NSC 23766在防护肝缺血再灌注损伤中的用途

摘要

本发明涉及生物医药领域，具体涉及NSC 23766在制备防治缺血再灌注损伤药物中的用途。本发明的有益效果在于首次发现并证实了NSC 23766具有防护缺血再灌注损伤的新用途，能够显著减轻缺血再灌注小鼠术后肝损伤，且在防治缺血再灌注导致的肝损伤方面具有突出的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及NSC 23766在缺血再灌注损伤防治中的用途。

背景技术

缺血再灌注损伤(IRI)是包含局部缺血损伤和炎症介导的再灌注损伤两个相互关联的动态过程。缺血性损伤因糖原消耗、氧供缺乏、ATP耗竭，局部细胞代谢紊乱，造成原发实质细胞死亡。随之而来的再灌注损伤不仅存在代谢紊乱，还存在涉及直接和间接细胞毒机制的严重炎症性免疫应答反应。IRI期间，肝细胞释放损伤相关分子模式使Kuppffer细胞(KC)大量激活，在败血症或内毒素血症的条件下，病原体相关分子模式也促使KC活化。活化的KC显著增加活性氧自由基(ROS)产生和促炎细胞因子释放，其中，IL-1可刺激中性粒细胞释放ROS，进一步促进KC合成TNF-α。TNF-α可促使IL-6、CXC模体趋化因子等分子的释放。这些细胞因子进一步扩大KC激活，促进中性粒细胞募集并向肝窦粘附。这一恶性循环最终引起过度炎症反应，是再灌注损伤的主要机制。ROS是氧衍生分子的统称，包括氧自由基、过氧化氢、过氧亚硝酸盐和一氧化氮(NO)。ROS产生是肝脏IRI的最主要危险因素之一，可直接氧化肝实质细胞核内DNA的双链结构，导致DNA损伤和突变，造成肝细胞坏死、肝脏结构和功能损伤。

肝脏缺血再灌注损伤不仅会引起肝功能障碍和肝衰竭，还可引起肾脏、肺脏、肠道、胰腺、肾上腺、心肌等多种远端器官损伤，严重情况下还会造成多器官功能衰竭和系统性炎症反应综合征，是肝切除术、肝移植术等术后并发症发病和死亡的主要危险因素，严重影响患者的生存率和生活质量。此外，肝移植术至今仍是终末期肝病和原发性肝癌患者唯一有效的治疗手段，而IRI造成的器官损伤、移植物早期功能障碍和原发性无功能等，是减少可用于肝移植术的供体肝脏的主要因素。因此，寻求有效减轻肝脏缺血再灌注损伤的手段至关重要。

NSC 23766(CAS号1177865-17-6)是一种Rac1激活的抑制剂，发明人惊奇的发现，NSC 23766对防治肝缺血再灌注损伤具有突出的效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种NSC 23766的新用途。

在本发明的第一方面，提供了NSC 23766在防治缺血再灌注损伤中的用途。

具体的，所述用途是指将NSC 23766或其药学上可接受的盐制备成防治缺血再灌注损伤的药物从而给患者施用。

在本发明的第二方面，提供了NSC 23766在防治缺血再灌注导致的肝损伤中的用途。

具体的，所述用途是指将NSC 23766或其药学上可接受的盐制备成防治缺血再灌注导致的肝损伤的药物从而给患者施用。

在本发明的第三方面，提供了NSC 23766在用作肝脏移植辅助药物中的用途。

具体的，所述用途是指将NSC 23766或其药学上可接受的盐制备成药物从而给需要肝脏移植的患者在术前或术后施用，以提高移植手术的成功率。。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，其含有治疗量的NSC 23766及药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果在于首次发现并证实了NSC 23766具有防护缺血再灌注损伤的作用，且在防治缺血再灌注导致的肝损伤方面具有突出的效果。

