一种降低血液中胆固醇含量的嗜酸乳杆菌JYLA-191及其应用

摘要

本发明涉及微生物的技术领域，具体来说，是一种降低血液中胆固醇含量的嗜酸乳杆菌JYLA‑191及其应用。其分类命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.21371，其保藏日期为2020年12月14日。本发明的嗜酸乳杆菌JYLA‑191菌体可以和肠道内的胆固醇相结合，减慢胆固醇的吸收，降低血液中脂蛋白的形成速度，减少循环系统中存在的胆固醇的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物的技术领域，具体来说，是一种降低血液中胆固醇含量的嗜酸乳杆菌JYLA-191及其应用。

背景技术

胆固醇又称胆甾醇。一种环戊烷多氢菲的衍生物。早在18世纪人们已从胆石中发现了胆固醇，1816年化学家本歇尔将这种具脂类性质的物质命名为胆固醇。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。胆固醇经代谢还能转化为胆汁酸、类固醇激素、7-脱氢胆固醇，并且7-脱氢胆固醇经紫外线照射就会转变为维生素D3，所以胆固醇并非是对人体有害的物质。

随着生活水平的提高以及饮食结构的不合理，胆固醇食物摄入过高，血液中胆固醇升高，成为影响心血管疾病的关键因素，并且心血管疾病正在日趋年轻化，提供一种合理的并具有降低胆固醇的食品，通过日常饮食降低体内胆固醇，促进人体健康的面食，迫在眉睫。

目前降低胆固醇的的方法有如下三种：

(1）坚持进行有氧运动

坚持进行有氧运动，有助于胆固醇的降低。有氧运动是指人体在充足O

(2)植物固醇有效清除胆固醇

植物固醇亦被称为植醇，因其具有辅助降低胆固醇的作用，是近几年保健食品研发中的一种热门研究物质。植物固醇能够部分阻止胆固醇进入血液的过程，借以降低血清中的胆固醇浓度及低密度脂蛋白（LDL）。根据以往研究的成果，如果每天摄取植物固醇2-3g，可以降低约10%的低密度脂蛋白，相关研究人员认为目前难以完全确定植醇具有降低胆固醇的特性，作为一种降低胆固醇的可行方法，必须符合同时对摄取的饱和脂肪和胆固醇进行限制的条件下，才能起到预期的效果。

(3)摄入降低胆固醇的药物

降低血浆胆固醇为主的调脂药物包括：①胆汁酸螯合剂：如考来烯胺（消胆胺）和考来替泊（降胆宁）。②他汀类药物，即HMG-CoA还原酶抑制剂，为目前临床上应用最广泛的一类调脂药物，已在临床上使用的有洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀。缺陷是可能导致横纹肌溶解，尤其是与贝特类药物合用时。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供是一种降低血液中胆固醇含量的嗜酸乳杆菌JYLA-191及其应用，主要是为了解决服用药物降低血液中胆固醇含量，而导致的不良反应问题。

本发明的技术方案为：

一种降低血液中胆固醇含量的嗜酸乳杆菌JYLA-191，其分类命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为:CGMCC No.21371,其保藏日期为2020年12月14日。

进一步的，本发明的降低血液中胆固醇含量的嗜酸乳杆菌JYLA-191在制备降低人体血液中胆固醇含量的产品方面的应用。

进一步的，所述的产品为内服产品；进一步的为含有嗜酸乳杆菌JYLA-191菌种冻干菌粉的粉剂；更进一步的为用低聚异麦芽糖与嗜酸乳杆菌JYLA-191菌种的冻干菌粉混合制成的粉剂。通过服用内服菌粉，实现降低血液中胆固醇含量的目的，避免使用药物造成的副作用。

进一步的，所述的嗜酸乳杆菌JYLA-191菌种冻干菌粉的制备方法为将嗜酸乳杆菌JYLA-191接种到MRS液体培养基平板中，1%接种量，在37℃条件下，兼性厌氧培养18-24小时，MRS菌液经过离心，真空冷冻干燥，获得副嗜酸乳杆菌粉。

