使用SIS3纳米药物治疗癌症

摘要

本发明发现含有SIS3的无细胞纳米药物在癌症治疗中具有出人意料的效果。因此，本申请提供了通过施用SIS3纳米药物治疗癌症的方法。还提供了用于通过施用SIS3纳米药物治疗癌症的组合物和试剂盒。

说明书

发明背景

癌症是可能影响身体任何部位的一大组疾病的通称。癌症的一个最典型特征是超过它们的通常边界生长的异常细胞的快速增殖。然后，癌细胞可以侵入身体的相邻部位，并在被称为转移的过程中扩散到其它器官。转移是癌症死亡的主要原因，并且也可以由癌症周围的细胞(被称为癌症基质细胞)或癌症微环境促进。

根据世界卫生组织(the World Health Organization，WHO)的统计，癌症是世界范围内死亡的主要原因，在2008年有760万人死亡(约占所有死亡的13％)。肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌每年引起最多的癌症死亡。尽管在生物医学科学方面进行了大量研究工作并取得了技术进步，但预计全世界范围内因癌症死亡的人数将继续上升，到2030年估计有1310万人死亡。

由于癌症的流行及其对人类的重大影响，迫切需要开发新的和更有效的癌症治疗策略。本发明通过使用含有SIS3(Smad3抑制剂)的活性成分的无细胞纳米药物，通过抑制癌细胞的生长来治疗癌症，从而提供了一种新的抗癌治疗方法，解决了这一需求和其他相关的需求。

本申请发明人团队的最近研究表明Smad3(TGF-β信号传导的关键下游中介体)在一些侵袭性癌症模型(如肺癌和黑色素瘤)中直接参与了癌症的生长、侵袭、转移和死亡。这些发现表明Smad3在癌症微环境中以及因此在癌症进展过程中的重要作用。更重要的是，这些发现表明Smad3在抗癌治疗中是有效的靶点。在发明人团队进行的早期研究中，通过敲除Smad3或通过施用Smad3抑制剂SIS3测试了这种新的治疗策略。参见例如US2016/0279123。

由于在实验动物中观察到用SIS3进行治疗以抑制癌症的生长、侵袭和转移，以及减少癌症相关死亡，因此SIS3现在被认为是通过靶向TGF-β/Smad3信号传导通路的新型抗癌药物。本发明在各种治疗应用中提供了以自携式纳米药物(SCND)形式有效施用SIS3的进一步改进。

发明简述

本发明涉及使用包含SIS3的纳米粒子抑制细胞增殖的方法和组合物。因此，在第一方面，本发明提供了含有SIS3的纳米粒子，其是通过以下方法产生的：将包含SIS3和溶剂的溶液施加到冰模板上，然后从冰模板中除去溶剂以产生含有SIS3的纳米粒子。在一些实施方案中，所述纳米粒子通过包括以下步骤的方法产生：(1)将包含SIS3和溶剂的溶液施加至(a)冷冻固态形式的水；(b)在冻结温度下呈液态形式的水；或(c)(a)和(b)的混合物形式的水，和(2)从所述水中除去所述溶剂，从而回收所述纳米粒子。在一些实施方案中，所述水是去离子水。在一些实施方案中，所述水是0℃下冰和液态水的混合物。在一些实施方案中，所述溶剂是四氢呋喃(THF)。在一些实施方案中，所述溶液基本上由SIS3和溶剂(如THF)组成。

在第二方面，本发明提供了抑制细胞增殖的方法。所述方法包括使所述细胞与有效量的包含SIS3的纳米粒子接触的步骤。在一些实施方案中，所述细胞在人体内。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞在人体内。在一些实施方案中，所述癌细胞是肺癌(小细胞肺癌或非小细胞肺癌)细胞、肝癌细胞或黑色素瘤细胞。在一些实施方案中，所述纳米粒子具有约50-100nm或约50nm或约60nm的流体动力学直径和约0.1-0.5或约0.2-0.3的多分散性指数(PDI)。在一些实施方案中，所述纳米粒子具有约65nm的流体动力学直径和约0.25的PDI。在一些实施方案中，所述接触步骤包括皮下、肌内、静脉内、腹膜内或口服施用。在一些实施方案中，所述接触步骤包括皮下、肌内、静脉内、腹膜内或口服施用所述纳米粒子。在一些实施方案中，以溶液、乳液、粉末或气溶胶化喷雾剂的形式施用所述纳米粒子。在一些实施方案中，所述纳米粒子通过包括以下步骤的方法产生：(1)将包含SIS3和溶剂的溶液施加至(a)冷冻固态形式的水；(b)在冻结温度下呈液态形式的水；或(c)(a)和(b)的混合物形式的水，和(2)从所述水中除去所述溶剂，从而回收所述纳米粒子。在一些实施方案中，所述水是去离子水。在一些实施方案中，所述水是0℃下的冰和液态水的混合物。在一些实施方案中，所述溶剂是四氢呋喃(THF)。在一些实施方案中，所述溶液基本上由SIS3和溶剂(如THF)组成。

在第三方面，本发明提供了用于抑制细胞增殖的试剂盒，其包括第一容器，所述第一容器包含有效量的含有SIS3的纳米粒子。在一些实施方案中，所述细胞在人体内。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞在人体内。在一些实施方案中，所述癌细胞是肺癌(小细胞肺癌或非小细胞肺癌)细胞、肝癌细胞或黑色素瘤细胞。在一些实施方案中，所述纳米粒子具有约50-100nm或约50nm或约60nm的流体动力学直径和约0.1-0.5或约0.2-0.3的多分散性指数(PDI)。在一些实施方案中，所述纳米粒子具有约65nm的流体动力学直径和约0.25的PDI。在一些实施方案中，所述SIS3纳米粒子被配制用于皮下、肌内、静脉内、腹膜内、局部或口服施用。在一些实施方案中，所述纳米粒子是溶液、乳液、粉末或气溶胶化喷雾剂的形式。在一些实施方案中，所述纳米粒子通过包括以下步骤的方法产生：(1)将包含SIS3和溶剂的溶液施加至(a)冷冻固态形式的水；(b)在冻结温度下呈液态形式的水；或(c)(a)和(b)的混合物形式的水，和(2)从所述水中除去所述溶剂，从而回收所述纳米粒子。在一些实施方案中，所述水是去离子水。在一些实施方案中，所述水是0℃下的冰和液态水的混合物。在一些实施方案中，所述溶剂是四氢呋喃(THF)。在一些实施方案中，所述溶液基本上由SIS3和溶剂(如THF)组成。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括含有第二抗癌药物的第二容器。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括用于施用所述纳米粒子的说明书。

