”转基因株系和玉米“锁定”转基因株系为后续杂交组配和外源基因的定向表达奠定了良好的材料基础，以此玉米基因定向表达技术平台，实现外源基因表达部位的精确控制，可解除公众对转基因粮食作物安全性的担忧，此举不仅可加快我国转基因作物产业化进程，而且对转基因技术的推动和革新，均具有深远的理论和实际意义。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种玉米抗虫和/或耐除草剂基因定向表达的基因开关系统及其构建方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1116

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

atggcggcgg ttaggagaag agaacgagat gtggttgaag agaatggagt tacgacgacg 60

acggtgaaac gaaggaagcc cgggatgtcc aatttactga ccgtacacca aaatttgcct 120

gcattaccgg tcgatgcaac gagtgatgag gttcgcaaga acctgatgga catgttcagg 180

gatcgccagg cgttttctga gcatacctgg aaaatgcttc tgtccgtttg ccggtcgtgg 240

gcggcatggt gcaagttgaa taaccggaaa tggtttcccg cagaacctga agatgttcgc 300

gattatcttc tatatcttca ggcgcgcggt ctggcagtaa aaactatcca gcaacatttg 360

ggccagctaa acatgcttca tcgtcggtcc gggctgccac gaccaagtga cagcaatgct 420

gtttcactgg ttatgcggcg gatccgaaaa gaaaacgttg atgccggtga acgtgcaaaa 480

caggctctag cgttcgaacg cactgatttc gaccaggttc gttcactcat ggaaaatagc 540

gatcgctgcc aggatatacg taatctggca tttctgggga ttgcttataa caccctgtta 600

cgtatagccg aaattgccag gatcagggtt aaagatatct cacgtactga cggtgggaga 660

atgttaatcc atattggcag aacgaaaacg ctggttagca ccacaggtgt agagaaggca 720

cttagcctgg gggtaactaa actggtcgag cgatggattt ccgtctctgg tgtagctgat 780

gatccgaata actacctgtt ttgccgggtc agaaaaaatg gtgttgccgc gccatctgcc 840

accagccagc tatcaactcg cgccctggaa gggatttttg aagcaactca tcgattgatt 900

tacggcgcta aggatgactc tggtcagaga tacctggcct ggtctggaca cagtgcccgt 960

gtcggagccg cgcgagatat ggcccgcgct ggagtttcaa taccggagat catgcaagct 1020

ggtggctgga ccaatgtaaa tattgtcatg aactatatcc gtaacctgga tagtgaaaca 1080

ggggcaatgg tgcgcctgct ggaagatggc gattag 1116

<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

Met Ala Ala Val Arg Arg Arg Glu Arg Asp Val Val Glu Glu Asn Gly

1 5 10 15

Val Thr Thr Thr Thr Val Lys Arg Arg Lys Pro Gly Met Ser Asn Leu

20 25 30

Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val Asp Ala Thr Ser

35 40 45

Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg Asp Arg Gln Ala

50 55 60

Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val Cys Arg Ser Trp

65 70 75 80

Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe Pro Ala Glu Pro

85 90 95

Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala Arg Gly Leu Ala

100 105 110

Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn Met Leu His Arg

115 120 125

Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala Val Ser Leu Val

130 135 140

Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly Glu Arg Ala Lys

145 150 155 160

Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln Val Arg Ser Leu

165 170 175

Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn Leu Ala Phe Leu

180 185 190

Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu Ile Ala Arg Ile

195 200 205

Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg Met Leu Ile His

210 215 220

Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Thr Gly Val Glu Lys Ala

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp Ile Ser Val Ser

245 250 255

Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys Arg Val Arg Lys

260 265 270

Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu Ser Thr Arg Ala

275 280 285

Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile Tyr Gly Ala Lys

290 295 300

Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly His Ser Ala Arg

305 310 315 320

Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val Ser Ile Pro Glu

325 330 335

Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile Val Met Asn Tyr

340 345 350

Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val Arg Leu Leu Glu

355 360 365

Asp Gly Asp

370

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgacggtga aacgaaggaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttcgaacgc tagagcctgt 20