进一步的，所述的MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8.6g、酵母浸粉5g、K

本发明的有益效果在于，

本发明的嗜酸乳杆菌JYLA-191菌体可以和肠道内的胆固醇相结合，减慢胆固醇的吸收，降低血液中脂蛋白的形成速度，减少循环系统中存在的胆固醇的含量。

嗜酸乳杆菌JYLA-191菌体、自由态胆盐、胆固醇三者的共沉淀加快了胆盐由结合态向游离态的转化，导致更多的胆酸盐的分泌，使消化道内类固醇物质代谢的速度变快。另外，与胆固醇的共沉淀可加速肝脏内胆固醇转化为胆酸的速度，从而降低血液中胆固醇的含量。

本发明还提供了具体的产品为内服菌粉，方便储存、携带和食用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1不同菌株的胆固醇清除率对照图。

图2不同菌株沉淀圈直径对照图。

图3大鼠血清胆固醇含量试验数据对照图。

图4大鼠动脉硬化指数(AI)试验数据对照图。

图5Caco-2胆固醇吸收和转运的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1 优势乳酸菌分离筛选

①菌种来源：健康成年男性粪便。

②平板培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8.6g、酵母浸粉5g、K

③菌株的分离

在广西巴马，由采集人员利用无菌的粪便采集器对健康成年男性的粪便进行取样，用无菌自封袋包裹，记录编号，冷链运输回公司。

将样品取出后用75%酒精擦拭取样器表面，在超净工作台中对取样器注入9mL无菌水，混匀后对样品液体做十倍梯度稀释，每个梯度取100μL均匀涂布于MRS固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养24h。

次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取若干乳酸菌的特征菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。

④16S rRNA序列的测定

16S rRNA扩增引物使用的是27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序。应用BLAST算法在GenBank数据库中把序列和16S rRNA基因进行比较，应用MEGA4.0程序建立邻接树。

BLAST分析，表明JYLA-191十分接近嗜酸乳杆菌（99%亲缘）。

⑤鉴定的序列序列长度1472bp，具体参见序列表SEQ No.1。

实施例2 JYLA-191胆固醇清除率对照实验

1、培养基

（1）MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8.6g、酵母浸粉5g、K

（2）MRS-CHOL液体培养基：称取MRS培养基54g，胆固醇1.0g，吐温80 20ml，牛胆盐3.0g，先将胆固醇置于吐温中溶解，用电炉加热至沸腾，并趁热倒入培养基中，定容至1L，121℃高压灭菌20min后，冷却后保存备用。

（3）邻苯二甲醛显色剂：0.25mg/mL邻苯二甲醛，溶剂为冰乙酸。

2、菌株

JYLA-191、ATCC13651、ATCC4357、ATCC4355、ATCC832、ATCC4356、ATCC4796。

3、操作

在MRS液体培养基37℃条件下培养48h。菌株经过两次活化，按体积百分比为3%的接种到MRS-CHOL培养基中，于37℃培养箱中培养48h。经离心（3500r/min，15min）。离心后分别取上清液，加入邻苯二甲醛溶液0.2mL和浓硫酸4mL。用没有接种过菌株的MRS-CHOL做空白对照，在550nm处测吸光度。对照组与实验组差值越大，说明实验组胆固醇去除能力越强。检测过程见表1，结论见图1。

表1 检测过程

由图1可以看出与其他菌株相比，菌株JYLA-191胆固醇清除率最高，尤其在72h时与其他菌株的差别最大，说明菌株JYLA-191有较好的胆固醇清除能力。

实施例3 JYLA-191胆盐水解酶活力实验

原理

胆盐水解酶（BSH）存在于肠道微生物中，能够水解肠道内的结合态胆盐形成氨基酸和游离胆汁酸，胆汁酸在大肠内不能被重复吸收而随着粪便排出体外。导致胆汁酸在肠肝系统循环次数减少，促使更多的胆固醇代谢合成新的胆汁盐，从而降低血清中胆固醇含量。

