一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于治疗、预防、减缓或控制鸭病毒性肝炎的卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：将微生物保藏号为CGMCC No.19696的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和/或微生物保藏号为CGMCC No.19695的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株作为免疫原，制备成鸭病毒性肝炎疫苗；用鸭病毒性肝炎疫苗接种禽体，获得高免禽蛋；从高免禽蛋中提取卵黄抗体。本发明还公开了通过前述方法制备得到的卵黄抗体。该卵黄抗体特异性好，安全有效。

说明书

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法，特别涉及一种Ⅰ型鸭病毒性肝炎和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价卵黄抗体及制备方法。

背景技术

我国鸭存栏量每年约40亿只。鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH) 是由鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起的雏鸭的急性、致死性传染病，以发病急、肝肿大、出血和高度致死率为特征。主要感染21 日龄以内的雏鸭，引起典型的肝炎症状，雏鸭死亡率高达80％以上，传播迅速，呈广泛性分布。

2008年，DHV被重新命名为鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus， DHAV)。DHAV分为A、B、C三个基因型，分别对应DHAV-1、DHAV-2、 DHAV-3，具OIE报道亚洲主要流行鸭肝炎Ⅰ型及其变异株，即鸭甲肝病毒，该病主要危害3周龄以内雏鸭，发病急，死亡率高，尤其是1～2周龄的雏鸭发病率和死亡率较高，死亡率可达30％以上，是危害养鸭业重要传染病之一。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolk immunoglobulins)，简称为IgY。卵黄抗体的形成过程是：当机体受到外界特异性抗原(尤其是灭活抗原)的刺激后诱发一系列的免疫应答反应，激发B细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞，分泌大量的特异性抗体进入血液中。同时在产蛋禽体内，血液中的特异性抗体IgG(所有亚群)由卵巢IgG受体的介导逐步进入到卵巢滤泡和输卵管中，并在卵黄中蓄积起来，也正是由于这种卵黄累积作用，使卵黄中的IgG明显地高于血清中的含量，而血清中的其他抗体(主要是IgM，IgA)与输卵管中的卵白白蛋白一起混入到鸡蛋白中。

鸡卵黄抗体IgY是鸡的一种免疫球蛋白Ig，鸡IgY在功能上相当于哺乳动物IgG，但结构上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空间构象。鸡卵黄抗体具有很多优越性。

卵黄抗体的研究始于19世纪末，1893年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体；1934年Jukes的实验证明母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护。Patters等的试验证实，相对别的血浆蛋白，IgG 被选择性的转运到卵泡中。1969年，Leslie和Clem将这种抗体命名为IgY。

禽类卵黄中的抗体主要是卵黄免疫球蛋白，与血清抗体相比，卵黄抗体具有许多独特的优点：(1)无需采血，只需收集免疫种鸭产下的蛋即可纯化得到卵黄抗体；(2)有良好的稳定性，且耐热耐酸，常温下仍能保持一定的活性。 (3)治疗效果明显，特异性强，且易大规模生产。(4)安全、无残留、温和环保。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明公开了一种鸭病毒性肝炎病毒卵黄抗体的制备方法，所用的疫苗株为用DF-1细胞系培养的Ⅰ型LSE株和Ⅲ型QZE 株，该卵黄抗体安全性好，效价高。

本发明第一方面提供了一种用于治疗、预防、减缓或控制鸭病毒性肝炎的卵黄抗体的制备方法，所述制备方法为：以鸭病毒性肝炎病毒疫苗株为免疫原免疫禽体，制备所述卵黄抗体；

所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和/或Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株；

所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19696 的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株；

所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19695 的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。

在一些实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：

(a)疫苗的制备：

将所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和/或Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株作为免疫原，制备成鸭病毒性肝炎病毒疫苗；

(b)高免禽蛋的制备：

用所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗接种禽体，获得高免禽蛋；

(c)卵黄抗体的提取：

从所述高免禽蛋中提取卵黄抗体。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗包括所述免疫原和疫苗辅料。

优选地，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗为灭活疫苗。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述疫苗辅料包括油脂类佐剂、第一种乳化剂和第二种乳化剂。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述油脂类佐剂选自白油。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述第一种乳化剂选自司本-80。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述第二种乳化剂选自吐温-80。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗的成分按照用量比包括：

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝750-2250×10

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗的成分按照用量比包括：

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝1500-4500×10

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗的成分按照用量比包括：

Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝1500-4500×10

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和/或所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的ELD