附图说明

图1为小鼠肝缺血再灌注术后肝组织H&E染色及统计图；

图2为小鼠肝缺血再灌注术后肝组织TUNEL染色及统计图；

图3为小鼠肝缺血再灌注术后血清、肝组织内ALT、AST含量检测及统计图；

图4为小鼠肝缺血再灌注术后肝组织炎性细胞激活标志物F4/80及Ly6G免疫组化染色及统计图；

图5为小鼠肝缺血再灌注术后肝组织ROS含量荧光染色及统计图；

图6为小鼠肝细胞缺血再灌注后凋亡流式细胞仪分析统计图；

图7为小鼠肝细胞缺血再灌注后乳酸脱氢酶(LDH)检测及统计图；

图8为小鼠肝细胞缺血再灌注后线粒体膜电位(MMP)变化及统计图；

图9为小鼠肝细胞缺血再灌注后凋亡相关蛋白Western Blotting及灰度值分析统计图；

图10为小鼠肝细胞缺血再灌注后DNA损伤相关蛋白Western Blotting及灰度值分析统计图。

具体实施方式

以下结合实例说明本发明，但不限制本发明。在本领域内，技术人员对本发明所做的简单替换或改进均属于本发明所保护的技术方案内。

具体实施方式中雄性野生型C57BL/6小鼠(6-8周)购于中国科学院(上海)。所有小鼠均饲养于中国人民解放军第二军医大学(上海)动物实验中心无特殊病原体(SPF)实验室。

实验例1验证NSC 23766对肝缺血再灌注损伤的防护作用

6～8周C57BL/6雄性小鼠24只，随机分为4组：假手术对照组(腹腔注射PBS，Sham假手术)、假手术给药组(腹腔注射NSC23766 2.5mg/kg，Sham假手术)、肝缺血再灌注(IRI)对照组(腹腔注射PBS，IRI手术)和IRI给药组(腹腔注射NSC23766 2.5mg/kg，IRI手术)。腹腔注射为隔日单次注射、连续2周，随后进行Sham假手术(仅开腹1小时后关腹)或肝脏IRI手术。术后6小时、24小时取材：先眼球取血分离血清，随后颈椎脱臼法处死小鼠取缺血处理的肝左叶和肝中叶。分别检测：

(1)肝组织损伤程度(H&E染色)；

(2)肝细胞凋亡情况(TUNEL染色)；

(3)血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)浓度、肝组织ALT和AST含量；

(4)肝组织内炎性细胞激活程度(F4/80和Ly6G免疫组化染色)；

(5)肝组织活性氧自由基(ROS)含量。

术后各组肝损伤严重程度实验结果如图1所示：

图1中C57BL/6小鼠随机分为4组：Sham+PBS为假手术对照组，Sham+NSC为假手术给药组，IRI+PBS为肝缺血再灌注手术对照组，以及IRI+NSC手术给药组。术后6h、24h取材。通过H&E染色观察各组小鼠肝损伤程度。ns代表两组之间比较差异无统计学意义，*、**和***分别代表相应两组相比，P＜0.05、0.01和0.001，误差值表示为mean±SEM，N＝3。图像分析使用Image J软件。其中图1A为H&E染色图，图1B为低度、中度、高度空泡化肝细胞数量柱形统计图。从图1可知，腹腔注射NSC23766后进行肝缺血再灌注，低度空泡化肝细胞数量多于注射PBS的组别，中、高度空泡化肝细胞数量低于注射PBS的组别，能够显著降低肝细胞损伤。

术后各组肝组织细胞凋亡实验结果如图2：

图2与图1同批模型，同批取材后通过TUNEL染色观察各组小鼠肝细胞凋亡情况。ns代表两组之间比较差异无统计学意义，*和**分别代表相应两组相比，P＜0.05和0.01，误差值表示为mean±SEM，N＝3。图像分析使用Image J软件。具体的，图2A为TUNEL染色图，图2B为凋亡细胞含量柱形统计图。从图2可知，腹腔注射NSC23766后进行肝缺血再灌注，相比注射PBS，能够极大的降低肝脏细胞的凋亡率。

术后各组血清ALT/AST浓度、肝脏ALT/AST含量实验结果如图3：

图3与图1同批模型，同批取材后通过全自动生化仪检测各组小鼠血清和肝组织中ALT、AST含量。ns代表两组之间比较差异无统计学意义，*、**和***分别代表相应两组相比，P＜0.05、0.01和0.001，误差值表示为mean±SEM，N＝3。其中图3A为小鼠血清中ALT、AST含量柱状统计图，3B为小鼠肝组织中ALT、AST含量柱状统计图。由图3可知，腹腔注射NSC23766后进行肝缺血再灌注，相比注射PBS，能够显著的降低血清ALT/AST浓度以及肝脏ALT/AST含量。