附图简述

图1.实施SCND-SIS3并优化其产生。(A)不同浓度的游离SIS3的吸收光谱。(B)作为SIS3浓度的函数的SIS3分子(来自DMSO和水(v/v＝1:1)的混合物)在293nm处的吸光度。

图2.SCND-SIS3的表征。通过(A)SEM图像和(B)TEM图像、(C)动态光散射(DLS)和多分散性指数(PDI)、(D)ζ电位来验证SCND-SIS3的特性。

图3.SCND-SIS3在水中展示出比游离SIS3增强的水溶性。通过丁达尔效应(Tyndall effect)证实了在相同浓度下(A)在水中的SCND-SIS3，(B)在DMSO中的SCND-SIS3，(C)在水中的游离SIS3和(D)在DMSO中的游离SIS3的溶解度。用圆圈突出显示了水中未溶解的游离SIS3沉淀。

图4.在HepG2细胞中，与游离SIS3相比，SCND-SIS3的内吞作用增强。(A)在处理后24小时，通过共聚焦显微镜在HepG2细胞中观察到游离SIS3和SCND-SIS3的细胞质定位。(B)每个柱代表三个独立实验的组的平均值±SEM，与游离SIS3相比，***代表p<0.001。

图5.与游离SIS3相比，SCND-SIS3增强了对癌细胞的细胞毒性。在处理24小时后，对(A)LLC细胞、(B)A375细胞和(C)HepG2细胞进行MTT测定，在处理48小时后对(D)LLC细胞、(E)A375细胞和(F)HepG2细胞进行MTT测定。每个柱代表三个独立实验的组的平均值±SEM；与游离SIS3相比，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

图6.SCND-SIS3通过诱导细胞凋亡和抑制增殖而进一步抑制癌细胞的代谢活性。(A)在处理24小时后进行细胞凋亡分析，膜联蛋白V

图7.与游离SIS3相比，SCND-SIS3显示出对Smad3转录活性的有效抑制。在处理24小时后，对(A)LLC细胞、(B)A375细胞和(C)HepG2细胞进行Smad3转录活性荧光素酶报告测定。每个柱代表三个独立实验的组的平均值±SEM；与游离SIS3相比，*代表p<0.05。

图8.SCND-SIS3对A375和HepG2异种移植肿瘤进展均产生更好的抑制作用。(A)A375肿瘤体积，(B)A375肿瘤重量，(C)HepG2肿瘤体积，(D)HepG2肿瘤重量。每个柱代表4至6只小鼠的组的平均值±SEM；与对照相比，*代表p<0.05，***代表p<0.001；如图所示的，相对于0.5μg/g体重的游离SIS3，#代表p<0.05,##代表p<0.01,###代表p<0.001，$$代表p<0.01,$$$代表p<0.001。

图9.SCND-SIS3对同基因Luc-LLC小鼠模型中肿瘤生长的治疗作用加倍。(A-B)小鼠的肿瘤大小，(C)肿瘤重量和(D)肿瘤体积。与游离SIS3相比，用SCND-SIS3而不是游离SIS3，在0.5g/g剂量下的治疗减少了2.5倍的肿瘤重量和体积，这只能通过将游离SIS3增加至2.5g/g/天(增加5倍)来实现。每个柱代表6至8只小鼠的组的平均值±SEM；与对照相比，**代表p<0.01，***代表p<0.001；如图所示的，##代表p<0.01,###代表p<0.001。

图10.如通过生物发光报告系统所确定的，SCND-SIS3对同基因Luc-LLC小鼠模型中的肿瘤生长的治疗作用加倍。治疗6天后负载Luc-LLC的小鼠的生物发光成像的(A)代表性结果和(B)定量结果。治疗18天后负载Luc-LLC的小鼠的生物发光成像的(C)代表性结果和(D)定量结果。与游离SIS3相比，用SCND-SIS3而不是游离SIS3，在0.5g/g剂量下的治疗减少了2.5倍的肿瘤大小，这只能通过将游离SIS3增加到2.5g/g(增加5倍)来实现。每个柱代表6至8只小鼠的组的平均值±SEM；与对照相比，***代表p<0.001；如图所示的，###代表p<0.001。

图11.游离SIS3和SCND-SIS3对负载LLC的小鼠均不能诱导严重的毒性。在治疗18天后用来自负载LLC的小鼠的血清和外周血测量的(A)血清肌酐、(B)血清AST、(C)血清ALT、(D)血清MPO、(E)血清肌钙蛋白-1和(F)白血细胞计数。每个柱代表6至8只小鼠的组的平均值±SEM；如图所示的，与对照相比，ns表示无显著性。

图12.SCND-SIS3在LLC肿瘤微环境中大大增加了产生IFN-γ的NK细胞。(A)NK1.1：绿色；IFN-γ：红色；DAPI：蓝色。(B)与游离SIS3相比，用SCND-SIS3而不是游离SIS3在0.5g/g剂量下的治疗增加了2.5倍的产生IFN-γ的NK细胞，这只能通过将游离SIS3增加至2.5g/g的剂量(增加5倍)来实现。每个柱代表三至四只小鼠的组的平均值±SEM。比例尺：50mm。与对照相比，***代表p<0.001；如图所示的，###代表p<0.001。

图13.SCND-SIS3在LLC肿瘤微环境中显著增加了产生颗粒酶B的NK细胞。(A)NK1.1：绿色；颗粒酶B：红色；DAPI：蓝色。(B)与游离SIS3相比，用SCND-SIS3而不是游离SIS3在0.5μg/g/天剂量下的治疗显著增加了NK细胞的颗粒酶B的产生，其在2.5g/g/天的剂量进一步增加(与游离SIS3相比增加2.5倍)。每个柱代表三至四只小鼠的组的平均值±SEM。比例尺：50mm。与对照相比，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；如图所示的，###代表p<0.001。

图14.SCND-SIS3促进LLC肿瘤微环境中CD8 T细胞的积聚。(A)CD8：红色；DAPI：蓝色。(B)每个柱代表三至四只小鼠的组的平均值±SEM。比例尺：50mm。与对照相比，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；如图所示的，#代表p<0.05，##代表p<0.01，###代表p<0.001。

