一种能够提供治疗有效量的白介素10的试剂及其抗肿瘤应用

摘要

本发明公开了一种能够提供治疗有效量的白介素10的试剂及其抗肿瘤应用，具体公开了能够提供治疗有效量的白介素10的试剂在制备用于预防或抑制肿瘤的药物中的用途。所述能够提供治疗有效量的白介素10的试剂选自治疗有效量白介素10、能够在受试者体内表达白介素10的药物、能够刺激受试者体内产生白介素10的药物。本发明还提供了白介素10化学修饰的信使核糖核酸，所述的信使核糖核酸具有编码至少一种白介素10蛋白的开放阅读框，所述的信使核糖核酸经过至少一种化学修饰。本发明克服了技术偏见发现了白介素10能够用于抑制具有白介素10受体的肿瘤，本发明提供的白介素10化学修饰的信使核糖核酸具有抑瘤潜力。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种白介素10化学修饰信使核糖核酸及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤作为一种恶性疾病，其患病人数逐年递增。目前常规的肿瘤治疗方法(手术疗法、放疗、化疗等)都对机体正常组织具有损害且伴有严重的毒副作用，无法满足患者日益增长的临床需求。

细胞因子是一类由活化的免疫细胞或非免疫细胞经刺激所合成、分泌的能作用于本身或其他细胞，具有介导和调节免疫炎症反应等生物学活性的小分子多肽类物质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调节免疫应答。白介素2(IL2)，干扰素(IFN)等细胞因子很早就被发现，并应用于肿瘤治疗相关研究，取得了一定成果。但直接使用细胞因子作为治疗手段会产生一些严重的毒副作用，还存在半衰期短，稳定性差，免疫原性强等问题，影响了它们的临床应用。

转录是一种无时无刻发生在生物体内的过程，是由遗传信息DNA走向蛋白质合成的第一步。在体外无细胞系统中，利用含有核糖核酸(RNA)转录酶、核糖核苷酸(NTP)等条件的体系，用脱氧核糖核酸(DNA)作为模版，模仿体内转录过程生成RNA，通过这样的技术则能够控制转录的基因(模版)、转录的过程和转录后RNA的用途。体外合成信使核糖核酸(mRNA)，并将其回输回体内，并在体内表达对应有功能的蛋白质可以用于疾病治疗，但由于mRNA本身的不稳定性(易被RNA酶降解)和免疫原性限制了它的应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明发现并首次验证了细胞因子白介素10是肿瘤的作用靶点，在受试者体内给与能够激活白介素10受体的白介素10，则能够实现抗肿瘤的作用。本发明进一步通过构建白介素10化学修饰信使核糖核酸，使其能够在细胞内稳定持续表达细胞因子白介素10，实现了肿瘤治疗的目的。

本发明一个方面提供了一种能够提供治疗有效量的白介素10的试剂在制备用于预防或抑制肿瘤的药物中的用途；

本发明第二个方面提供了一种能够提供治疗有效量的白介素10的试剂在制备用于在激活白介素10受体或白介素10受体下游抑制肿瘤的通路的药物中用途。

本发明第三个方面提供了一种能够提供治疗有效量的白介素10的试剂在预防或治疗肿瘤的用途。

在本发明的技术方案中，所述能够提供治疗有效量的白介素10的试剂选自治疗有效量白介素10、能够在受试者体内表达白介素10的药物、能够刺激受试者体内产生白介素10的药物；

在本发明的技术方案中，所述能够在受试者体内表达白介素10的药物选自能够编码白介素10的DNA、能够编码白介素10的RNA或者包含上述编码序列的载体；所述的载体选自水溶液、盐溶液、缓冲液、葡萄糖溶液、脂质体、阳离子脂质体、阳离子聚合物、溶血磷脂、病毒载体、质粒载体、mRNA载体、微环载体或化学合成的载体；

在本发明的技术方案中，所述能够刺激受试者体内产生白介素10的药物选自诱导单核巨噬细胞、T辅助细胞、树突状细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞任意一种或多种的细胞合成并分泌白介素10的药物。例如，脂多糖、儿茶酚胺、CD36和p38丝裂原激活蛋白(MAP)激酶。

