一株耐盐碱阿根廷假单胞菌及其活菌制剂与应用

摘要

本发明公开了一株耐盐碱阿根廷假单胞菌及其活菌制剂与应用。所述阿根廷假单胞菌(Pseudomonas argentinensis)PAPM‑9已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20182。阿根廷假单胞菌PAPM‑9耐盐碱能力强，具有产NH3、解磷、防治番茄软腐病和促进番茄生长的作用，可用于生产微生物肥料，特别是盐碱地番茄专用生物肥料。

说明书

技术领域

本发明涉及一株耐盐碱阿根廷假单胞菌及其活菌制剂与应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

番茄亦称“番柿”，俗称“西红柿”。茄科，番茄属。一年生或多年生草本，原产南美洲，我国普遍栽培，一般于冬春保护地育苗，春季栽培为主，冬季温室栽培。番茄果实营养丰富，含多种维生素，可作蔬菜或水果，亦可制成罐头等食品。

软腐病一直是制约番茄高产优质栽培的关键因素之一，在全国各地都有发生。它在田间、贮运期以至市场上都能引起番茄腐烂，损失比较严重，产量损失可达35％-55％，储藏损失可达21％左右。软腐病主要由胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜软腐变种(Erwiniacarotovora subsp.Carotovora(Jones)Bergey et al.)引起的，主要侵染茎和果实。茎发病多出现在生长期，近地面茎部先出现水渍状污绿色斑块，继扩大的圆形或不规则形褐斑，斑周显浅色窄晕环，病部微隆起。果实感染病主要在成熟期，初期病斑为圆形褪绿小白点，继变为污褐色斑。随果实着色，成熟度增加及细菌繁殖为害，果皮病斑渐扩展到全果，但外皮仍保持完整，内部果肉腐烂水溶，恶臭，被盛于皮囊中，故称囊腐。

长期以来，番茄软腐病主要通过化学法防治，同时结合选育抗病品种、加强栽培管理等技术来进行预防。化学防治以大量使用噻菌铜、中生菌素、农用链霉素、氯溴异氰尿酸、叶枯唑等化学药物为主，虽然取得了较好的防控效果，但化学农药的过量使用不仅可使病原菌逐步产生抗药性，而且对人类健康、食品安全和环境保护造成巨大的潜在威胁。因此，发展生物防治技术，减量化学农药的使用，是现代农业发展的必然趋势。

生物防治是利用有益生物或其代谢产物来防治病虫害的方法。其特点是不污染环境、对人和其他生物安全、节约能源、保持生态平衡，是发展绿色食品、保护人身健康的重要手段。目前，蜡状芽孢杆菌、哈茨木霉、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、淡紫灰链孢、灰色链霉菌等有益微生物已用于番茄软腐病的生物防治，但由于防治效果有限，未能在农业生产中大面积推广。

盐碱地是我国重要的土地资源，我国盐碱地和盐碱障碍耕地总面积超过5亿亩，其中具有农业利用潜力的多达2亿亩，占中国耕地面积的10％左右。番茄具有一定的耐盐碱能力，是盐碱地广为栽培的蔬菜作物之一。盐碱地番茄软腐病的生物防治，除要求生防菌株具有较好的抗病促生效果外，还要求其具有较强的耐盐碱能力，能够在盐碱土壤中定植。因此，筛选耐盐碱抗病促生菌株，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株耐盐碱阿根廷假单胞菌(Pseudomonas argentinensis)PAPM-9及其活菌制剂与应用。阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株分离自盐碱地番茄根际土壤，耐盐碱能力强，具有产NH

本发明的目的采用如下技术方案实现：一株具有抗病促生作用的耐盐碱阿根廷假单胞菌(Pseudomonas argentinensis)PAPM-9，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.20182，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年07月03日。

所述耐盐碱阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株的菌落及菌体特征：在NA培养基上于37℃培养48h，菌落直径约0.5-0.8mm，黄色半透明，圆形，表面光滑，隆起，湿润，粘稠，有光泽，质地均匀，边缘整齐；菌体呈短杆状，如图1所示。