图15.SCND-SIS3抑制LLC肿瘤微环境中的血管生成。(A)CD31：绿色；DAPI：蓝色。(B)每个柱代表三至四只小鼠的组的平均值±SEM。比例尺：50mm。与对照相比，*代表p<0.05，***代表p<0.001；如图所示的，#代表p<0.05。

图16.SCND-SIS3抑制LLC荷瘤小鼠的血管生成和MMP。蛋白质印迹证明(A)，与游离SIS3相比，SCND-SIS3进一步抑制CD31(B)、MMP9(C)、MMP2(D)和磷酸化Smad3(E)的表达。每个柱代表三至四只小鼠的组的平均值±SEM。与对照相比，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；与游离SIS30.5相比，#代表p<0.05,##代表p<0.01。

图17.SCND-SIS3治疗上调细胞凋亡半胱天冬酶通路。(A)切割的半胱天冬酶3(c-半胱天冬酶3)的蛋白质印迹。(B)c-半胱天冬酶3的蛋白质水平。(C)半胱天冬酶8和(D)半胱天冬酶9的mRNA水平。

图18.具有来自药物处理的BM-NK细胞的上清液的PCR阵列。(A)PCR阵列的聚类图和热图。(B)四组中具有最高倍数变化的基因的表达水平。(C)TGF-β组相对于对照组的散点图，(D)TGF-β+游离-SIS3组相对于TGF-β组的散点图，(E)TGF-β+SCND-SIS3组相对于TGF-β+游离-SIS3组的散点图。对照组，第1、2和3组分别代表用药物溶剂、TGF-β、TGF-β+游离SIS3和TGF-β+SCND-SIS3处理的BM-NK细胞。

图19.具有来自药物处理的BM-NK细胞的上清液的细胞因子阵列。(A)细胞因子阵列结果。(B)在BM-NK上清液中检测到6种细胞因子的水平，在4组中具有最高倍数变化。

图20.BM-NK细胞的RNA测序结果。(A)TGF-β组与对照组之间的DEG的MA图，(B)TGF-β+SIS3处理组与TGF-β处理组之间的DEG的MA图。(C)TGF-β组和对照组的KEGG通路富集，(D)TGF-β+SIS3处理组和TGF-β处理组的KEGG通路富集。(E)维恩图。(F)TGF-β组与对照组之间的预测反应网络，(G)TGF-β处理组+SIS3与TGF-β处理组之间的预测反应网络。

定义

如本文所用的术语“抑制(inhibiting/inhibition)”是指对靶生物过程(如细胞信号转导、细胞增殖、致瘤性和转移潜能)的任何可检测的负效应。通常，与对照相比，抑制反映为靶过程(例如，Smad3介导的信号传导或癌症增殖)，或上述下游参数中的任一个的至少10％、20％、30％、40％或50％的降低。

术语“自携式纳米药物”或“SCND”是指在纳米粒子中捕获的的药物或治疗活性剂(例如SIS3)，如通过动态光散射所确定的，所述纳米粒子通常为平均直径不大于1000nm的球形。如通过动态光散射所确定的，适用于本发明的纳米粒子的平均直径通常不大于500nm(例如在约250至约500nm的范围内)，或小于约100nm(例如在约50至约100nm或约50至约70nm的范围内，例如约50nm、约60nm或约65nm)。

如本文所用的术语“多分散性指数”或“PDI”是指颗粒(特别是纳米粒子)群的尺寸分布。可以通过多种技术确定多分散性指数，包括动态光散射(DLS)、准弹性光散射(QELS)和电子显微镜。多分散性指数(PDI)通常计算如下：

即，(标准偏差/平均直径)的平方。适用于本发明的SCND通常具有不大于约0.5(如在约0.2至约0.4，例如约0.2或约0.25的范围内)的PDI。

如本文所用的术语“ζ电位”是指胶态分散体中的电动电位。它用希腊字母“ζ”表示。通常，ζ电位是分散介质和附着在分散颗粒上的流体的稳定层之间的电位差。ζ电位的量级表示分散体中相邻的，类似带电的粒子之间的静电排斥程度。ζ电位经常被用作胶态分散体稳定性的指标。在一些情况下，高ζ电位可能表明稳定性(即，溶液或分散体将抵抗聚集)。然而，当ζ电位小时，吸引力可能超过该排斥力，并且分散体可能破裂并絮凝。因此，具有高ζ电位(负或正)的胶体通常是电稳定的，而具有低ζ电位的胶体倾向于凝结或絮凝。在一些实施方案中，本文所公开的纳米粒子包含具有高ζ电位(例如，从+/-30mV至大于60mV)的稳定胶体。本发明的SCND通常具有约-30至约-10mV(例如约-20mV)的负电荷。

如本文所用的术语“载药量”是指在将治疗剂掺入颗粒的过程中被捕获在颗粒(例如，纳米粒子)中的药物的百分比。载药量可以表示为：

用于检测载药量的传统方法包括UV、质谱分析法、荧光检测，蛋白质含量(Bradford方法)、反射指数、ELISA等方法。

本文所用的术语“有效量”是指产生施用物质的治疗效果的量。效果包括预防、纠正或抑制疾病/病况的症状和相关并发症进展至任何可检测的程度。确切的量将取决于治疗剂的性质、施用方式和治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd，The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；和Pickar，DosageCalculations(1999))。

如本文所用的术语“SIS3”是指TGF-β1依赖性Smad3磷酸化和Smad3介导的细胞信号传导的细胞可渗透的选择性抑制剂。它是分子量为453.5，化学名称为(6,7-二甲氧基-2-((2E)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基-丙-2-烯酰基))-1,2,3,4-四氢异喹啉)((6,7-Dimethoxy-2-((2E)-3-(1-methyl-2-phenyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyri din-3-yl-prop-2-enoyl))-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline))，并且具有如下所示的化学结构的化学品：

SIS3可以根据2-(N-甲基吲哚基)丙烯酸的公开方法将吲哚衍生物与相应的胺缩合来合成。参见，例如，Jinnin等人，2006，Mol.Pharmacol.，69:597。SIS3也可以从各种供应商(如Santa Cruz、Sigma和Millipore)商购获得，仅用于基本的生物学研究目的。

如本文所用的术语“约”限定了包括参考值的加减10％的范围。例如，“约10”限定了10+/-1的范围，即9-11。

术语“基本上由两种或更多种列举的组分组成”描述了一种组合物，其包含这些被明确指定的成分，而不包含影响或改变被包括在组合物中的指定成分的活性的任何其他成分。其它的惰性成分可以存在于“基本上由活性成分组成”的组合物中，只要惰性成分的存在不会将指定的活性成分的活性或效果改变到可测量的程度即可。