在本发明的技术方案中，所述治疗有效量白介素10选自长循环、主动靶向肿瘤和或低降解的白介素10；优选地，所述长循环和或主动靶向肿瘤的白介素10通过长循环和或主动靶向的制剂负载白介素10，和或通过化学修饰白介素10实现长循环和或主动靶向的效果；所述低降解的白介素10为抑制白介素10的抑制剂，或所述抑制剂与白介素10联用。

在本发明的技术方案中，所述能够提供治疗有效量的白介素10的试剂为，能够在受试者体内提供激活白介素10受体转录浓度的白介素10的试剂；优选地，能够在受试者体内表达白介素10的药物为能够在受试者体内表达激活白介素10受体转录浓度的白介素10的药物；能够刺激受试者体内产生白介素10的药物为能够刺激受试者内源分泌白介素，且分泌的白介素浓度达到激活白介素10受体转录浓度的药物。

在本发明的技术方案中，肿瘤为实体瘤或非实体瘤，优选为实体瘤选自膀胱瘤、结直肠瘤、乳腺瘤、黑色素瘤、睾丸瘤、前列腺瘤、肾瘤、肾上腺瘤、腮腺瘤、肝瘤、子宫瘤、脑瘤、卵巢瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、食道瘤、胃癌、宫颈癌瘤、胰腺瘤、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔和口咽癌、甲状腺癌、小肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、胆囊癌、胆管癌、成视网膜细胞瘤、输卵管癌、腹膜癌、骨癌、胶质母细胞瘤；非实体瘤选自白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、突变的慢性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病。

在本发明的技术方案中，肿瘤为所述肿瘤部位的免疫细胞表面表达IL10受体的肿瘤，优选地，所述的免疫细胞选自单核巨噬细胞、T辅助细胞、树突状细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞。

本发明第四个方面提供了一种化学修饰的信使核糖核酸，所述的信使核糖核酸具有编码至少一种白介素10蛋白的开放阅读框，所述的信使核糖核酸经过至少一种化学修饰。

在本发明的技术方案中，所述的化学修饰选自核苷酸的碱基修饰为5’甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、N6-甲基腺苷、肌苷、5羟甲基胞嘧啶、N1甲基腺苷、2-硫尿嘧啶、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、氮杂胞嘧啶、5,6-二氢胞嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶中的至少一种。

在本发明的技术方案中，所述的开放阅读框上有还包含编码信号肽的序列。

本发明第五个方面提供了一种组合物，所述组合物中包含前述的化学修饰信使核糖核酸。

在本发明的技术方案中，所述的组合物中还包含至少一种介质，所述介质选自水溶液、盐溶液、缓冲液、葡萄糖溶液、脂质体、阳离子脂质体、阳离子聚合物、溶血磷脂、病毒载体、质粒载体、mRNA载体、微环或化学合成的载体。

本发明第六个方面提供了一种抗肿瘤药物组合物，所述的抗肿瘤药物组合物包含治疗有效量前述的化学修饰的信使核糖核酸或者前述的组合物。

在本发明的技术方案中，所述的肿瘤为肿瘤为所述肿瘤部位的免疫细胞表面表达白介素10受体的肿瘤，优选地，所述的免疫细胞选自单核巨噬细胞、T辅助细胞、树突状细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞。

在本发明的技术方案中，所述的肿瘤选自膀胱瘤、结直肠瘤、乳腺瘤、黑色素瘤、睾丸瘤、前列腺瘤、肾瘤、肾上腺瘤、腮腺瘤、肝瘤、子宫瘤、脑瘤、卵巢瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、食道瘤、胃癌、宫颈癌瘤、胰腺瘤、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔和口咽癌、甲状腺癌、小肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、胆囊癌、胆管癌、成视网膜细胞瘤、输卵管癌、腹膜癌、骨癌、胶质母细胞瘤；白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、突变的慢性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病。

在本发明的技术方案中，所述能够提供治疗有效量的白介素10的试剂选自前述的化学修饰的信使核糖核酸、前述的组合物或前述的抗肿瘤药物组合物。

本发明第七个方面提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括将能够提供治疗有效量的白介素10的试剂施用于受试者的用途；

