一种Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种Anti‑FLT1多肽介导合成的金团簇及其制备方法和用途，属于生物医用材料领域。该金团簇是含有Anti‑FLT1多肽的金团簇；所述Anti‑FLT1多肽的氨基酸序列为CGNQWFI。本发明采用简单的一锅法合成了Anti‑FLT1多肽介导合成的金团簇，该金团簇具有优良的抗血管生成作用和优良的光动力治疗效果；与单独使用Anti‑FLT1多肽或未利用Anti‑FLT1多肽介导合成的金团簇相比，本发明Anti‑FLT1多肽介导合成的金团簇取得了协同增效作用。本发明Anti‑FLT1多肽介导合成的金团簇克服了现有技术中金团簇抗血管生成和光动力治疗效果不佳的缺陷，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇及其制备方法和用途。

背景技术

金团簇(AuNCs)，是由几个到几十个金原子组成核心，有机单分子如硫醇类化合物或者蛋白质等作为配体保护基团组合而成的分子级聚集体，具有配体壳-金属核结构。其具有良好的生物相容性，优异的荧光量子产量和光稳定性，荧光可调性。这些特性使得金团簇应用前景广泛。金团簇可用于细胞标记、成像以及药物的传递，光动力抗肿瘤治疗(PDT)，重金属离子检测，蛋白质及微生物检测等。同时，有研究表明纳米金还具有抗血管生成活性。金团簇可以通过作用于肝素结合蛋白如血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(bFGF)，抑制内皮细胞的增殖，从而抑制血管的生成。

近年来，配体多肽保护金纳米团簇日益受到关注。因为多肽合成的AuNCs不仅具有上述优点，更重要的是多肽序列的多样性与多功能性使得设计具有特定识别功能的纳米团簇成为可能。

广州医科大学Xing课题组最近报道了以RGD多肽序列实现了金团簇对癌细胞的特异性靶向。王晓娟，曲剑波等人利用设计合理有效的多肽序列，合成可对细胞核仁靶向标记的纳米金簇，为研究细胞核仁及其相关过程提供更好的帮助。进一步地，王晓娟，曲剑波等人设计了一种KCK多肽介导合成的靶向标记细胞核仁的金纳米簇，降低现有细胞核仁标记材料细胞成像的背景干扰以及解决现有细胞核仁标记材料制作成本高、毒性大、制作工艺复杂的问题。

但是，尚未见使用多肽介导合成的金团簇可以增强抗血管生成活性并且提高光动力治疗效果。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明目的在于寻求一种Anti-FLT1多肽介导合成的具有更加明确的抑制血管生成活性的金团簇及其制备方法和用途。从而提高金团簇的抑制血管生成和光动力治疗效果。