菌株

JYLA-191、ATCC13651、ATCC4357、ATCC4355、ATCC832、ATCC4356、ATCC4796。

操作

在MRS液体培养基中添加0.3%（m/v）脱氧牛磺胆酸钠（TDCA）、0.2%（m/v）巯基乙酸钠、0.37g/L CaCl

结果见图2，图2所示，所有菌株在含有TDCA和CaCl

实施例4 JYLA-191对大鼠体内胆固醇的降解作用

实验材料

MRS培养基

基础饲料：蛋白质20%、脂肪4.2%、碳水化合物50%。

高脂饲料：猪油10%、胆固醇1%、胆盐0.2%、基础饲料88.8%。

选择120只均重的SD大鼠。

各组处理见表2。

表2 各组处理情况

操作步骤

将所有大鼠由专业人员饲养，分成4组，每组30只。

实验历时10周，试验期间，大鼠自由饮水和进食，每天12h光照，12h黑暗。定时清理鼠笼，保证大鼠笼内清洁。食物消耗量每周计算一次，每周对大鼠分别称重记录根据体重确定灌胃量，并每周一收集大鼠粪便。

用实验饲料喂养9周后，把所有大鼠用基础饲料适应性喂养一周。之后处死大鼠。

各组血液血清胆固醇含量及AI指数对照结果如图3、图4所示。

原理

大鼠动脉硬化指数（AI）是衡量动脉硬化程度的指标。AI值越高,动脉硬化的危险性越高，动脉硬化的程度或者心脑血管疾病的发病率越高。

试验结论

本次动物实验用JYLA-191与阿托伐他汀片做灌胃处理，得出了以下结论：

（1）大鼠的动脉硬化指数如图4所示，JYLA-191组的AI值与药物组水平相当，而且低于模型组，说明JYLA-191对调节动脉粥样硬化有一定功效。

（2）用高脂饲料喂养的大鼠长期服用1mg/mL阿托伐他汀片水溶液能够有效的控制大鼠的血液胆固醇浓度。

（3）用高脂饲料喂养的大鼠长期饮用10

但阿托伐他汀会造成患者不良反应包括：过敏反应、血管神经性水肿、大疱疹（包括多形性红斑、Stevens-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解)，横纹肌溶解，疲劳感，肌腱断裂，肝功能衰竭，头晕，记忆力减退，抑郁及外周神经病变。

实施例5 JYLA-191对Caco-2细胞的胆固醇吸收实验

实验材料

含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基。

MRS培养基。

NBD-胆固醇溶液：用15mM的PBS缓冲液（pH7.4）配制浓度分别为6.6mM的牛磺胆酸钠、0.6mM的磷脂酰胆碱、132mM的NaCl溶液，于37℃超声24h后加入一定量的荧光标记的胆固醇NBD-胆固醇，使胆固醇浓度为0.5mM，得到有荧光标记的胆固醇溶液。

实验菌株

JYLA-191、ATCC13651、ATCC4357、ATCC4355。

实验步骤

按实验分组将Caco-2细胞接种于Transwell 6孔板中，每孔1×10

PBS清洗2次，更换为完全培养基（含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基），37℃，5%CO

实验组，在对照组基础上，先准备好菌株JYLA-191、ATCC13651、ATCC4357、ATCC4355在MRS培养基中发酵24h的菌液，将菌液分别取用1mL以4000r/min的转速离心得到菌泥，在对照组的基础上分别加入不同菌株的菌泥，培养2h。处理结束后去除培养基，细胞PBS洗3次，检测细胞荧光强度（激发波长462nm，发射波长536nm）。胆固醇吸收抑制率结果表示方式为

胆固醇吸收抑制率（%）=（对照组荧光强度-实验组荧光强度）/对照组荧光强度×100。

从图5可以看出，不同菌株对Caco-2细胞胆固醇吸收均有一定的抑制作用，其中菌株JYLA-191抑制效果最为明显，说明JYLA-191菌株有突出的抑制细胞吸收胆固醇的效果。

尽管通过参考并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司

<120> 一种降低血液中胆固醇含量的嗜酸乳杆菌JYLA-191及其应用

<130> 2021

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1472

<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<400> 1

tcagacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagctga accaacagat 60

tcacttcggt gatgacgttg ggaacgcgag cggcggatgg gtgagtaaca cgtggggaac 120

ctgccccata gtctgggata ccacttggaa acaggtgcta ataccggata agaaagcaga 180

tcgcatgatc agcttataaa aggcggcgta agctgtcgct atgggatggc cccgcggtgc 240

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<212> DNA

<213> 人工合成

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