在本发明的技术方案中，所述施用的方法包括静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用；

在本发明的技术方案中，所述能够提供治疗有效量的白介素10的试剂选自治疗有效量白介素10、能够在受试者体内表达白介素10的药物、能够刺激受试者体内产生白介素10的药物；

在本发明的技术方案中，所述能够在受试者体内表达白介素10的药物选自能够编码白介素10的DNA、能够编码白介素10的RNA或者包含上述编码序列的载体；所述的载体选自水溶液、盐溶液、缓冲液、葡萄糖溶液、脂质体、阳离子脂质体、阳离子聚合物、溶血磷脂、病毒载体、质粒载体、mRNA载体、微环载体或化学合成的载体；

在本发明的技术方案中，所述能够刺激受试者体内产生白介素10的药物选自诱导单核巨噬细胞、T辅助细胞、树突状细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞任意一种或多种的细胞合成并分泌白介素10的药物。例如，脂多糖、儿茶酚胺、CD36和p38丝裂原激活蛋白(MAP)激酶。

有益效果

1)本发明发现了白介素10能够用于抑制具有白介素10受体的肿瘤。现有技术中通常认为白介素10作为一种细胞因子具有促进肿瘤的作用，或者认为其能够用于指示肿瘤，只能辅助用于肿瘤治疗。本发明克服了技术偏见首次发现了白介素10具有抑制肿瘤的作用。

2)本发明首次发现随着肿瘤的发生和发展在肿瘤内或肿瘤附近不同时间点内白介素10的浓度变化较大，呈现先上升后下降的趋势。后期浓度的降低预示着肿瘤诱导的内源性白介素10无法达到抗肿瘤的效果，所以肿瘤随着白介素10浓度降低，肿瘤体积增加，而只有足够浓度的外源性施予的白介素10才能够实现激活白介素10受体进而诱发下游通路的目的。

3)本发明通过构建白介素10化学修饰的信使核糖核酸验证了只要给与足够浓度的白介素10，就能够实现抗肿瘤的效果。本发明白介素10化学修饰的信使核糖核酸结果也验证了白介素10是肿瘤作用靶点，只要施予足够浓度白介素10即可以实现抑制肿瘤的作用。

4)本发明通过构建白介素10化学修饰的信使核糖核酸，极大的延长了白介素10的半衰期。而相对于脱氧核糖核酸，本发明的信使核糖核酸不需要转录环节，起效快。而且相对于直接注射白介素10或者采用脱氧核糖核酸进行翻译，本发明的化学修饰的信使核糖核酸免疫反应性更小，更适合人体或动物体施用。

附图说明

图1为实施例1中小鼠膀胱癌皮下肿瘤模型中不同时间点肿瘤组织中的IL10浓度变化曲线。

图2为实施例1中小鼠膀胱癌皮下肿瘤模型中不同时间点肿瘤重量变化曲线。

图3为实施例2中接受注射IL10抗体以及未注射IL10抗体的小鼠肿瘤体积变化曲线。

图4为实施例3中RAW 264.7细胞体外培养添加不同浓度IL10对应IL10受体mRNA变化曲线。

图5为实施例3中Jurkat细胞体外培养添加不同浓度IL10对应IL10受体mRNA变化曲线。

图6为实施例4中体外合成IL10cmRNA的凝胶电泳结果。

图7为实施例5中针对MB49细胞和RAW 264.7细胞分别转染1μg的IL10cmRNA后的IL10的表达情况。相比未转染IL10 cmRNA的细胞对照组，两种细胞培养的上清液中的IL10表达量均处在相对较高水平，说明IL10正常翻译并大量分泌到胞外。

图8为实施例6中小鼠皮下膀胱癌模型瘤内注射10μg/40μg IL10cmRNA后肿瘤大小变化情况。注射IL10 cmRNA的实验组小鼠肿瘤生长被显著抑制，证明IL10 cmRNA具有抑制肿瘤生长的治疗效果。

图9为实施例7中小鼠皮下膀胱癌模型瘤内注射10μg/40μg IL10cmRNA后小鼠体重大小变化。相比未注射IL10 cmRNA的对照组，注射IL10 cmRNA的实验组小鼠体重在注射后未有明显降低，证明IL10 cmRNA的安全性。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