本发明提供了一种金团簇，它是含有Anti-FLT1多肽的金团簇；所述Anti-FLT1多肽的氨基酸序列为CGNQWFI。

进一步地，所述Anti-FLT1多肽的结构如式I所示：

进一步地，所述金团簇是以金原子为金属核，Anti-FLT1多肽为配体壳；

优选地，所述金团簇的粒径为0.5～5nm；

更优选地，所述金团簇的粒径约为2nm。

进一步地，所述金团簇是由四氯金酸和Anti-FLT1多肽为原料制备而成；

优选地，所述四氯金酸和Anti-FLT1多肽的摩尔质量比为1：(0.5～4)；

更优选地，所述四氯金酸和Anti-FLT1多肽的摩尔质量比为1：4。

进一步地，所述金团簇的制备方法包括如下步骤：

(1)用超纯水将Anti-FLT1多肽配制成悬液；

(2)在悬液中加入四氯金酸溶液，混合后反应，得反应液；

(3)超滤反应液，即得。

进一步地，

步骤(1)中，所述悬液中Anti-FLT1多肽的浓度为2～2.5mg/mL；

和/或，步骤(2)中，所述四氯金酸溶液为四氯金酸水溶液；

和/或，步骤(2)中，所述反应为先20～25℃反应5～10分钟，然后升温至70～80℃反应8～12小时；

和/或，步骤(3)中，所述超滤使用10KD的超滤管；

优选地，

步骤(2)中，所述四氯金酸溶液的浓度为100mmol/L。

本发明还提供了一种制备前述的金团簇的方法，它包括如下步骤：

(1)用超纯水将Anti-FLT1多肽配制成悬液；

(2)在悬液中加入四氯金酸溶液，混合后反应，得反应液；

(3)超滤反应液，即得。

进一步地，

步骤(1)中，所述悬液中Anti-FLT1多肽的浓度为2～2.5mg/mL；

和/或，步骤(2)中，所述四氯金酸溶液为四氯金酸水溶液；

和/或，步骤(2)中，所述反应为先20～25℃反应5～10分钟，然后升温至70～80℃反应8～12小时；

和/或，步骤(3)中，所述超滤使用10KD的超滤管；

优选地，

步骤(2)中，所述四氯金酸溶液的浓度为100mmol/L。

本发明还提供了前述的金团簇在制备光敏剂中的用途；

优选地，所述光敏剂为光动力治疗中使用的光敏剂。

本发明还提供了前述的金团簇在制备抑制血管生成的药物中的用途；

优选地，所述药物可用于治疗肿瘤。

与现有的技术相比，本发明涉及的Anti-FLT1多肽介导合成的AF@AuNCs制备方法简单，操作性强，成本低，生物亲和性好，毒性低，稳定性好，具有良好地荧光性，可以用于抑制血管管腔形成。并增强了PDT效果。为AuNCs的PDT研究提供了新的思路与方法。

即本发明采用简单的一锅法合成了Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇，该金团簇具有优良的抗血管生成作用和优良的光动力治疗效果；与单独使用Anti-FLT1多肽或未利用Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇相比，本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇取得了协同增效作用。本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇克服了现有技术中金团簇抗血管生成和光动力治疗效果不佳的缺陷，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的透射电镜图。

图2为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的水合粒径分布图。

图3为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的荧光谱图。

图4为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制血管的管腔形成结果。

图5为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制血管内皮细胞迁移和侵袭的结果：A为Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制血管内皮细胞迁移的显微图像；B为Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制血管内皮细胞迁移的统计学分析结果；C为Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制血管内皮细胞侵袭的显微图像；D为Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制血管内皮细胞侵袭的统计学分析结果。

图6为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成结果：A为显微镜图像；B为统计学分析结果。

图7为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇光动力作用。

图8为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇AO/PI染色结果。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本发明中，Anti-FLT1多肽的氨基酸序列为Cys-Gly-Asn-Gln-Trp-Phe-Ile，缩写为CGNQWFI(SEQ ID NO.1)；Anti-FLT1多肽的结构式如式I所示：

实施例1、本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的制备

具体工艺步骤如下：

(1)将玻璃瓶用王水浸泡处理，清洗干净后烘干备用。

(2)取15mL超纯水加入到处理好的玻璃瓶中，称取34.68mg Anti-FLT1多肽溶于超纯水中，剧烈搅拌使其分布均匀。缓慢加入100μL，100mmol/L的HAuCl

(3)反应结束后将样品移到10KD超滤管中，10000rpm离心20分钟，得到终产物Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇(AF@AuNCs)。

实施例2、本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的制备

采用实施例1所述的制备方法，Anti-FLT1和HAuCl

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的理化性能表征

1、试验方法

取实施例1制备的AF@AuNCs用超纯水稀释1000倍，并在室温下使用超声震荡30min后，加入比色皿中，在动态光散射仪(SZ-100Z，日本Horiba公司)上测定AF@AuNCs的粒径分布。

室温下将实施例1制备的AF@AuNCs用超纯水稀释1000倍，取10μL滴在干净的铜网片上，室温通风干燥后，使用TEM(JEM-2100F)观察。

取1.5mL实施例1制备的AF@AuNCs，加入长方体形四方通透的石英比色皿中，先测得该样品的发射波长，再根据发射波长测量其合适的激发波长。得到3维荧光谱图。

2、试验结果

由图1投射电镜图和图2粒径分布图可知本发明制备的得到的AF@AuNCs粒径范围在2nm左右。图3为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的三维紫外分光光度计检测结果，由图3可知：在3D荧光光谱，结果表明合成的AF@AuNCs具有一个红色发射带，中心约为620nm，以及一个较大的Stokes位移。在330nm附近有明显的吸收峰，在575-635nm区间有较强的荧光发射，发射峰为605nm。确定材料的激发波长和发射波长。