发明详述

I.引言

癌症仍然是人类死亡的主要原因之一。然而，用细胞毒性药物进行的癌症治疗常常是无效的，并且呈现出高细胞毒性和严重的全身性副作用。越来越多的证据表明转化生长因子-β(TGF-β)在已确立的癌症中作为有效的肿瘤启动子。癌症来源的TGF-β通过组成型诱导上皮细胞向间充质细胞转化和肿瘤相关的血管生成以及通过抑制癌症微环境中的抗肿瘤免疫来驱动恶性进展。基于该信息，已经由研究者和制药公司开发了通过使用可溶性TGF-β受体II(小分子ALK5激酶抑制剂)以及中和抗体靶向TGF-β受体的许多治疗方法。它们中的一些已经在早期的临床前研究显示出希望，包括SD-093、SD-208和SM16。然而，TGF-β是基本的抗炎性细胞因子，并且由于可能引起自身免疫性疾病，因此在TGF-β受体水平上对TGF-β的全面阻断也是有问题的。因此，对TGF-β信号传导的下游进行研究以鉴定与癌症进展相关的更具体的治疗靶标可能在临床上提供更好的抗癌治疗。

本申请发明人团队的最近研究的新发现揭示，Smad3(TGF-β信号传导的关键下游中介体)直接参与癌症(尤其是肺癌症和黑色素瘤模型)的生长、侵袭、转移和死亡。这一发现使得靶向Smad3的新抗癌治疗策略的发展。因此，SIS3(一种Smad3抑制剂)现已被制成纳米粒子用于癌症治疗。令人非常惊讶的是，本申请的发明人观察到，含有SIS3的纳米粒子实现了意想不到的高水平的抗癌治疗功效。

II.纳米粒子的制备

用于产生纳米粒子的各种技术是已知的。例如，可以合成纳米粒子，例如，通过在溶液中进行逐步成核(如通过胶体反应)或通过各种物理和化学气相沉积过程(如溅射沉积)来产生纳米粒子。参见，例如，HaVashi,Vac.Sci.Technol.A5(4):1375-84(1987)；Hayashi,Physics Today,44-60(1987)；美国专利申请公开第2003/0147966号。如美国专利申请公开第2003/0147966号中所进一步描述的，使用本领域已知的方法，可替代地使用HAuCl

在一些情况下，纳米粒子是金属的，例如，纳米粒子包括胶态金属。用于纳米粒子的合适的材料可以包括金属(例如但不限于金属银、金、铁、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍、或适于形成纳米粒子的任何其它金属)、半导体(包括例如但不限于CdSe、CdS、以及包被有ZnS的CdS或CdSe)和磁性(例如铁磁铁矿)胶体材料。

或者纳米粒子可以是非金属的，如脂质体(例如，美国专利申请公开第20130028962号)、白蛋白纳米粒子(例如，美国专利申请公开第20140186447号)、壳聚糖和衍生物纳米粒子(例如，美国专利第7,740,883号)和树枝状聚合物。

在一些情况下，纳米粒子可以是聚合物纳米粒子。在纳米粒子领域，各种聚合物是众所周知的，如聚乙二醇(PEG)、普郎尼克类(Pluronics)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)和聚乳酸(PLA)。可以使用任何合适的聚合物来制备适用于本发明的纳米粒子。例如，纳米粒子可以包含多个聚合物嵌段(如二嵌段共聚物)。在一些实施例中，二嵌段共聚物包含可以被用于制备纳米粒子的(i)第一嵌段的疏水性聚合物和(ii)第二嵌段的亲水性聚合物。

在一个实例中，聚合物纳米粒子包含聚(乙二醇)嵌段纳米粒子。在另一个实例中，聚合物纳米粒子包含聚(ε-己内酯)纳米粒子。在另一个实例中，聚合物纳米粒子包含聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-己内酯)(PEG-b-PCL)纳米粒子。

聚合物嵌段的长度可以根据所提出的应用而变化。示例性的聚合物嵌段包括聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)或聚环氧乙烷(PEO)、聚己内酯(PCL)、甲氧基聚乙二醇(MPEG)、聚D、L-乙交酯(PLG)、聚氰基丙烯酸酯(PCA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯(PBD)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸(MAA)、d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、PEG-PLA、PEG-PLLLA、PEG-PDLLA、PEG-PDDLA、mPEG-PLA、mPEG-PLLLA、mPEG-PDLLA、mPEG-PDDLA、PEG-PCL、PEG-PLGA、PEG-PCL、mPEG-PCL、PEG-DPSE、mPEG-DPSE、PEO-PBD、mPEO-PBD、普朗尼克类(PEO-PPO-PEO)、PLGA-PEG-PLGA、PEG-PLGA-PEG、PEG-PCL-PEG、PCL-PEG-PCL、维生素E-TPGS、Solutol HS15和Soluplus，或它们的组合。

III.SCND SIS3的制备

本发明提供了通过使用固态形式、在冰点下呈液态形式的冷冻材料或它们的混合物制备包含SIS3的纳米粒子的方法。该方法的描述可以在美国专利第10,085,942号中找到。该方法包括两个步骤：第一步(施加步骤)，将含有SIS3和溶剂的溶液施加到冷冻材料(例如，冰水混合物)上或其中；和第二步(溶剂除去步骤)，从冷冻材料中除去溶剂以产生含有SIS3的纳米粒子(称为自包含纳米药物(SCND)-SIS3)。

通常，SCND-SIS3是纳米粒子的集合，所述纳米粒子的平均直径小于1000nm：例如，所述纳米粒子的平均直径小于约500nm，或小于约100nm，例如，在约20nm至约100nm的范围内，或在约40nm至约70nm的范围内，或在约50nm至约70nm的范围内，或约50nm或约65nm。可以通过本领域普通技术人员熟知和熟悉的方法确定平均直径，例如，可以使用动态光散射(DLS)仪器(Malvern Nano Zetasizer)在水性溶液中测量平均直径。DLS可以被用于通过测量由扩散粒子产生的散射光强度的波动来确定溶液中的小颗粒的粒径分布图谱。

以固态形式存在的冷冻材料在美国专利第10,085,942号中也被称为“冰模板”，而当以液态形式或液态-固态混合形式存在时，其可以被称为“冰浴”。它可以是任何合适的大小或尺寸，并且适于为含有SIS3和溶剂的溶液提供至少一个表面，以将其施加到冷冻材料上或之中。