“治疗有效量”指由本发明的活性成分单独地或与另一种治疗剂组合地使用时保护受试者预防肿瘤发生、减缓肿瘤发展、降低肿瘤并发症、降低肿瘤严重程度、减少肿瘤复发、降低肿瘤持续时间等的任何量。可以使用熟练的从业人员，例如医生、研究员等，已知的多种方法评价治疗剂促进疾病消退的能力，如在临床试验期间的人类受试者中，在预测人类功效的动物模型系统中，或者通过测定药剂在体外测定中的活性进行评价。

“受试者”包括任何人或非人动物。非人动物包括但不限于脊椎动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、猪、兔子和啮齿动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)。

“抑瘤”、“抗瘤”、“抑制肿瘤”等术语代表逆转、减轻、改善、抑制、减缓肿瘤发生发展或预防肿瘤症状、并发症或降低肿瘤的发作、进展、发展、严重程度或复发或者与疾病相关的生化指标。

本发明一些实施例中提供了能够提供治疗有效量的白介素10的试剂在制备用于预防或抑制肿瘤的药物中的用途。

本发明一些实施例中提供了能够提供治疗有效量的白介素10的试剂在制备用于在激活白介素10下游抑制肿瘤的通路的药物中用途。

本发明一些实施例中提供了能够提供治疗有效量的白介素10的试剂在预防或治疗肿瘤的用途。

本发明再一个实施例提供了治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括将能够提供治疗有效量的白介素10的试剂施用于受试者的用途。

本发明再一个实施例提供了白介素10作为抑制肿瘤作用靶点的用途。

在本发明的一些实施例中，所述治疗有效量指所述白介素10的试剂能够在受试者体内激活白介素10受体转录的剂量。

在本发明的一些优选的实施例中，所述治疗有效量指所述白介素10的试剂能够在受试者体内激活白介素10受体的mRNA激活下游通路的剂量。

在本发明的一些优选的实施例中，所述治疗有效量选自例如肿瘤部位白介素10浓度达到0.1ng/mL以上、0.2ng/mL以上、0.3ng/mL以上、0.4ng/mL以上、0.5ng/mL以上、0.6ng/mL以上、0.7ng/mL、以上0.8ng/mL、以上0.9ng/mL、1ng/mL以上时。或者在0.1ng/mL-10ng/mL之间任意范围。

在本发明的一些实施例中，能够提供治疗有效量的白介素10的试剂为，能够在受试者体内提供激活白介素10受体转录浓度的白介素10的试剂。优选地，能够在受试者体内表达白介素10的药物为能够在受试者体内表达激活白介素10受体转录浓度的白介素10的药物；能够刺激受试者体内产生白介素10的药物为能够刺激受试者内源分泌白介素，且分泌的白介素浓度达到激活白介素10受体转录浓度的药物。

在本发明的一些实施例中，提供治疗有效量的白介素10的试剂为能够提供治疗有效量的白介素10的试剂为，能够在受试者体内激活免疫细胞表面白介素10受体实现免疫细胞杀伤肿瘤的的试剂。所述的免疫细胞选自单核巨噬细胞、T辅助细胞、树突状细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞。

在本发明的一些实施例中，上述施用的方法包括静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输液)。优选地，通过将能够提供治疗有效量的白介素10的试剂直接适用于肿瘤内部或附近。优选地，通过靶向制剂将能够提供治疗有效量的白介素10的试剂靶向输送到肿瘤部位。

在本发明的一些优选的实施例中，能够提供治疗有效量的白介素10的试剂选自治疗有效量白介素10、能够在受试者体内表达白介素10的药物、能够刺激受试者体内产生白介素10的药物。

在本发明的一些实施例中，治疗有效量白介素10通过增加有效量白介素10施用剂量，或者通过降低白介素10分解或代谢实现。降低白介素10分解或代谢的方法可以采用本领域常规的制剂方式或者化学修饰实现，例如通过增加靶向性，加快白介素10尽快进入作用区域，降低在体内循环中的分解或代谢。还可以通过抑制白介素10的抑制剂，例如抑制白介素10抗体的作用实现。还可以通过制剂方式降低降解等。