试验例2、本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的抑制血管生成的细胞试验

一、管腔形成试验

1、试验方法

为了验证实施例1制备得到的AF@AuNCs对血管生成的抑制作用，进行了管腔形成试验，具体试验方法如下：

(1)融胶：将Matrigel基质胶放入4℃冰箱过夜使之解冻。96孔板，黄枪尖均放于4℃冰箱提前预冷。

(2)铺胶：在96孔板，每孔缓慢加入50μL的基质凝胶，尽量避免气泡产生，冰上静置10分钟。每组3个副孔。之后放入在37℃下培养45分钟以形成凝胶。

(3)种板：从T25培养瓶中取出胰酶消化下来的细胞HUVECs细胞，用无血清培养基制成HUVECs细胞悬液。按照3.0×10

(4)加药：分别加入相同剂量的AF(Anti-FLT1多肽)、AF@AuNCs、AuNCs及阴性对照PBS(药物浓度：25μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)。在细胞培养箱中培养6h。

(5)采图：用倒置荧光显微镜拍摄管腔形成图像，每个孔采集3个视野。

(6)分析：用ImageJ软件Angiogenesis插件自动分析管腔的长度，节点数，网眼术等计量血管生成的指标。

AuNCs为传统常用的金团簇，谷胱甘肽(GSH)保护的金团簇，具体制备方法如下：

(1)清洗容器：将玻璃瓶用王水浸泡处理，清洗干净后烘干备用。

(2)GSH悬液的制备：称取3.07mg的L-谷胱甘肽放入含有15mL超纯水中玻璃瓶中，快速搅拌溶解。

(3)加入HAuCl

(4)混合液制备：混合均匀后置于集热式恒温磁力搅拌器上剧烈搅拌5min(25℃)。

(5)合成：随后升温至70℃反应12小时得反应液，将反应液移到10KD超滤管中，10000rpm离心20分钟，即得AuNCs。

(6)合成鉴定及储存：将AuNCs放入波长为365纳米的紫外光照灯检测产物是否有荧光生成，将成功制备得到的AuNCs冷却至室温后放入4℃冰箱长期保存。

2、试验结果

本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制血管管腔的能力如图4所示。图4是不同抗血管生成药物AF、AF@AuNCs、AuNCs在25μg/mL、100μg/mL和200μg/mL浓度下，对HUVECs管腔形成的影响的代表性图片。图像显示，三组药均具有抑制管腔形成的能力，管腔的形成受药物浓度变化影响。在浓度为100μg/m和200μg/mL时，AF@AuNCs的抗血管生成作用强于其他组，图片中可见，HUVECs细胞呈分散状弥散在视野的各处，几乎没有明显的管腔结构形成。其中，100μg/mL的AF@AuNCs抗管形成效果最好。说明相同剂量下，本发明制备的Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抗血管生成明显优于单独使用Anti-FLT1多肽和传统的金团簇，发挥了协同增效的作用。