所述耐盐碱阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株的生理生化特征：革兰氏阴性杆状菌；过氧化氢酶试验阳性，脲酶试验阳性，柠檬酸盐利用试验阳性，丙二酸盐利用试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，淀粉水解试验阴性，V-P试验阴性，硝酸盐还原试验阳性，D-葡萄糖发酵试验阴性，D-甘露醇发酵试验阴性，乳糖发酵试验阴性，麦芽糖发酵试验阴性。

本发明还提供了上述耐盐碱阿根廷假单胞菌PAPM-9在产NH

本发明还公开了一种以阿根廷假单胞菌PAPM-9为主要有效成分的活菌制剂。

所述阿根廷假单胞菌PAPM-9活菌制剂的制备方法：将所述阿根廷假单胞菌进行扩大培养后，以体积比2-5％的接种量转接入发酵培养基中，36-38℃培养24-28h，获得阿根廷假单胞菌PAPM-9发酵液。

所述发酵培养基的配方为：豆粕粉10g、淀粉10g、葡萄糖2g、酵母浸粉1g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、复合酶制剂0.1g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为碱性蛋白酶50％、中性蛋白酶50％。

所述阿根廷假单胞菌PAPM-9发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01-0.03％(w/w)、生化黄腐酸粉1-3％(w/w)、矿源黄腐酸钾1-3％(w/w)、尿素1-2％(w/w)、磷酸氢二钾1-3％(w/w)和卡松0.03-0.08％(w/w)，搅拌均匀，获得活菌制剂。

本发明还提供了上述的活菌制剂在产NH

本发明的有益效果：本发明阿根廷假单胞菌PAPM-9分离自盐碱地土壤，耐盐碱能力较强，且对番茄软腐病病原菌具有较强的抑制作用，对番茄生长具有促进作用，可用于生产生物肥料，特别是盐碱地专用微生物肥料，用于番茄软腐病的生物防治，可减少病害发生，提高番茄产量和质量。

附图说明

图1为阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株的菌体形态；

图2为阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株培养物在加入Nessler’s试剂后的图片；从图中可以看出：产生黄色沉淀；

图3为阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株在有机磷培养基上的解磷圈图片，图中内环为菌落，外环为解磷透明圈。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步说明。

实施例1：阿根廷假单胞菌PAPM-9的筛选

(1)耐盐碱菌株的筛选

阿根廷假单胞菌PAPM-9于2018年6月分离自番茄根际土壤。土壤取样于山东省滨州市滨城区，为中度盐碱土壤。具体分离方法为：土样混匀，称取5g，放入盛有95mL无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于37℃、180rpm振荡30min。取土壤悬液1mL进行10

(2)抑菌圈法筛选番茄软腐病致病菌的拮抗菌株

将200ml LB培养基融化，冷却到45℃左右时，加入5ml的番茄软腐病致病菌的菌悬液，摇匀，倒入培养皿中。在其上点接步骤(1)筛选到的耐盐碱菌株，于37℃恒温培养48h后，观察各菌的生长情况，筛选菌落大、抑菌圈与菌落直径比值大的菌株。共筛选出具有拮抗作用的菌株3株。

综合考虑所筛3株耐盐碱拮抗菌株的生长速度和对番茄软腐病病原菌的拮抗能力，选取一株作为生产菌株，编号为PAPM-9。

实施例2阿根廷假单胞菌PAPM-9的鉴定

(1)形态与生理生化特征

所述PAPM-9菌株的形态特征为：在NA培养基上于37℃培养48h，菌落直径约0.5-0.8mm，黄色半透明，圆形，表面光滑，隆起，湿润，粘稠，有光泽，质地均匀，边缘整齐；菌体呈短杆状，如图1所示。所述NA培养基即营养琼脂培养基，其配方为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.0。

所述PAPM-9菌株的生理生化特征为：革兰氏阴性杆状菌；过氧化氢酶试验阳性，脲酶试验阳性，柠檬酸盐利用试验阳性，丙二酸盐利用试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，淀粉水解试验阴性，V-P试验阴性，硝酸盐还原试验阳性，D-葡萄糖发酵试验阴性，D-甘露醇发酵试验阴性，乳糖发酵试验阴性，麦芽糖发酵试验阴性。