在本发明的一些实施例中，能够在受试者体内表达白介素10的药物选自能够编码白介素10的DNA、能够编码白介素10的RNA或者包含上述编码序列的载体；所述的载体选自水溶液、盐溶液、缓冲液、葡萄糖溶液、脂质体、阳离子脂质体、阳离子聚合物、溶血磷脂、病毒载体、质粒载体、mRNA载体、微环载体或化学合成的载体。所述RNA选自mRNA。

在本发明的一些实施例中，能够刺激受试者体内产生白介素10的药物选自诱导单核巨噬细胞、T辅助细胞、树突状细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞任意一种或多种的细胞合成并分泌白介素10的药物。例如，脂多糖、儿茶酚胺、CD36和p38丝裂原激活蛋白(MAP)激酶。

在本发明的一些优选的实施例中，能够提供治疗有效量的白介素10的试剂选自本发明所述化学修饰的信使核糖核酸或者本发明所述的组合物。

在本发明的一些实施例中，能够提供治疗有效量的白介素10的试剂作为活性成分。

在本发明的一些实施例中，能够提供治疗有效量的白介素10的试剂作为唯一活性成分。

在本发明的一些实施例中，所述的肿瘤为免疫细胞表面表达IL10受体的肿瘤，优选为膀胱瘤、结直肠瘤、乳腺瘤、黑色素瘤、睾丸瘤、前列腺瘤、肾瘤、肾上腺瘤、腮腺瘤、肝瘤、子宫瘤、脑瘤、卵巢瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、食道瘤、胃癌、宫颈癌瘤、胰腺瘤、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔和口咽癌、甲状腺癌、小肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、胆囊癌、胆管癌、成视网膜细胞瘤、输卵管癌、腹膜癌、骨癌、胶质母细胞瘤；白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、突变的慢性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病。

本发明一些具体实施例提供了一种化学修饰的信使核糖核酸，所述的信使核糖核酸具有编码至少一种白介素10蛋白的开放阅读框，所述的信使核糖核酸经过至少一种化学修饰。

在本发明的一些实施例中，所述的开放阅读框是密码子优化的。

在本发明的一些实施例中，所述的白介素10为人源白介素10、鼠源白介素10。

在本发明的一些实施例中，所述的白介素10具有与序列NC_000001.11，NM_010548.270％-100％的同源性，优选为95％-100％，或者99％-100％的同源性。

在本发明的一些实施例中，所述的化学修饰选自核苷酸的碱基修饰为5’甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、N6-甲基腺苷、肌苷、5羟甲基胞嘧啶或N1甲基腺苷。

在本发明的的一些实施例中，所述的开放阅读框中60％-100％的尿嘧啶是具有化学修饰的，优选为90％-100％的尿嘧啶是具有化学修饰的，更优选为95％-100％的尿嘧啶是具有化学修饰的。

在本发明的一些实施例中，所述的尿嘧啶的化学修饰为假尿嘧啶。

在本发明的一些实施例中，所述的开放阅读框中60％-100％的胞嘧啶是具有化学修饰的，优选为90％-100％的胞嘧啶是具有化学修饰的，更优选为95％-100％的胞嘧啶是具有化学修饰的。

在本发明的一些实施例中，所述的胞嘧啶的化学修饰为5’甲基胞嘧啶。

在本发明的一些实施例中，所述的开放阅读框中100％的胞嘧啶化学修饰为5’甲基胞嘧啶；100％的尿嘧啶化学修饰为假尿嘧啶。

在本发明的一些实施例中，所述的开放阅读框上游和或下游具有增强开放阅读框表达的非编码区序列。

在本发明的一些实施例中，5’端非编码区序列的上游还包括5’端帽子结构；3’端非编码区序列的下游包括多聚腺苷酸序列。

在本发明的一些实施例中，所述的开放阅读框上有还包含编码信号肽的序列。

本发明另一些实施例中提供了一种组合物，所述组合物中包含上述化学修饰信使核糖核酸。

在本发明的一些实施例中，所述的载体中还包含至少一种介质，所述介质选自水溶液、盐溶液、缓冲液、葡萄糖溶液、脂质体、阳离子脂质体、阳离子聚合物、溶血磷脂、病毒载体、质粒载体、mRNA载体、微环或化学合成的载体。

在本发明的一些实施例中，阳离子聚合物选自中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)