在一些情况下，冷冻材料包括冷冻水或处于冰点的液态水或它们的混合物(例如，冷冻去离子水或由去离子水制成的冰浴)。例如，冷冻材料可以是基本上由冷冻水(例如，冷冻去离子水)组成的冰模板/冰浴，不包括冰模板/冰浴中的任何相关和不期望的杂质。在一个实施方案中，通过在低于0℃的温度下(优选在约-250℃至约0℃的温度下)冷冻包含水(优选去离子水)的水性溶液并且更优选由水(优选去离子水)组成的水性溶液，特别是通过在冷冻箱中或在液氮中在约-20℃下冷冻水性溶液来制备冰模板/冰浴。因此，本发明的方法优选在施加步骤之前还包括制备步骤，其中通过冷冻包含水(例如去离子水)或基本上由水(例如去离子水)组成的水溶液来产生冰模板/冰浴。

在一个实施方案中，通过使用冰模板或冰浴制备含有SIS3的纳米粒子的方法包括施加步骤(1)，其中将含有SIS3和溶剂的溶液施加至冰模板/冰浴；溶剂除去步骤(2)，其中将溶剂从冰模板/冰浴除去；和释放步骤(3)，其中将纳米粒子从冰模板/冰浴释放。

例如，冰模板可以是基本上由冷冻去离子水组成的冰块，并且溶液由溶解在溶剂(如有机溶剂，例如乙醇或THF)中的SIS3组成。可以将含有SIS3的溶液逐滴滴加到冰模板的表面或滴入冰浴中，所述冰浴包括固态形式的水(冰)和保持在冰点温度(0℃)的液态形式的水。可替代地，可以通过其它方式将溶液施加到冰模板或冰浴上，例如使用喷嘴将溶液喷射到冰模板/冰浴上或使用注射器将溶液注射到冰模板/冰浴上/中。

本发明方法中的溶剂通常是有机溶剂。有机溶剂可以是醇、醚、酯、卤代烷烃、环烷烃或它们的混合物。在一些实施方案中，有机溶剂是醇，优选易挥发的醇。醇可以是乙醇、甲醇、丙醇、丁醇或它们的混合物。在其它实施方案中，有机溶剂可以是四氢呋喃(THF)、丙酮、二氯甲烷、氯仿等。

将含有SIS3和溶剂的溶液施加到冰模板/冰浴中至少一次。在一些情况下，将溶液施加到冰模板/冰浴中两次或两次以上，这取决于所期望的SCND-SIS3的产率，所施加的溶液的体积和溶液中SIS3的浓度。在一个实施方案中，将溶液以约5至约5000μL(例如，约10至约1000μL、约50或100至约500μL、约100至约250μL或约200μL)的体积施加至冰模板/冰浴中至少一次。

所施加的包含SIS3和溶剂的溶液的体积可以根据所选择的过程条件而变化。在一些实施方案中，溶液含有约0.1mg/mL至约50mg/mL，或约0.2mg/mL至约10mg/mL，或约0.5mg/mL至约5mg/mL，或约1mg/mL的SIS3，较低的浓度允许以较小的尺寸形成纳米粒子。

在施加步骤中将溶液施加到冰模板/冰浴中之后，在溶剂除去步骤中将溶剂从冰模板/冰浴中除去。通过各种可能的方法将溶剂从冰模板/冰浴中除去，例如通过自然蒸发或通过将空气、氮气或氩气吹向冰模板/冰浴。“自然蒸发”通常是指在空气环境下不使用额外的蒸发手段(即通常用于除去溶剂的手段，如改变温度或压力)进行的蒸发过程。例如，通过将冰模板/冰浴暴露于空气而不改变环境条件来除去溶剂。然后自然蒸发溶剂。在其它实施方案中，可以通过在冰模板/冰浴上方吹送空气、氮气或氩气(其是惰性的并且不与SIS3反应)来除去溶剂。在一些实施方案中，溶剂是乙醇或THF，其是易挥发的并且可优选通过使用气体(如普通空气、氮气和氩气)而容易地蒸发。特别地，可以在约0至约30℃的温度下使用气体。溶剂的除去允许SIS3形成固体纳米粒子并且在冰模板/冰浴内扩散。

产生SCND-SIS3的方法还可以包括在溶剂除去步骤之后的释放步骤，使得纳米粒子从冰模板/冰浴中被释放。可以通过融化冰模板/冰浴以形成包含纳米粒子的分散体来实现该释放步骤。因此，在释放步骤中，可以融化冰模板/冰浴以从冰模板/冰浴中释放纳米粒子。例如，可以将冰模板或冰浴融化以形成包含纳米粒子或SCND-SIS3的分散体。任选地，分散体可以经历至少1min或在约5min至约60min的范围内的超声处理，以确保纳米粒子在分散体中均匀分布，考虑到SCND-SIS3在用于治疗或预防应用的药物组合物中的预期用途，这可能是期望的。

可替代地，在释放步骤中通过冰模板/冰浴的蒸发将纳米粒子从冰模板/冰浴中释放出来。例如，可以将基本上由冷冻去离子水、或冷冻水和冰点温度下的液态水的混合物组成的冰模板/冰浴放置在干燥烘箱中进行蒸发。

在一些实施方案中，可以在溶剂除去步骤和释放步骤之间应用另外的冷冻步骤。在该冷冻步骤中，冷冻冰模板/冰浴，例如通过将冰模板储存在0℃(如在约-250℃至约0℃的温度)下，特别是通过将冰模板/冰浴储存在约-20℃(例如在冷冻箱中)至少0.5小时的时间或通过使用液氮储存。在一些情况下，可以将冰模板/冰浴在冷冻箱中储存至少1h并且进一步储存约1h至约48h。在一个实施方案中，可以将冰模板/冰浴在储存于0℃以下的冷冻箱中之前首先使用液氮冷冻。另外应用所述冷冻步骤可能是有利的，因为它允许另外的老化过程，所述另外的老化过程适于进一步稳定在冰模板/冰浴上或冰模板/冰浴中形成的纳米粒子。此外，如果存在多于一个的施加步骤和溶剂除去步骤，则可以在每次从冰模板/冰浴中除去溶剂之后进行冷冻步骤。

