一种基于湖泊湿地eDNA提取技术监测湿地野生脊椎动物多样性的方法

摘要

本发明公开了一种基于湖泊湿地eDNA提取技术监测湿地野生脊椎动物多样性的方法，包括如下步骤：(1)样品采集：取待测湖泊湿地的表层水样；(2)eDNA提取：将所取的水样进行处理，提取eDNA；(3)eDNA的PCR过程；(4)eDNA技术的PCR产物纯化与定量；(5)高通量测序；(6)生物信息学分析；(7)分类鉴定，确定待测湖泊湿地中脊椎动物多样性组成。本发明无需调查者具有传统的生物识别及鉴定经验，取样简单、检测方便，省时省力、成本低、检测效率高且不会对湿地生物造成伤害，有利于湿地生物多样性保护。

说明书

技术领域

本发明涉及湿地生物多样性监测技术领域，特别涉及一种基于湖泊湿地eDNA提取技术监测湿地野生脊椎动物多样性的方法。

背景技术

湿地具有保持水源、净化水质、蓄洪防旱、调节气候和维护水生生物多样性等重要生态功能，在维护自然生态系统平衡的过程起着极为重要的作用。建立长期有效的湿地生物多样性监测机制，记录湿地生物多样性的现状，评估其未来的演变趋势，是理解生物多样性变化驱动力的基础，也是制定合理的生物多样性保护策略的重要前提(马克平,2011；Pereira et al.,2013)。

湿地野生脊椎动物包含鱼类、鸟类、爬行类、两栖类、哺乳类。传统的监测方法主要通过不同季度或者年份野外调查，同时要求调查者具有传统的生物识别及鉴定经验，人员、经费投入大、耗时且对调查对象造成一定损害。

环境DNA(environmental DNA，eDNA)是各种生物体脱落释放于环境中的混合DNA总称。eDNA metabarcoding是指从环境样品(如水、土壤等)中直接提取到的DNA进行高通量的多个物种鉴定方法。该技术整合DNA条形码和高通量测序技术，通过提取环境样品中的DNA，并使用特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序后得到的可操纵分类单元(operational taxonomic units,OTUs)进行物种鉴定(Ji et al.,2013)。

专利号为CN109825563A的中国发明专利于2019年5月31日公开的用于一种基于环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法，包括以下步骤：

(1)取待测水域的表层水样；

(2)将所取的水样进行处理，提取eDNA；

(3)以提取的eDNA为模板，CytbF(序列如SEQ ID NO:1)和Cytb R(序列如SEQ IDNO:2)、16S F(序列如SEQ ID NO:3)和16SR(序列如SEQ ID NO:4)为引物，PCR扩增，得到PCR产物；

(4)回收、纯化目的片段，构建目的片段文库，进行高通量测序后的原始数据优化后获得高质量序列；

(5)OTU聚类：应用软件Vsearch2.3.4对高质量序列在97％的相似性水平上进行聚类，产生可操作性分类单元(operational taxonomic units,OTUs)；

(6)建立鱼类比对数据库；

(7)OTUs代表性序列与建立的鱼类数据库的数据信息进行比对分析，确定待测水域中鱼类的物种多样性组成。

传统的湿地生物多样性监测要求调查者具有传统的生物识别及鉴定经验，且需要聘请多学科的专业调查人员，如鱼类、鸟类、两栖类等具有多年调查经验的相关专家，聘请专家费用造成成本高；针对一个区域湿地的传统野外调查，效率底，耗时间，如湖泊湿地野生脊椎动物多样性调查，需要具有传统分类经验的鱼类专家、两栖类、鸟类等专家，长期进行野外调查，而本专利涉及野外采样仅需1天，且不会对野生脊椎动物及其栖息地造成不利影响。此外，专利号为CN109825563A仅对一个类群(鱼类)进行检测，且引物设计2对，检出率不高，而本专利鱼类仅设计1对引物；且该专利仅检测湿地中鱼类，对湿地其它脊椎动物，如鸟类、两栖类等并没检测，检测效率低。

目前，缺乏检测效率高的基于湖泊湿地eDNA提取技术监测湿地野生脊椎动物多样性的方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有的湿地生物多样性监测存在的上述问题，提供一种检测效率高的基于湖泊湿地eDNA提取技术监测湿地野生脊椎动物多样性的方法。