本发明另一个方面提供了一种抗肿瘤药物组合物，所述的抗肿瘤药物组合包含治疗有效量白介素10、能够在受试者体内表达白介素10的药物、能够刺激受试者体内产生白介素10的药物。

在本发明的一些实施例中，治疗有效量白介素10通过增加有效量白介素10施用剂量，或者通过降低白介素10分解或代谢实现。降低白介素10分解或代谢的方法可以采用本领域常规的制剂方式实现，例如通过增加靶向性，加快白介素10尽快进入作用区域，降低在体内循环中的分解或代谢。还可以通过抑制白介素10的抑制剂，例如抑制白介素10抗体的作用实现。还可以通过制剂方式降低降解等。

在本发明的一些实施例中，能够在受试者体内表达白介素10的药物选自能够编码白介素10的DNA、能够编码白介素10的RNA、包含上述编码序列的载体；所述的载体选自水溶液、盐溶液、缓冲液、葡萄糖溶液、脂质体、阳离子脂质体、阳离子聚合物、溶血磷脂、病毒载体、质粒载体、mRNA载体或化学合成的载体。

在本发明的一些实施例中，能够刺激受试者体内产生白介素10的药物选自诱导单核巨噬细胞、T辅助细胞、树突状细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞任意一种或多种的细胞合成并分泌白介素10的药物。例如，脂多糖、儿茶酚胺、CD36和p38丝裂原激活蛋白(MAP)激酶。

在本发明的一个优选的实施例中，能够在受试者体内表达白介素10的药物选自上述化学修饰的信使核糖核酸或者上述载体。

在本发明的一些实施例中，上述抗肿瘤药物组合物中还包括任意一种药物辅料。

在本发明的一些实施例中，上述抗肿瘤药物组合物中还包括另外至少一种治疗肿瘤的活性成分。

本发明还提供了一些实施例，其公开了本发明所述的化学修饰的信使核糖核酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

通过体外转录反应合成RNA，体外转录反应过程中，以化学修饰碱基的核苷酸替代普通碱基核苷酸。

在本发明的一些实施例中，体外转录反应过程中以线性的DNA作为模板，所述的线性的DNA为编码任意一种IL10的DNA。

在本发明的一些实施例中，体外转录反应过程中加入腺嘌呤核糖核苷酸、5’甲基胞嘧啶腺嘌呤核糖核苷酸、假尿嘧啶腺嘌呤核糖核苷酸、抗反转帽子类似物和鸟嘌呤核糖核苷酸。

在本发明一个具体的实施例中，利用化学修饰碱基在体外合成细胞因子白介素10信使核糖核酸(IL10 cmRNA)，具体方法如下：

首先，构建细胞因子体外转录用质粒载体，目的基因编码区经过密码子优化，同时前后具有能够增强编码区表达的5’/3’非编码区序列。直接体外合成mRNA存在稳定性差，免疫原性强等特点，为了解决此问题，本发明采用在体外转录合成mRNA过程中同时引入化学修饰碱基5’甲基胞嘧啶以及假尿嘧啶，提高所合成mRNA的稳定性，降低免疫原性同时提高其翻译效率。

通过体外细胞转染，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子的表达情况

通过将体外合成的IL10cmRNA转染至HEK 293T/MB49/RAW 264.7等细胞中，通过ELISA检测细胞培养上清液和细胞内细胞因子IL10的表达情况，验证IL10的表达。本发明的构建的IL10 cmRNA能够在细胞内表达IL10，表达效率高，同时通过加入信号肽，实现了IL10的分泌，虽然信号肽也经过了化学修饰，但是并未影响IL10的外泌。

通过荷瘤小鼠模型测试细胞因子IL10cmRNA的肿瘤治疗作用

为证明IL10cmRNA对实体瘤生长的抑制作用，构建小鼠皮下肿瘤模型，同时通过构建巨噬细胞缺陷小鼠，排除巨噬细胞分泌IL10的因素干扰，观察小鼠肿瘤生长大小并收集血清及各器官组织检测IL10及其它关键细胞因子水平。本发明动物实验结果显示，仅在造模后注射一次细胞因子白介素10化学修饰信使核糖核酸即可以实现较好的抑瘤效果。虽然不希望被理论束缚，但这可能是由于细胞因子白介素10化学修饰信使核糖核酸相对于细胞因子白介素10具有更好的稳定性和更低的免疫原性。细胞因子白介素10直接注射会导致其在体内快速代谢或引起促进肿瘤发展的作用。但化学修饰的细胞因子白介素10化学修饰信使核糖核酸能够在体内稳定表达白介素10，并释放足够浓度白介素10，使其进一步激活白介素10下游通路，进而实现抑制肿瘤的作用。