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗的制备的步骤为：

(a1)油相佐剂的制备：

将所述油脂类佐剂与第一种乳化剂混合，得到油相佐剂；

(a2)水相的制备：

将灭活的所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株与第二种乳化剂混合，得到水相；

(a3)混合：

将所述油相佐剂与所述水相混合，得到所述疫苗组合物；

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述高免禽蛋的制备步骤为：

(b1)基础接种：

用所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗接种产蛋期禽类动物；

(b2)加强接种：

基础接种10-28天(比如，12天、14天、16天、18天、20天、22天、 24天、26天)后，用所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗接种产蛋期禽类动物；

(b3)强化接种：

加强接种10-28(比如，12天、14天、16天、18天、20天、22天、24 天、26天)天后，用所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗接种产蛋期禽类动物，得到所述高免禽蛋。

在一些实施方式中，所述禽类动物选自：鸡、鸭、鹅。

在一些实施方式中，所述产蛋期为120-400日龄(比如，150日龄、180 日龄、210日龄、240日龄、270日龄、300日龄、330日龄、360日龄、390 日龄)。

在一些实施方式中，所述基础接种为皮下注射含有1.5-6.0×10

在一些实施方式中，所述加强接种为肌肉注射含有3.0-12.0×10

在一些实施方式中，所述强化接种肌肉注射含有3.0-12.0×10

在一些实施方式中，在步骤(b)中，在所述高免禽蛋中，通过鸡胚中和试验法测定，针对所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的中和抗体效价≥1：2048，和/或，针对所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的中和抗体效价≥1：2048。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述卵黄抗体的提取步骤为：

(c1)分离蛋黄：

获取所述高免禽蛋的卵黄；

(c2)萃取：

萃取所述卵黄，得到所述粗卵黄抗体。

在一些实施方式中，在步骤(c1)之前，将所述高免禽蛋消毒之后分离蛋黄。

在一些实施方式中，将所述高免禽蛋消毒的方法为：

用新洁尔灭水溶液对所述高免禽蛋进行消毒。

在一些实施方式中，所述新洁尔灭水溶液的浓度为0.08-0.12wt％(比如，0.09wt％、0.10wt％、0.11wt％)。

在一些实施方式中，用新洁尔灭水溶液在35-45℃(比如，36℃、37℃、 38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃)条件下对所述高免禽蛋进行消毒。

在一些实施方式中，将所述高免禽蛋消毒的方法还包括：

用福尔马林密闭熏蒸经新洁尔灭水溶液消毒的所述高免禽。

在一些实施方式中，所述熏蒸的时间为20-40分钟(比如、25分钟、30 分钟、35分钟)。

在一些实施方式中，在步骤(c1)中，手工或器械打所述高免禽蛋，除去蛋清、胚盘和系带，收集所述卵黄。

在一些实施方式中，在步骤(c2)中，所述萃取的步骤为：

将所述卵黄与酸化水混合，得到卵黄混合液；

将所述卵黄混合液离心处理，收集上清，得到所述粗卵黄抗体。

在一些实施方式中，在步骤(c2)中，所述酸化水的pH值为3.5-4.5(比如，3.7、3.9、4.1、4.3)。

在一些实施方式中，在步骤(c2)中，所述卵黄与所述酸化水的体积比为1:4-8(比如，1:5、1:6、1:7)。

在一些实施方式中，在步骤(c2)中，所述混合在2-5℃(比如，3℃、 4℃)条件下静止3-8小时(比如，4小时、5小时、6小时、7小时)。

在一些实施方式中，在步骤(c2)中，所述混合是在搅拌条件下进行的。

在一些实施方式中，在步骤(c2)中，所述离心的转数为6000-10000转/分钟(比如，6500转/分钟、7000转/分钟、7500转/分钟、8000转/ 分钟、8500转/分钟、9000转/分钟、9500转/分钟)。

在一些实施方式中，在步骤(c2)中，所述离心的时间为10-40分钟(比如，15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟)。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述卵黄抗体的提取步骤还包括：

(c3)用澄清剂处理所述粗卵黄抗体，得到澄清处理的卵黄抗体。

在一些实施方式中，所述澄清剂为正辛酸。

在一些实施方式中，在步骤(c3)中，所述用澄清剂处理时间为5-10小时(比如，6小时、7小时、8小时、9小时)。

在一些实施方式中，在步骤(c3)中，所述澄清剂在所述粗卵黄抗体中的用量为0.05-0.1v/v％(比如，0.06v/v％、0.07v/v％、0.08v/v％、0.09v/v％)。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述卵黄抗体的提取步骤还包括：