术后各组肝组织炎性细胞激活标志物F4/80及Ly6G免疫组化染色如图4：

图4与图1同批模型，同批取材后通过免疫组织化学染色观察各组小鼠炎症细胞激活情况。F4/80为小鼠巨噬细胞标志物，其表达增多代表巨噬细胞激活增加。Ly6G为小鼠中性粒细胞标志物，其表达增多代表中性粒细胞激活增加。ns代表两组之间比较差异无统计学意义，*和***分别代表相应两组相比，P＜0.05和0.001，#、##和###分别代表相应两组相比，P＜0.05、0.01和0.001，误差值表示为mean±SEM，N＝3。图像分析使用Image J软件。由图4可知，腹腔注射NSC23766后进行肝缺血再灌注，相比注射PBS，能够显著的降低小鼠血液中F4/80、Ly6G含量。

术后各组肝组织内ROS含量见图5：

图5与图1同批模型，同批取材后ROS荧光染色。ns代表两组之间比较差异无统计学意义，*和***分别代表相应两组相比，P＜0.05和0.001，#、##和###分别代表相应两组相比，P＜0.05、0.01和0.001，误差值表示为mean±SEM，N＝3。图像分析使用Image J软件。其中，图5A为ROS荧光染色图，图5B为5A的柱形统计图。由图5可知，腹腔注射NSC23766后进行肝缺血再灌注，相比注射PBS，能够降低肝组织内ROS含量。

实验例2通过小鼠肝细胞系AML-12模拟缺血再灌注细胞模型(IRI)，观察NSC23766对肝细胞缺血再灌注损伤相关指标的影响

AML-12细胞常规培养条件为：DMEM/F12 1:1(1×)培养基+10％胎牛血清(FBS)+1％三抗(100×)，37℃，21％O

(1)肝细胞流式细胞仪凋亡检测；

(2)肝细胞乳酸脱氢酶(LDH)含量检测；

(3)肝细胞线粒体膜电位(MMP)变化流式细胞仪检测；

(4)肝细胞凋亡相关蛋白表达Western Blotting检测；

(5)肝细胞DNA损伤相关蛋白Western Blotting检测。

如图6所示：AML-12细胞分别于常规条件(Control)或缺血再灌注条件(IRI)培养，进行IRI处理前，对两种条件培养细胞采用PBS或50μM NSC23766(50μM NSC)孵育2h。IRI后24小时收集各组细胞进行流式细胞仪凋亡检测。ns代表两组之间比较差异无统计学意义，**和***分别代表相应两组相比，P＜0.01和0.001，误差值表示为mean±SEM，N＝3。由图6可知，NSC 23766孵育能够显著的降低IRI培养肝细胞的凋亡比例。

如图7所示：与图5分组相同，IRI后24小时收集各组细胞进行LDH含量检测。*和**分别代表相应两组相比，P＜0.05和0.01，误差值表示为mean±SEM，N＝3。由图7可知，NSC23766孵育能够显著降低肝细胞中LDH的含量。

如图8所示：与图5分组相同，IRI后4小时收集各组细胞进行流式细胞仪MMP变化检测。***代表相应两组相比，P＜0.001，误差值表示为mean±SEM，N＝3。由图8可知，NSC23766孵育能够显著降低肝细胞中线粒体膜电位。

如图9所示：与图5分组相同，Control组与IRI后即刻(即0h)、IRI后2h、6h、12h及24h收集各组细胞，提取蛋白进行Western Blotting检测，分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表达变化。ns代表两组之间比较差异无统计学意义，***代表相应两组相比，P＜0.001，误差值表示为mean±SEM。图像分析使用Image J软件。实验重复3次。由图9可知，NSC 23766孵育能够显著降低凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase 3的表达，12～24h降低幅度尤为明显。

如图10所示：与图5分组相同，Control组与IRI后即刻(即0h)、IRI后2h、6h、12h及24h收集各组细胞，提取蛋白进行Western Blotting检测，分析DNA相关蛋白p-ATR、p-CHK1和γ-H

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。