实施例1小鼠膀胱癌皮下肿瘤模型探究肿瘤生长过程中的IL10浓度动态变化

采用荷瘤小鼠皮下膀胱癌模型，以注射肿瘤细胞当天作为时间起点，在5d，7d，9d，12d，14d，16d分别取肿瘤组织，ELISA测定IL10蛋白浓度。

结果如图1，图2所示，随着肿瘤不断增长，瘤内IL10浓度会呈现出先上升后下降的趋势，猜测维持瘤内IL10高浓度对于肿瘤治疗有积极效果。现有技术中通常采用固定时间点分析肿瘤组织或受试者IL10的表达水平，以此判断肿瘤发展或者判断其促瘤效果。但是通过本发明实验发现不同时间点肿瘤内的IL10水平并非一直上涨或下降，而是先上涨后下降。对比肿瘤体积与IL10的结果发现随着IL10浓度降低肿瘤体积迅速长大。可能是由于初期内源性分泌的IL10具有一定的抑制肿瘤的效果，但是随着肿瘤的发展，IL10浓度不足以实现对肿瘤的抑制。

实施例2小鼠膀胱癌皮下肿瘤模型探究体内IL10水平对肿瘤生长的影响

采用荷瘤小鼠皮下膀胱癌模型，造模成功后分别于-3d，0d，2d，6d，9d，12d，14d通过小鼠尾静脉注射50μg IL10抗体中和小鼠体内的IL10，并以尾静脉注射磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline，PBS)的小鼠作为对照组，观察肿瘤生长情况。

结果如图3所示，与对照组相比注射IL10抗体后小鼠肿瘤生长未受明显影响，持续增长。该实验结果首先证实了IL10并非促瘤因素，降低体内IL10水平并不会降低肿瘤的发生和发展，相反地，在12和14天时肿瘤体积相对于对照组更大，该实验结果结合实施例5的结果可知，肿瘤内部内源分泌的IL10随时间下降以及IL10抗体的共同作用导致了肿瘤在后期体积相对于对照组更大。

实施例3RAW 264.7细胞，Jurkat细胞体外培养添加不同浓度IL10对应IL10受体mRNA转录水平测定

为了验证IL10达到一定浓度才能刺激巨噬细胞系和T淋巴细胞系对应IL10受体基因的转录及对应蛋白的表达，分别向已培养好的RAW 264.7细胞和Jurkat细胞中加入含有不同浓度IL10(0，0.1，0.5，1，3，5，7，9，10ng/mL)的新鲜培养基，培养24h后收集细胞提取RNA，测定受IL10刺激激活转录的IL10受体mRNA的含量。

结果如图4，图5所示，加入低浓度IL10无法刺激IL10受体基因的转录，而当加入的IL10达到并超过一定浓度(RAW 264.7＞1ng/mL，Jurkat＞3ng/mL)时，IL10受体mRNA水平迅速增高，表明IL10与IL10受体结合后刺激下游通路的信号转导，使IL10受体基因的转录被激活。该实验结果也与实施例5-6的结果吻合。