如通过共聚焦显微镜所观察到的，从上述方法获得的SCND-SIS3显示出优异的水分散性和生物利用度，以及良好的细胞摄取能力。此外，SCND-SIS3在癌症治疗中也展现出令人惊奇的高水平的治疗功效，同时展现出较少的副作用。

IV.药物组合物和施用

本发明还提供了包含有效量的SCND-SIS3的药物组合物或生理学组合物，并因此在预防性和治疗性应用中抑制癌症发展。此类药物组合物或生理学组合物还包括一种或多种药学上或生理学上可接受的赋形剂或载体。本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本发明的合适制剂可见于Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,费城，PA，第17版(1985)。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。

本发明的药物组合物可以通过各种途径来施用，例如口服、皮下、透皮、鼻内、肌内、静脉内、肠胃外、鞘内、器官实质内、脑室内、经口、颅内或腹膜内施用。优选的施用药物组合物的途径是，对于70kg的成年人，以每天约0.01-2500mg(优选2.5-500mg或5-250mg或10-100mg)的SCND-SIS3的日剂量局部递送至患有由TGF-β/Smad3介导的信号传导加重的病况的器官或组织(例如瘤内注射至肿瘤)。合适的剂量可以以单一日剂量或以以合适的间隔提供的分开的剂量(例如以每天两个、三个、四个或更多个亚剂量)施用。

为了制备含有SCND-SIS3的药物组合物，使用惰性和药学上可接受的载体。药物载体可以是固体或液体，这取决于待施用的SCND的形式。优选地，可以例如通过注射或通过吸入(当组合物被气溶胶化时)来使用液体组合物(如溶液或乳液)。类似地，也可以例如通过吸入(当组合物被气溶胶化时)使用干燥的组合物(如包含SCND的粉末)。

液体药物组合物包括，例如，适于口服或肠胃外施用的溶液、混悬剂和适于口服施用的乳液。活性组分(例如，SIS3)的无菌水溶液或在含有活性组分的包含水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适于肠胃外施用药的液体组合物的实例。所述组合物可以含有近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去污剂等。

无菌溶液可以通过将活性组分(例如，SIS3)溶解在所期望的溶剂系统中，然后使所得溶液通过膜滤器以将其灭菌来制备，或者可替代地，通过在无菌条件下将无菌化合物溶解在先前灭菌的溶剂中来制备。可以将所得水性溶液包装以直接使用或冻干(在施用前将冻干制剂与无菌水性载体组合)。制剂的pH通常为3至11，更优选为5至9，最优选为7至8。

出于治疗目的，可以以足以预防、治愈、逆转或至少部分减缓或阻止病况的症状及其并发症(如某些类型的癌症的发作、进展和转移，直到由癌症引起的死亡)的量施用含有SCND-SIS3的药物组合物，以治疗患有涉及异常尤其是过度TGF-β/Smad3信号传导的疾病或病况(如由TGF-β/Smad3介导的细胞信号传导引起或加重的任何类型的癌症)的患者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效量”。对于这种用途有效的量将取决于疾病或病况的严重程度以及患者的体重和整体情况，但是对于70kg的患者，通常为每天约0.1mg至约2,500mg范围的SCND-SIS3，对于70kg的患者，更通常使用的剂量为每天约2.5mg至约500mg剂量的SCND-SIS3。

在预防性应用中，将含有Smad3抑制剂的药物组合物以足以延迟或预防症状发作的量施用于对疾病或病况敏感、或处于发展疾病或病况的风险中的患者，在所述疾病或病况中，过度的TGF-β/Smad3介导的信号传导是不期望的。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在该用途中，抑制剂的精确量再次取决于患者的健康状态和体重，但是对于70kg的患者，每天通常为约0.1mg至约2,500mg的抑制剂，对于70kg的患者，每天更通常为约2.5mg至约500mg。

可以在由治疗医师选择的剂量水平和模式下进行SCND-SIS3的单次或多次施用。在任何情况下，药物制剂应提供足以有效抑制患者中由Smad3介导的细胞信号传导的量的SCND-SIS3，以便获得治疗上有益的临床结果。

可以使用本发明的SCND-SIS3治疗广谱癌症，尤其是涉及异常或过度TGF-β/Smad3信号传导的那些癌症：它们包括但不限于血细胞癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、膀胱癌、乳腺癌、脑癌(例如神经胶质瘤)、结肠/直肠癌、食道癌、肝癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、肾癌、口腔/口咽癌、皮肤癌(黑色素瘤、鳞状细胞癌)、脾癌、胃癌、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌等。

V.试剂盒

本发明还提供了用于抑制Smad3信号传导并因此用于根据本发明的方法治疗癌症的试剂盒。试剂盒通常包括容器，其包含(1)药物组合物，其具有有效量的新型纳米药物SCND-SIS3(例如通过本文所述的方法产生)，和(2)包含关于如何分配药物组合物的说明的信息材料，其包括可以被治疗的患者的类型(例如，具有过度TGF-β/Smad3信号传导的癌症患者)、施用的方案(例如，剂量和频率)和途径等的描述。任选地，试剂盒中可以包括第二容器。在第二容器中可以包括具有已知抗癌活性或经常与癌症疗法结合使用(例如，抗贫血药物)的另一种治疗剂。

实施例

以下实施例仅以说明的方式而不是以限制的方式提供。本领域技术人员将容易认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本上相同或类似结果。

实施例1

1.SCND-SIS3的构建及其产生的优化

使用较早建立的无载体平台(基于美国专利第10,085,942号中公开的改进方案)成功地将Smad3抑制剂SIS3纳米化，产生了新型纳米药物SCND-SIS3，其展示了超高载药量，自携式以及水溶性特性。如图1A所示的，测量了不同浓度下的SIS3吸收光谱以获得标准吸收曲线。为了确认SCND-SIS3的浓度，使用溶剂二甲亚砜(DMSO)将一定量的SCND-SIS3溶解至分子状态，接着添加等体积的水。然后测量该溶液的吸收光谱以获得吸收强度值。根据图1B中的公式，可以确定SIS3-PEG纳米粒子的浓度，并且可以获得SIS3-PEG纳米粒子内的SIS3的含量。

2.SCND-SIS3的表征和鉴定

如图2A和2B中所示的，通过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)表征和鉴定SCND-SIS3，其显示SCND-SIS3为直径约50nm的单分散纳米球的形式。动态光散射测量(图2C)显示SCND-SIS3的流体动力学直径为65.03nm且多分散性指数(PDI)值为0.224。还测量了SCND-SIS3的ζ电位，显示出约-19.6mV的负电荷(图2D)。因此，在该项目中选择了经验证的SCND-SIS3用于体外和体内测定。