(2)16S rDNA序列分析

将PAPM-9菌株接种到NB培养基中，于37℃，180r/min摇床培养24h。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序。所述NB培养基即营养肉汤培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL，pH 7.0。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列(SEQ-1)分析可知，该菌株为阿根廷假单胞菌(Pseudomonas argentinensis)，命名为阿根廷假单胞菌PAPM-9。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.20182，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年07月03日。

实施例3阿根廷假单胞菌PAPM-9的功能特性验证

(1)阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株的产NH

制备蛋白胨水培养基，其配方为：蛋白胨，10.0g；NaCl，5.0g；蒸馏水，1000mL；121℃灭菌20min，pH＝7.0。制备Nessler’s试剂，其配方为：HgI 50.0g，KI 40.0g，溶于200mL无氨水中；将此溶液倒入700mL NaOH溶液(210g/L)中，定容至1000mL，静置，取上层清液使用。

将阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株用接种环接种到含10mL蛋白胨水(10g/L)的试管中，28℃±2℃培养48-72h，每管加入0.5mL Nessler’s试剂，产生黄色或褐色沉淀则表明有NH

制备有机磷细菌培养基，其配方为：葡萄糖10.0g、(NH

将阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株用灭菌的牙签接种到有机磷培养基平板上，28℃培养2-5d后，测定透明圈及菌落直径，计算透明圈与菌落直径比(HC)。PAPM-9在有机磷培养基上产生的解磷透明圈直径为11.56mm，菌落直径为7.52mm，HC值为1.54，说明菌株PAPM-9具有解有机磷的能力(图3)。

实施例4阿根廷假单胞菌PAPM-9菌剂的制备

所述阿根廷假单胞菌PAPM-9菌株菌剂的制备方法包括以下步骤：

(1)菌种活化：将低温保藏的阿根廷假单胞菌PAPM-9菌种转接到LB培养基试管斜面，于37℃培养24h进行活化。所述LB培养基即Luria-Bertani培养基，其配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂20g、水1000ml，pH7.0。

(2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的阿根廷假单胞菌PAPM-9菌苔，接种LB液体培养基中，37℃培养20-24h。所述LB液体培养基的配方为：酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、水1000mL，pH7.0。

(3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以体积比2％的接种量转接入装有6L LB液体培养基的10L种子罐中，于37℃培养20h，全程搅拌转速200rpm，0-6h通风量为3L/min，6-20h通风量为6L/min。

(4)发酵培养：将种子罐菌种以体积比2％的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基300L，37℃培养24-28h，获得阿根廷假单胞菌PAPM-9的发酵液。全程搅拌转速为180rpm，0-6h通风量为200L/min，6-28h通风量为300L/min。发酵结束后，发酵液中阿根廷假单胞菌PAPM-9的活菌数为(5～10)×10

所述发酵培养基的配方为：豆粕粉10g、淀粉10g、葡萄糖2g、酵母浸粉1g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、复合酶制剂0.1g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为碱性蛋白酶50％、中性蛋白酶50％。碱性蛋白酶和中性蛋白酶均由泰安信得利生物科技有限公司生产，产品规格均为10万U/g，酶活力单位定义与检测方法执行国家标准GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》。

所述发酵培养基的制备方法为：按照配方称取原料，溶于水中，加热至45-50℃，保温1-2h，然后升温至121℃，保温20-30min进行灭菌。

(5)阿根廷假单胞菌PAPM-9发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01％(w/w)、生化黄腐酸粉2％(w/w)、矿源黄腐酸钾2％(w/w)、尿素1％(w/w)、磷酸氢二钾2％(w/w)和卡松0.05％(w/w)，搅拌均匀，获得活菌制剂，其活菌含量为(5～10)×10

实施例5：阿根廷假单胞菌PAPM-9菌剂对番茄软腐病的防治作用

盆栽实验用土取自山东省滨州市滨城区，为盐碱土壤，pH7.74，全盐含量1.98％，有机质含量8.1g/kg，全氮含量615mg/kg，速效氮含量50mg/kg，速效磷含量23.43mg/g，速效钾含量72.51mg/g。盆栽试验施肥量：有机肥使用量为1％(有机肥干重/土壤干重)，所述有机肥由山东佐田氏生物科技有限公司生产，其养分指标为有机质55.2％、N 2.4％、P