本发明提供了如下技术方案：本发明的一种基于湖泊湿地eDNA提取技术监测湿地野生脊椎动物多样性的方法，包括如下步骤：

(1)样品采集：取待测湖泊湿地的表层水样；

(2)eDNA提取：将所取的水样进行处理，提取eDNA；

(3)eDNA的PCR过程：

(4)eDNA技术的PCR产物纯化与定量：

(5)高通量测序；

(6)生物信息学分析；

(7)分类鉴定，确定待测湖泊湿地中野生脊椎动物多样性组成。

进一步地，在步骤(1)中，样品采集

准备：每个地点需要使用到的采样工具在使用前经过高温高压灭菌处理后，独立包装，一次性使用，不可重复；

选点：在每一个监测点用聚乙烯玻璃采水器取表层水样，由湖岸向湖心每隔10～20m取1L水样，共选取10至20个点，约10～20L水；

在步骤(2)中，eDNA提取

Step1用蠕动泵将滤器中的酒精泵出滤器，然后将滤器放在无菌操作台里干燥24h；

Step2 24h候后将滤器取出，加入20ml的消化混合液；

Step3震荡混匀后再次将滤器密封，放入恒温箱56℃孵化48h，期间每隔12h翻动一次；

Step4取出滤器，将滤器中的消化液从上口倒入一个全新的50ml离心管中，9000转离心半分钟，转移上清液至一新的50ml离心管中；

Step5加入等体积的ALbuffer入50ml离心管中，混匀；

Step6加入等体积的无水乙醇至50ml离心管中，混匀，并将液体逐量转移至离心柱中；

Step7按照DNA提取试剂盒标准流程进行之后步骤；

Step8提取完的DNA样本于本实验室-20℃保存；

进一步地，在步骤(1)中，用专利号为CN 209178386U的中国发明专利于2019年7月30日公开的孔径为0.45μm的硝酸纤维滤膜囊式过滤器过滤采集的水样，过滤完成后，灌入约50ml的无水乙醇，然后将两端出水口与进水口密封，将每个滤器放入自封袋独立保存，尽可能低温运输回实验室，并且记录采样时间，GPS点，采样水量；

在步骤(2)中，step2消化混合液中的混合蛋白酶k:ATL的比例为1:9。

更进一步地，在步骤(4)中，PCR割胶纯化使用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒，磁珠纯化使用KAPA Pure Beads磁珠，Qubit定量使用Qubit 2.0定量仪和Qubit dsDNAHS Assay Kit试剂盒。

进一步地，在步骤(5)中，使用MiSeq二代测序仪。

进一步地，在步骤(6)中，Step1原始数据处理，Step2可操作分类单元(OTU)的聚类，Step3分类鉴定。

更进一步地，在步骤(6)中，原始数据处理：

①使用Adapter Removal v.2.2((Schubert et al.,2016)去除可能残留的Illumina测序接头序列；②使用Sickle v.1.3.3(Joshi and Fass,2011)去掉低质量的碱基；③使用SPAdes3.10.1(Nikolenko et al.,2013)进行序列纠错；④使用PANDAseqv.2.11(Masella et al.,2012)将上述处理后的双向序列进行拼接。

进一步地，在步骤(6)中，可操作分类单元(OTU)的聚类：去除低质量和错误测序序列后，使用sumaclust v.1.0.20(Mercier et al.,2013)进行相似度为97％的可操作单元OTU的聚类。

进一步地，在步骤(7)中，分类鉴定：将得到的所有物种DNA序列上传到NCBI网站进行序列比对，得到物种分类信息。

有益效果：本发明省时省力、成本低、检测效率高且不会伤害到目标物种或破坏调查点湿地生态系统。

与传统方法相比，eDNA metabarcoding技术具有灵敏度高、省时省力、对调查对象无损伤等优点，不要求调查者具有传统的生物识别及鉴定经验(马鸿娟等,2016)，减少在物种鉴定方面的投入，节省人力物力支出。目前eDNA技术已被广泛应用于湿地生态系统的监测、保护。其最大的优点是高效和简捷，只要收集环境中的水样，分析后便可得知监测湿地内野生脊椎动物多样性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详述。

实施例1

一、样品采集

在丘北普者黑国家湿地公园选择5个采样点，用聚乙烯玻璃采水器取表层水样，由湖岸向湖心每隔10～20m取1L水样，采集水样10至20L。使用孔径为0.45μm的硝酸纤维滤膜囊式过滤器过滤采集的水样(约半小时)，过滤完成后，灌入约50ml的无水乙醇，然后将两端出水口与进水口密封，将每个滤器放入自封袋独立保存，尽可能低温运输回实验室，并且记录采样时间，GPS点，采样水量。