通过使绿色激光束照射通过溶液以清楚地观察丁达尔效应来证实水中SCND-SIS3的存在(图3A)，这也证明了与游离SIS3相比，SCND-SIS3的水溶性增强，如通过游离SIS3在比色皿底部的沉淀来证明(图3C)。在图3B和图3D中也显示了SCND-SIS3和游离SIS3在DMSO中的良好溶解度，其中观察到没有丁达尔效应的清澈且透明的溶液，因为SCND-SIS3在溶解于DMSO中时处于分子状态而不是纳米粒子。因此，很明显，SCND-SIS3在水中的溶解度比游离的SIS3高。

如图4中所示的，在280nm激发下，可以用470nm处的荧光发射光谱目视检测游离SIS3和SCND-SIS3的积聚。荧光显微镜观察发现，在24小时时，SCND-SIS3在癌细胞中的积聚远高于游离的SIS3在癌细胞中的积聚，并且主要位于细胞质中，其中Smad3蛋白将被整合和失活(抑制)。

3.SCND-SIS3体外抗癌功效的验证

如图5中所示的，通过MTT测定进行检测，与游离SIS3相比，SCND-SIS3对LLC(人肺癌细胞)、A375(人黑色素瘤细胞)和HepG2(人肝癌细胞)的代谢活性显示出更好的抑制作用。具体地，与游离SIS3相比，SCND-SIS3在20μM的24小时处理和10μM的48小时处理中均显著抑制LLC细胞的代谢活性。在A375细胞和HepG2细胞上观察到类似的趋势，因为在10μM剂量下对A375细胞进行24小时处理，在20μM剂量下对HepG2细胞进行24小时处理，甚至在5μM剂量下对HepG2细胞进行48小时处理时，SCND-SIS3均显示出优于游离SIS3的优点。

还评估了SCND-SIS3处理对癌细胞凋亡、增殖和Smad3转录活性的影响。与游离SIS3处理相比，SCND-SIS3诱导早期凋亡细胞比例增加3倍(如通过膜联蛋白V

此外，在10μM剂量下，SCND-SIS3对Smad3转录活性的抑制作用优于游离SIS3对癌细胞的抑制作用(图7)，这表明SCND-SIS3的增强的抗癌效应可能归因于对TGF-β/Smad3信号传导的抑制。

4.评估SCND-SIS3对(体内)异种移植黑色素瘤、肝癌和同基因肺癌模型的抗癌功效

将剂量为2×10

根据图8中所示的肿瘤体积和肿瘤重量结果，与相同剂量的游离SIS3相比，SCND-SIS3表现出增强的抑制作用。尤其是在A375黑色素瘤中，与接受2.5μg/g/天游离SIS3治疗的小鼠相比，接受2.5μg/g/天SCND-SIS3治疗的小鼠显示出肿瘤体积的3倍减少，并且在两种异种移植模型中均产生比5μg/g/天的较高剂量的游离SIS3更好的治疗效果。因此，2.5μg/g被用作SCND-SIS3治疗黑色素瘤和肝癌的最佳剂量。

基于对异种移植模型的观察，选择0.5μg/g/天和2.5μg/g/天的剂量用于检查SCND-SIS3在具有荧光素酶标记的C57BL/6j衍生的小鼠侵袭性肺癌细胞系(Luc-LLC)的同基因肺癌模型中的抗癌效果。令人惊奇地，与游离SIS3相比，在0.5μg/g下，用SCND-SIS3而不是游离SIS3治疗，使得对肺癌症生长的抑制作用增加2.5倍，这只能通过2.5μg/g剂量的游离SIS3实现，表明SCNID-SIS3可以比游离SIS3增加5倍的药物活性(图9)。

还通过在治疗后6天和18天用IVIS光谱系统(Caliper,Xenogen)进行活体生物发光成像来检查SCNID-SIS3对肿瘤进展的治疗效果。与体外结果一致，在开始治疗后6天，游离SIS3和SCND-SIS3对肺癌生长均显示出相同的抑制作用(图10A和图10B)。令人惊讶的是，用SCND-SIS3进行18天的更长治疗显示出比游离SIS3治疗更大的抑制作用，其肿瘤大小缩小率增加了2倍以上，同时如通过用0.5μg/g/天的SCND-SIS3治疗所证明的，将使用剂量大大降低至1/5，实现了与剂量为2.5μg/g/天的游离SIS3对肺癌抑制作用类似的抑制作用(图10C和图10D)。

5.确定体内游离SIS3和SCND-SIS3的安全性

考虑到SCND-SIS3治疗的潜在毒性，在治疗18天后，在携带Lewis肺癌(LLC)的小鼠上测量了血清肌酐(肾活性生物测定)、AST和ALT(肝活性生物测定)、MPO(骨髓活性生物测定)、肌钙蛋白-1(心脏活性生物测定)和白血细胞计数。如图11中所示的，在SCND-SIS3或游离SIS3治疗18天后，未观察到显著的肾毒性、肝毒性、心脏毒性或骨髓抑制，这表明用0.5-2.5g/g/天剂量的SCND治疗是安全的，没有可检测的毒性。

6.研究SCND-SIS3在体内和体外增强抗癌作用的分子机制

根据先前报道的发现，在富含TGF-β1的肿瘤微环境中，肿瘤浸润NK细胞的数目显著减少，而IFN-γ和颗粒酶B的产生也被抑制(Tang PM等人，Smad3 promotes cancerprogression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.Nat Commun.，2017年3月6日；8:14677)。在该项目中，发现与游离SIS3处理以及盐水(安慰剂)对照组相比，SCND-SIS3处理大大增强了肿瘤微环境中细胞毒性NK细胞(产生IFN-γ和颗粒酶B的NK细胞)的积聚。如图12中所示的，与对照组相比，2.5μg/g的SCND-SIS3处理诱导产生IFN-γ的NK细胞的积聚增加5倍。同时，与盐水对照组相比，2.5μg/g SCND-SIS3处理在LLC肿瘤微环境中显示产生颗粒酶B的NK细胞增加29倍，并且与2.5μg/g游离SIS3处理相比增加2.5倍(图13)。