二、划痕试验和侵袭实验

1、试验方法

划痕试验：

采用划痕试验研究实施例1制备得到的AF@AuNCs对HUVECs迁移的影响，具体试验方法如下：

(1)种板：将HUVECs在6孔板中孵育24小时，达到大于90％融合度。

(2)划痕：用黄枪尖在细胞上，沿着6孔板的水平和垂直方向上的长轴平稳画线。

(3)洗涤：用PBS洗涤三次，去除损伤和被刮离的细胞。

(4)加药：加入无血清培养基培养人脐静脉内皮细胞，并且各个实验孔中分别加入100μg/mL AF、AF@AuNCs和AuNCs；划痕后不加药物作为对照组。

(5)观测：在时间点0小时和24小时在显微镜下拍照记录划痕处的图片。

(6)计算愈合率：用ImageJ软件进行分析。愈合的百分比＝(最开始面积-某时间点的面积)/最初面积。

侵袭实验：

采用transwell小室进行侵袭试验检测实施例1制备得到的AF@AuNCs对HUVECs的纵向迁移能力的影响，具体试验方法如下：

(1)饥饿细胞：在细胞种板前，将细胞饥饿处理12小时。

(2)种板：将消化下来的HUVECs细胞悬液浓度调整到5.0×10

(3)加药：在transwell上室中分别加入100μg/mL的AF、AF@AuNCs和AuNCs，而在下室中加入750μL含有10％FBS的DMEM(每组有3个重复孔)，将孔板放入培养箱中培养12小时。不加药物作为对照组。

(4)固定：吸出上下室的培养液后，PBS洗涤3次，再用10％多聚甲醛固定细胞。

(5)染色：用配制好的1:1000的DAPI染料进行染色5分钟。

(6)观察：倒置荧光显微镜下采图，每个孔板采图5个视野。

(7)分析：ImageJ软件分析每个视野下的荧光面积。

AuNCs的制备方法同试验例2中“一、管腔形成试验”。

2、试验结果

图5为本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制血管内皮细胞迁移的能力的结果。如图5A所示，24小时观察时间点，在100μg/mL AF和AF@AuNCs的参与下，划痕处的间隙仍较宽，与初始间隙面积相差不大。说明该划痕处愈合很少。而其他组的间隙变窄，面积减小，细胞爬行覆盖更多。说明划痕处愈合较多。此图证明了AF和AF@AuNCs可以显著抑制HUVECs迁移。图5B的统计分析也表明了这一趋势：对于使用100μg/mL的AF和AF@AuNCs治疗组，HUVEC其愈合面积仅为对照组和AuNCs组的三分之一(P<0.01)。而AF@AuNCs抑制HUVECs迁移的效果又显著优于单独使用AF。说明AF与AuNCs复合后得到的Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇可以提高抑制HUVECs迁移的能力，发挥了协同增效作用。

侵袭性结果中蓝色荧光区域反映了穿过transwell膜的细胞。这些细胞的细胞核被DAPI染色成为蓝色。所以蓝色区域的面积越大，代表了穿透细胞的数量越多。图5C显示，AF和AF@AuNCs处理组的迁移细胞数量(蓝色荧光点)少于其余各组。在图5D中，100μg/mL AF和AF@AuNCs的荧光面积约为对照组和AuNCs组的一半(P<0.01)。数据表明AF和AF@AuNCs显著抑制HUVECs的侵袭。

上述试验结果表明本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇可以有效抑制HUVECs细胞迁移和侵袭，并且发挥协同增效作用。

试验例3、本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的抑制血管生成的动物试验

1、试验方法

采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验研究实施例1制备得到的AF@AuNCs对血管生成的抑制作用，具体试验方法如下：

(1)鸡胚孵育：受精卵消毒后，在37℃、相对湿度60％的培养箱中孵育7天。随即分为4组，每组4个重复。

(2)标记气室：用照蛋器光照鸡蛋钝头端寻找气室范围。用黑笔标记气室范围。

(3)制造人工气室：用钻在气囊上制作一个窗口(0.3-0.4cm

(4)加药：在CAM上面放一个直径为5毫米的明胶海绵，分别加入0.1mL浓度为100μg/mL的AF、AF@AuNCs、AuNCs和100μL PBS(对照组)。

(5)封闭人工气室：用密封膜封闭钻孔窗，形成人工气室。

(6)鸡蛋继续孵化72小时。

(7)观测：用体视显微镜观察明胶海绵周围新生血管区并拍照。

(8)数据分析：ImageJ软件分析每个视野下的血管面积与总面积之比。

AuNCs的制备方法同试验例2中“一、管腔形成试验”。

2、试验结果

本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成结果如图6所示。AF@AuNCs的抗血管生成作用通过经典CAM实验进行验证。如图6A所示，与对照组相比，AF、AF@AuNCs和AuNCs处理组的分支血管数量明显减少。重要的是，AF@AuNCs比纯AF和AuNCs在受精卵中更明显地抑制血管生成。同时，血管生成区域的定量分析(图6B)与体视显微镜捕获的图像吻合，说明AF@AuNCs在体内比AF和AuNCs具有更强的抗血管生成活性，发挥了协同增效作用。