盆栽试验共设3个处理组(T1～T3)和2个对照组(CK1～CK2)，每组设50株番茄幼苗。处理组T1～T3：每株番茄幼苗接种阿根廷假单胞菌PAPM-9活菌制剂100倍稀释液(活菌浓度8×10

病害分级标准以整株为指标，具体分级为：0级：无症状；1级：近地面茎部始见水渍状绿色斑块；3级：茎端扩大为圆形或不规则形褐斑；5级：成熟期果实病斑为圆形褪绿小白点；7级：果实病斑变为污褐色斑点；9级：整株果实腐烂。

病情指数(％)＝∑(级值×株数)/(9×总株数)×100

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

试验结果如表1所示，接种病原菌5天后，对照组CK1个别植株上叶片始见水渍状褐色病斑，而处理组T1～T3植株无任何症状。10天后，对照组CK1植株底部第1～2叶片基部有明显病斑，处理组T1～T3植株有个别植株上叶片始见水渍状褐色病斑。三个处理组T1～T3植株病情指数分别为0.67％、1.11％和0.44％，防效分别为93.44％、89.14％和95.69％，而对照组CK1病情指数达到了10.22％。20天后，对照组CK1植株外部叶片有1/3～1/2腐烂，而处理组T1～T3植株有个别植株底部第1～2叶片基部有明显病斑，处理组T1～T3植株病情指数分别为2.22％、3.11％和4.44％，防效分别为88.78％、84.28％和77.55％，而对照组CK1病情指数达到19.78％。30天后，对照组CK1植株出现外部叶片全部腐烂，有一株整株腐烂，处理组T1～T3植株有个别植株底部第1～2叶片基部有明显病斑。三个处理组T1～T3植株病情指数分别为3.78％、4.00％和4.89％，防效分别为86.61％、85.83％和82.67％，而对照组CK1病情指数达到了28.22％。

表1阿根廷假单胞菌PAPM-9活菌制剂对番茄软腐病的防治作用

实施例6：耐盐碱阿根廷假单胞菌PAPM-9菌剂的促生作用

供试土壤取自山东省滨州市滨城区，为中度盐碱土壤。pH8.04，全盐含量2.3％，有机质含量7.6g/kg，全氮含量715mg/kg，速效氮含量53mg/kg，速效磷含量22.57mg/g，速效钾含量79.58mg/g。盆栽试验设菌剂处理组(T)和对照组(CK)等2个处理，每个处理设3个平行，每个平行设10个盆栽幼苗。以番茄为供试作物，选取大小基本一致颗粒饱满的番茄种子，用0.5％(体积比)的次氯酸钠进行表面消毒，然后用蒸馏水冲洗干净、播种。出苗后，菌剂处理组T每株幼苗灌根阿根廷假单胞菌PAPM-9活菌制剂100倍稀释液50mL(活菌浓度8×10

表2阿根廷假单胞菌PAPM-9菌剂对番茄幼苗株高、干重及叶绿素含量的影响

注：同列不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东佐田氏生物科技有限公司

<120> 一株耐盐碱阿根廷假单胞菌及其活菌制剂与应用

<130> 0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 阿根廷假单胞菌（Pseudomonas argentinensis）PAPM-9的16S rDNA 序列

<400> 1

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agcggcggac gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctatt agtgggggac aacgtttcga 120

aaggaacgct aataccgcat acgtcctacg ggagaaagca ggggaccttc gggccttgcg 180

ctaatagatg agcctaggtc ggattagcta gttggtgggg taaaggctca ccaaggcgac 240

gatccgtaac tggtctgaga ggatgatcag tcacactgga actgagacac ggtccagact 300

cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc 360

cgcgtgtgtg aagaaggtct tcggattgta aagcacttta agttgggagg aagggttgta 420

gattaatact ctgcaatttt gacgttaccg acagaataag caccggctaa ctctgtgcca 480

gcagccgcgg taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc 540

gtaggtggtt tgttaagttg gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ctgcatccaa 600

aactggcaag ctagagtacg gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg gtgaaatgcg 660

tagatatagg aaggaacacc agtggcgaag gcgaccacct ggactgatac tgacactgag 720

gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780

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