二、eDNA提取

(1)用蠕动泵将滤器中的酒精泵出滤器，然后将滤器放在无菌操作台里干燥24h。

(2)24h候后将滤器取出，加入20ml的消化混合液(1:9的混合蛋白酶k:ATL)。

(3)震荡混匀后再次将滤器密封，放入恒温箱56℃孵化48h。期间每隔12h翻动一次。

(4)取出滤器，将滤器中的消化液从上口倒入一个全新的50ml离心管中，9000转离心半分钟，转移上清液至一新的50ml离心管中。

(5)加入等体积的ALbuffer入50ml离心管中，混匀。

(6)加入等体积的无水乙醇至50ml离心管中中，混匀，并将液体逐量转移至离心柱中。

(7)按照试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit(50)-QIAGEN)标准流程进行之后步骤。

(8)提取完的DNA样本于本实验室-20℃保存。

三、eDNA的PCR过程

本研究选择提取的环境DNA稀释100倍后的浓度作为PCR扩增的模板浓度。PCR实验检测并最终确定使用引物Mifish作为鱼类监测通用引物对湿地样本有很好的扩展效果(Miya et.al.,2015)；使用引物12S-V5扩增鸟类、两栖类有较好的扩增效果。这两对引物扩增的区域均为线粒体12sRNA区域(Riazet.al.,2011)。引物信息见表1。

表1

25μL的PCR反应体系包括0.5μL Forward Primer(10μM)、0.5μL Reverse Primer(10μM)、12.5μL KAPA 2G HotStart ReadyMix(2X)、9.5μL ddH2O、2.0μL DNA；TouchdownPCR扩增程序如下：95℃3min；98℃20s，69℃15s，72℃15s，共10个循环；然后98℃20s，65℃15s，72℃15s，共32个循环；最后72℃延伸5min。

四、eDNA技术的PCR产物纯化与定量

PCR割胶纯化使用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒，磁珠纯化使用KAPAPure Beads磁珠，Qubit定量使用Qubit 2.0定量仪和Qubit dsDNA HS Assay Kit试剂盒。

五、高通量测序

使用MiSeq二代测序仪。

六、生物信息学分析

1原始数据处理

①使用Adapter Removal v.2.2((Schubert et al.,2016)去除可能残留的Illumina测序接头序列；②使用Sickle v.1.3.3(Joshi and Fass,2011)去掉低质量的碱基；③使用SPAdes3.10.1(Nikolenko et al.,2013)进行序列纠错；④使用PANDAseqv.2.11(Masella et al.2012)将上述处理后的双向序列进行拼接。

2可操作分类单元(OTU)的聚类

去除低质量和错误测序序列后，使用sumaclust v.1.0.20(Mercier et al.,2013)进行相似度为97％的可操作单元OTU的聚类。

3分类鉴定

将得到的所有物种DNA序列上传到NCBI网站进行序列比对，得到物种分类信息。检测结果见表2。检测结果显示，eDNA检测方法可检测湿地中鱼类、鸟类、两栖类共32，其中鱼类检测种类数最多，达7目14科25种，即检测出普者黑国家湿地公园采集到的土著种类，如鲫鱼Carassius auratus、泥鳅Misgurnus anguillicaudatus，也可检测出原来没有调查到的外来物种，如太阳鱼Lepomis cyanellus、食蚊鱼Gambusia affinis等，表明鱼类检测准确性可靠；鸟类3目3科6种，检测种类数次之，均为湿地公园常见的鸟类，如苍鹭Ardeacinerea、绿头鸭Anas platyrhynchos、骨顶鸡Fulica atra；两栖爬行类仅检测到1目1科1种，即牛蛙Rana catesbeiana，为外来入侵物种。普者黑国家湿地公园监测结果如表2所示：

表2

实施例2

在滇池选择6个采样点，其样品采集、eDNA提取、eDNA的PCR过程、PCR产物纯化与定量、高通量测序、生物信息学分析等同实施例1，结果如表3所示。检测湿地中鱼类、鸟类、两栖类共25，其中鱼类检测种类数最多，达6目9科21种，即检测出滇池采集到的土著种类，如鲫鱼Carassius auratus、泥鳅Misgurnus anguillicaudatus，也可检测出原来没有调查到的外来物种，如大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus、食蚊鱼Gambusia affinis等，表明鱼类检测准确性可靠；鸟类、两栖类均检测到2种，均为滇池常见种类，如黑水鸡Gallinulachloropus、昭觉林蛙Rana chaochiaoensis、牛蛙Rana catesbeiana。滇池监测结果如表3所示：

表3

以上显示和描述了本发明的基本原理、操作流程、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。