试验例4、本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇的光动力效果

1、试验方法

采用CCK8检测光照条件下不同浓度的实施例1制备得到的AF@AuNCs相较于AuNCs的光动力效果，具体试验方法如下：

(1)种板：将消化下来的CAL-27细胞悬液浓度调整到1.0×10

(2)饥饿细胞：在细胞种板前，将细胞饥饿处理12小时。

(3)加药：在孔板中分别加入25μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL的AF、AF@AuNCs或AuNCs。将孔板放入培养箱中培养12小时。不加药物组合物对照组。

(4)光照：用激发波长为360纳米LED灯，光照需要光照的96孔板。0.1w、10分钟。孵育24小时。

(5)CCK-8显色：PBS洗涤细胞一次，再用CCK-8溶液与活细胞反应1小时。此时对照组的颜色变为中等亮度的橙色。

(6)检测：取出96孔板，读取各孔在酶标仪上显示出来的450纳米处吸光度值。

(7)毒性计算：细胞存活率越高说明细胞毒性越小。存活率(％)＝(加药-空白)/(对照-空白))×100％。评价CAL-27的细胞活性。

采用AO/PI染色检测活死细胞的情况，具体试验方法如下：

(1)种板：将消化下来的CAL-27细胞悬液浓度调整到5.0×10

(2)饥饿细胞：在细胞种板前，将细胞饥饿处理12小时。

(3)加药：在孔板中分别加入100μg/mL的AF@AuNCs或AuNCs。将孔板放入培养箱中培养12小时。不加药物组合物对照组。

(4)光照：用激发波长为360纳米LED灯，光照需要光照的96孔板。0.1w,10分钟。孵育24小时。

(5)AO/PI染色：弃去培养基，PBS洗涤细胞1次，再用AO/PI染液(AO为670μmol/L，PI为750μmol/L)与细胞避光反应20分钟。

(6)PBS洗涤细胞3次，在倒置荧光显微镜下观察。

AuNCs的制备方法同试验例2中“一、管腔形成试验”。

2、试验结果

图7结果：三种材料(AF、AF@AuNCs、AuNCs)在不同浓度及非光照条件下，没有细胞活性的降低，说明三种材料均没有细胞毒性。在光照条件下，相比于AF组及AuNCs组，AF@AuNCs组具有更低的细胞活性，说明AF@AuNCs在光照条件下杀伤了更多的CAL-27细胞。尤其是在25μg/mL及100μg/mL时，细胞活性最低，说明光动力效果最好。试验结果说明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇与单独使用Anti-FLT1多肽或传统金团簇(AuNCs)相比，光动力效果得到了显著提高，具有协同增效作用。

图8结果：染料AO可穿透膜，将细胞的DNA和RNA染成绿色荧光。而PI仅对死亡/正在凋亡的进行染色，染为红色。图8可见AF@AuNCs组在100μg/mL，光照条件下，较AuNCs组有更多的红色荧光说明该组凋亡和死亡的细胞数更多，光动力效果更强。

上述试验结果说明：光照条件下与未介导合成金团簇(AuNCs)相比，本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇增强了光动力效果，发挥了协同增效作用。

由上述试验例的试验结果可知利用Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇，其抗血管生成活性得到显著提高，同时光动力治疗(PDT)效果得到了显著提高，与单独使用Anti-FLT1多肽或未利用Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇相比，本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇取得了协同增效作用。

综上，本发明采用简单的一锅法合成了Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇，该金团簇具有优良的抗血管生成作用和优良的光动力治疗效果；与单独使用Anti-FLT1多肽或未利用Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇相比，本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇取得了协同增效作用。本发明Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇克服了现有技术中金团簇抗血管生成和光动力治疗效果不佳的缺陷，具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种Anti-FLT1多肽介导合成的金团簇及其制备方法和用途

<130> GYKH1118-2020P0112147CC

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Gly Asn Gln Trp Phe Ile

1 5