实施例4细胞因子白介素10(IL10)化学修饰信使核糖核酸(IL10cmRNA)的构建

采用IL10的DNA为模板，将IL10的DNA构建在具有T7启动子的质粒上，且IL10编码区上下游具有增强表达的5’/3’非编码区等序列。将其线性化后作为模板，通过体外转录反应合成RNA，在合成反应中引入5’端的m7G帽子结构和3’端多聚腺苷酸(polyA)结构，使其具有mRNA特定结构，同时引入5’甲基胞嘧啶以及假尿嘧啶等化学修饰碱基提高其稳定性和翻译效率。体外转录反应体系为1μg的线性化模版DNA，150nmol腺嘌呤，5’甲基胞嘧啶，假尿嘧啶，120nmol抗反转帽子类似物(Anti-Reverse Cap Analog，ARCA)和30nmol鸟嘌呤核糖核苷酸。经T7 RNA聚合酶在37摄氏度条件下反应6小时后，添加DNA酶在37摄氏度条件下继续反应30分钟消化DNA模版，之后扩大反应体系至100μL，加入100nmol腺嘌呤和250nmol氯化锰，在37摄氏度下利用Poly(A)聚合酶在RNA的3’端合成多聚腺苷酸，加尾反应1小时。每100μL反应体系添加150μL无核酸酶超纯水和150μl氯化锂沉淀剂纯化已合成的mRNA，-20摄氏度下反应至少2小时后经离心，70％乙醇洗涤后用无核酸酶超纯水溶解，放入-80摄氏度冰箱保存。

结果如图6所示，体外转录成功合成目标长度的IL10cmRNA，同时加尾成功(泳道1为未加尾的RNA，泳道2为加尾后的RNA，参照为RiboRuler High Range RNA Ladder)。

实施例5MB49细胞和RAW 264.7细胞转染IL10cmRNA的IL10表达量测定

为了验证IL10cmRNA在癌细胞系和巨噬细胞系中仍具备正常翻译的功能，分别将1μg的IL10 cmRNA转染至膀胱癌细胞MB49以及巨噬细胞RAW 264.7中，并以细胞孵育12h后为时间起点，在12h，24h，48h，60h，72h分别提取细胞组织液及细胞上清液，ELISA测定IL10蛋白的表达量。

结果如图7所示，相比未转染IL10cmRNA的细胞对照组，转染IL10 cmRNA的两种细胞培养的上清液中的IL10表达量均处在相对较高水平，而细胞组织液中的IL10表达量较低，说明IL10正常翻译并大量分泌到胞外。

从实施例2和实施例3的结果可知，本发明通过制备化学修饰的信使核糖核酸极大的延长了细胞因子IL10的作用时间，现有技术中IL10在体内的作用时间很短，半衰期只有几个小时，而从本发明的结果来看在第60-80小时时还保持了基本稳定的外泌浓度。

此外，通过实施例2和3的结果可以看出，本发明增加了控制分泌序列的信号肽，该信号肽的功能并未受到化学修饰的影响，保持了向细胞外分泌的作用，实现了高效率的分泌。

实施例6小鼠膀胱癌皮下肿瘤模型验证IL10cmRNA肿瘤治疗作用

为了验证IL10cmRNA抗肿瘤效果，通过构建小鼠膀胱癌皮下肿瘤模型进行评价。

采用荷瘤小鼠皮下膀胱癌模型，造模成功后在瘤内注射10μg或40μg IL10cmRNA，并以不注射IL10 cmRNA作为阴性对照。以注射当天作为时间起点，在0d，2d，4d，6d，8d，10d，14d测量小鼠体重及肿瘤大小，结果如图8-9所示。图8显示了小鼠肿瘤增长情况，横坐标为实验时间，纵坐标为肿瘤体积增加百分比，其中对照组随着时间的增长肿瘤的体积显著增加，而注射10μg或40μg IL10 cmRNA的实验组虽然肿瘤体积略有增加，但增加幅度较低，有效抑制了肿瘤的发展。图9显示了小鼠的体重变化情况，注射10μg或40μg IL10 cmRNA的实验组小鼠的体重在注射后比较平稳，证明IL10 cmRNA的安全性高，毒副作用低。

动物实验的周期相比于上述细胞实验的周期更长，虽然本发明仅向荷瘤小鼠体内注射了1次IL10 cmRNA，但是可以看出其可以在体内长时间作用。从动物实验结果也证实了本发明构建IL10 cmRNA半衰期长。虽然不希望被理论束缚，但是本发明的试验验证了本发明IL10cmRNA具有抗肿瘤效果，有可能是由于本发明的IL10 cmRNA提供了稳定表达的高浓度IL10，达到一定浓度的IL10实现了下游抗肿瘤通路的激活。本发明克服了技术偏见，证实了本发明IL10 cmRNA具有抗肿瘤效果。