<210> 5

<211> 1833

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 5

atggacaaca actgcaggcc atacaactgc ttgagtaacc cagaagttga agtacttggt 60

ggagaacgca ttgaaaccgg ttacactccc atcgacatct ccttgtcctt gacacagttt 120

ctgctcagcg agttcgtgcc aggtgctggg ttcgttctcg gactagttga catcatctgg 180

ggtatctttg gtccatctca atgggatgca ttcctggtgc aaattgagca gttgatcaac 240

cagaggatcg aagagttcgc caggaaccag gccatctcta ggttggaagg attgagcaat 300

ctctaccaaa tctatgcaga gagcttcaga gagtgggaag ccgatcctac taacccagct 360

ctccgcgagg aaatgcgtat tcaattcaac gacatgaaca gcgccttgac cacagctatc 420

ccattgttcg cagtccagaa ctaccaagtt cctctcttgt ccgtgtacgt tcaagcagct 480

aatcttcacc tcagcgtgct tcgagacgtt agcgtgtttg ggcaaaggtg gggattcgat 540

gctgcaacca tcaatagccg ttacaacgac cttactaggc tgattggaaa ctacaccgac 600

cacgctgttc gttggtacaa cactggcttg gagcgtgtct ggggtcctga ttctagagat 660

tggattagat acaaccagtt caggagagaa ttgaccctca cagttttgga cattgtgtct 720

ctcttcccga actatgactc cagaacctac cctatccgta cagtgtccca acttaccaga 780

gaaatctata ctaacccagt tcttgagaac ttcgacggta gcttccgtgg ttctgcccaa 840

ggtatcgaag gctccatcag gagcccacac ttgatggaca tcttgaacag cataactatc 900

tacaccgatg ctcacagagg agagtattac tggtctggac accagatcat ggcctctcca 960

gttggattca gcgggcccga attcaccttt cctctctatg gaactatggg aaacgccgct 1020

ccacaacaac gtatcgttgc tcaactaggt cagggtgtct acagaacctt gtcttccacc 1080

ttgtacagaa gacccttcaa tatcggtatc aacaaccagc aactttccgt tcttgacgga 1140

acagagttcg cctatggaac ctcttctaac ttgccatccg ctgtttacag aaagagcgga 1200

accgttgatt ccttggacga aatcccacca cagaacaaca atgtgccacc caggcaagga 1260

ttctcccaca ggttgagcca cgtgtccatg ttccgttccg gattcagcaa cagttccgtg 1320

agcatcatca gggctcctat gttctcttgg atacaccgta gtgctgagtt caacaacatc 1380

atcgcatccg atagtattac tcaaatccct gcagtgaagg gaaactttct cttcaacggt 1440

tctgtcattt caggaccagg attcactggt ggagacctcg ttagactcaa cagcagtgga 1500

aacaacattc agaatagagg gtatattgaa gttccaattc acttcccatc cacatctacc 1560

agatatagag ttcgtgtgag gtatgcttct gtgaccccta ttcacctcaa cgttaattgg 1620

ggtaattcat ccatcttctc caatacagtt ccagctacag ctacctcctt ggataatctc 1680

caatccagcg atttcggtta ctttgaaagt gccaatgctt ttacatcttc actcggtaac 1740

atcgtgggtg ttagaaactt tagtgggact gctggagtga ttatcgacag attcgagttc 1800

attccagtta ctgcaacact cgaggctgaa taa 1833

<210> 6

<211> 610

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 6

Met Asp Asn Asn Cys Arg Pro Tyr Asn Cys Leu Ser Asn Pro Glu Val

1 5 10 15

Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp

20 25 30

Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly

35 40 45

Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly

50 55 60

Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn

65 70 75 80

Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu

85 90 95

Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp

100 105 110

Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gln

115 120 125

Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile Pro Leu Phe Ala

130 135 140

Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala

145 150 155 160

Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gln Arg

165 170 175

Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp Leu Thr

180 185 190

Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val Arg Trp Tyr Asn Thr

195 200 205

Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp Trp Ile Arg Tyr

210 215 220

Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ser

225 230 235 240

Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro Ile Arg Thr Val Ser

245 250 255

Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp

260 265 270

Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg Ser

275 280 285

Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala

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His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro

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Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met

325 330 335

Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly

340 345 350

Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile

355 360 365

Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala

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Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly

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Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val Pro

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Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met Phe Arg

420 425 430

Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala Pro Met Phe

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Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile Ala Ser Asp

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Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Phe Leu Phe Asn Gly

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Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val Arg Leu

485 490 495

Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly Tyr Ile Glu Val Pro

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Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg Val Arg Val Arg Tyr

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Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn Trp Gly Asn Ser Ser

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Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu

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<212> DNA

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Val Tyr Val His Val Asp His His Arg Arg Gly Ile Ala Thr Ala Leu

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Met Thr Glu Leu Ile Glu Arg Ala Arg Ala Gly Gly Ile His Val Ile

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Val Ala Ser Val Glu Ser Thr Asn Ala Thr Ser Val Ala Leu His Glu

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<212> DNA

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gatgccgttg aagtagtcga tgaa 24