除了促进NK细胞的积聚之外，与游离SIS3处理相比，SCND-SIS3疗法还显示出更高的将更多的CD8

同时，由于Smad3对于VEGF的表达是必需的，因此检查SCND-SIS3是否可以通过抑制Smad3依赖性血管生成来抑制癌症进展。如图15中所示的，用0.5μg/g/天的SCND-SIS3处理通过抑制LLC肿瘤微环境中CD31的表达显著抑制血管生成，而通过2.5μg/g/天的较高剂量的SCND-SIS3可进一步增强抑制作用。然而，这种对血管生成的抑制作用仅在用较高剂量的游离SIS3处理(2.5g/g/天)的那些处理中发现。

蛋白质印迹结果还证实，用2.5μg/g剂量的SCND-SIS3处理可以通过阻断TGF-β/Smad3通路来抑制血管生成和肿瘤转移，如通过CD31、MMP9、MMP2以及磷酸化Smad3的表达水平所证明的(图16)。

此外，蛋白质印迹和实时PCR也揭示了用SCND-SIS3处理通过上调细胞凋亡相关半胱天冬酶基因表达(包括切割的半胱天冬酶3，半胱天冬酶8和半胱天冬酶9)的mRNA和蛋白水平大大增强了肿瘤细胞凋亡(图17)。

为了探索SCND-SIS3处理增强细胞毒性NK细胞积聚、激活和功能的潜在机制，对药物处理的骨髓来源的NK细胞(BM-NK)进行PCR阵列检测。如图18中所示的，与单独的TGF-β刺激相比，游离SIS3和SCND-SIS3预处理均大大增强了与NK细胞募集相关的几种趋化因子。游离SIS3和SCND-SIS3预处理还诱导了HIF-1α(其可能增强NK细胞对中央肿瘤区缺氧应答的功能)以及与HIF-1α信号通路密切相关的NOS2和PTGS2的表达。

此外，进行细胞因子阵列检测以证实游离SIS3和SCND-SIS3处理对NK细胞趋化因子和细胞因子表达的调节。通过游离SIS3或SCND-SIS3疗法大大增加了趋化因子(如I-309、RANTES和TARC)的表达，这可能与增强NK细胞积聚有关。重要的是，SCND-SIS3处理大大增加了IL-2的表达，这可能表明在肿瘤微环境中对NK细胞的免疫调节作用(图19)。

如图20B中所示的，TGF-β刺激与对照之间的差异表达基因(DEG)以及SIS3+TGF-β刺激与TGF-β刺激之间的DEG与癌症微环境中的免疫调节以及癌症微环境中的信号转导密切相关。如通过KEGG反应网络所分析的，细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号传导通路、中心碳代谢、微小RNA和HIF-1信号传导(图20)与TGF-β/Smad3通路密切相关。

材料和方法

制备SCND-SIS3并优化其产生

使用充分证明的再沉淀方法对Smad3抑制剂SIS3进行纳米化。在典型的程序中，制备溶解在四氢呋喃(THF)中的1mg/mL的SIS3分子溶液。在剧烈搅拌(例如，在约20-150、约40-120、或约50-100、或约60-90转/min的范围内)下，将200μL所制备的THF溶液快速滴入5mL去离子水中，置于0℃(冰浴)下5min。通过在室温下进一步声处理(例如，以大于约20KHz、约20-50KHz或大于约50KHz的频率)另一个15min以确保THF完全蒸发，来获得SCND-SIS3的分散体。

SCND-SIS3的表征

分别测量溶解在THF中的SIS3和溶解在去离子水中的SCND-SIS3的吸收和荧光光谱。为了确认SCND-SIS3的浓度，使用DMSO将SCND-SIS3溶解至分子状态，接着添加等体积的水。然后通过测量吸收强度值来计算浓度。

通过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)对SCND-SIS3进行了表征和鉴定，其显示了直径约50nm的单分散纳米球形式的SCND-SIS3。通过Malvern Zetasizer NanoZS系统测量了动态光散射测量和ζ电位。

通过使绿色激光束通过溶液照射以清楚地观察到丁达尔效应而没有任何沉淀证实了SCND-SIS3在去离子水中的增强的溶解度，而在相同浓度下在去离子水中的游离SIS3在比色皿的底部形成沉淀而没有丁达尔效应。

MTT(甲基-噻唑二苯基四唑)测定

将包括A375、LLC和HepG2的肿瘤细胞系以1×10

细胞凋亡和细胞周期分析

通过在4℃以3000rpm离心5min收集用游离SIS3或SCND-SIS3处理24小时的LLC细胞，然后用膜联蛋白-V-FLUOS染色试剂盒(Sigma-Aldrich，MO，美国)染色，并立即使用流式细胞仪分析。

对于细胞周期分析，用碘化丙啶(PI)染色用游离SIS3或SCND-SIS3处理24小时的LLC细胞，并立即用流式细胞仪分析。

同基因小鼠肿瘤模型和治疗

通过皮下注射2×10

确定小鼠中潜在的副作用

在肿瘤接种后28天，用从携带LLC的小鼠收集的外周血计数白血细胞的数目。用来自Stanbio Laboratory的肌酐

免疫荧光染色

用5μm PLP固定的冷冻切片进行免疫荧光染色。用于免疫荧光染色的第一抗体包括Alexa488缀合的抗小鼠NK-1.1、Alexa488缀合的抗小鼠CD31(Biolegend,CA,美国)、抗CD8a、抗干扰素γ和抗颗粒酶B(Abcam,MA,美国)，随后是PE或Alexa594缀合的抗兔第二抗体。所有载玻片均用含DAPI的封固剂封固，然后用荧光显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，德国)进行分析。

蛋白质印迹

用冰冷的RIPA缓冲液裂解肿瘤组织，然后进行蛋白质印迹分析，其中用抗CD31、MMP9、β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology,CA,美国)、p-Smad3(Abcam,MA,美国)和MMP2(Millipore,MA,美国)的第一抗体在4℃下孵育过夜，随后与IRDye 800缀合的第二抗体(Rockland immunochemicals，PA，美国)孵育。通过LiCor/Odyssey红外图像系统(LI-CORBiosciences,NE,美国)检测靶蛋白表达并用Image J软件(NIH,Bethesda,MD,美国)进行分析。

统计分析

数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。用GraphPad Prism6.0软件(SanDiego,CA,美国)通过单变量分析的单向方差分析或两个独立变量分析的双向方差分析来分析所有数据，随后进行Tukey的多重比较检验。

出于所有目的，本申请中引用的所有专利、专利申请和其它出版物(包括GenBank登录号)通过引用整体并入本文中。