(c4)卵黄抗体的纯化：

纯化所述澄清处理的卵黄抗体，获得所述纯化的卵黄抗体。

在一些实施方式中，在步骤(c4)中，所述卵黄抗体的纯化步骤为：

将澄清处理的卵黄抗体进行过滤澄清。

在一些实施方式中，在步骤(c4)中，所述过滤澄清为使用0.5μm滤芯过滤，取滤液。

在一些实施方式中，在步骤(c4)中，所述卵黄抗体的纯化步骤还包括：

将所述过滤澄清所得滤液过滤除菌。

在一些实施方式中，在步骤(c4)中，所述过滤除菌为使用0.22μm滤芯过滤，取滤液。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述卵黄抗体的提取步骤还包括： (c5)浓缩：

将所述卵黄抗体的溶液浓缩后得到卵黄抗体浓缩液。

在一些实施方式中，所述浓缩是经截留分子量为80-120KD(比如，90KD、 100KD、110KD)的超滤膜浓缩后得到的。

在一些实施方式中，所述卵黄抗体浓缩液中，通过鸡胚中和试验法测定，针对所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的中和抗体效价≥1：8192，和/或，针对所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的中和抗体效价≥1：8192。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述卵黄抗体的提取步骤还包括： (c6)灭菌：

对所述卵黄抗体浓缩液进行灭菌处理。

在一些实施方式中，在步骤(c6)中，所述灭菌处理为用

在一些实施方式中，在步骤(c6)中，照射剂量应为10-15kGy(比如， 11kGy、12kGy、13kGy、14kGy)。

在一些实施方式中，将所述浓缩液冻干，得到卵黄抗体冻干粉。

本发明第二方面提供了一种用于治疗、预防、减缓或控制鸭病毒性肝炎的卵黄抗体，所述卵黄抗体是通过本发明第一方面所述的制备方法制备得到的。

本发明第三方面提供了一种用于治疗、预防、减缓或控制鸭病毒性肝炎的卵黄抗体组合物，所述卵黄抗体组合物以根据本发明第一方面所述的制备方法制备的卵黄抗体为免疫原。

在一些实施方式中，所述卵黄抗体组合物包括根据本发明第一方面所述的制备方法制备的卵黄抗体和辅料。

在一些实施方式中，所述辅料为冻干保护剂。

在一些实施方式中，所述冻干保护剂的为包括55-65重量份(比如，56 重量份、57重量份、58重量份、59重量份、60重量份、61重量份、62重量份、63重量份、64重量份)海藻糖、15-25重量份(比如，16重量份、17 重量份、18重量份、19重量份、20重量份、21重量份、22重量份、2重量份、24重量份)甘露醇、5-15重量份(比如，6重量份、7重量份、8重量份、9重量份、10重量份、11重量份、12重量份、13重量份、14重量份) 甘氨酸和5-15重量份(比如，6重量份、7重量份、8重量份、9重量份、10 重量份、11重量份、12重量份、13重量份、14重量份)L-半胱氨酸的混合物。

在一些实施方式中，在所述卵黄抗体组合物中，按照用量比，当所述辅料的干重为1g时，所述免疫原为：

10-30ml(比如，12ml、14ml、16ml、18ml、20ml、22ml、24ml、26ml、 ml、28ml)针对所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的中和抗体效价≥1：8192 的卵黄抗体溶液，或含有等量的所述卵黄抗体的溶液或混合物；和/或

10-30ml(比如，12ml、14ml、16ml、18ml、20ml、22ml、24ml、26ml、 ml、28ml)针对所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的中和抗体效价≥1：8192 的卵黄抗体溶液，或含有等量的所述卵黄抗体的溶液或混合物。

在一些实施方式中，所述中和抗体效价是通过鸡胚中和试验法测定得到的。本发明第四方面提供了本发明第三方面所述的卵黄抗体组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将所述卵黄抗体与所述辅料混合，得到卵黄抗体混合物，即得所述卵黄抗体组合物。

在一些实施方式中，所述制备方法还包括如下步骤：

将所述卵黄抗体混合物干燥，得到卵黄抗体冻干粉。

在一些实施方式中，所述制备方法还包括如下步骤：

将所述卵黄抗体混合物冻干，得到卵黄抗体冻干粉。

在一些实施方式中，冻干的程序为：

预冻：将所述卵黄抗体混合物在-45℃到-35℃(比如，-44℃、-43℃、-42℃、 -41℃、-40℃、-39℃、-38℃、-37℃、-36℃)下放置，得到第一混合物；

升华：将所述第一混合物在-10℃到-1℃(比如，-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、 -5℃、-4℃、-3℃、-2℃)下放置，得到第二混合物；

解吸干燥：将所述第二混合物在25℃到30℃(比如，26℃、27℃、28℃、 29℃、30℃)下放置，得到所述卵黄抗体冻干粉。

在一些实施方式中，所述预冻维持4-8小时(比如，5小时、6小时、7 小时)。

在一些实施方式中，所述升华维持30-45小时(比如，32小时、34小时、 36小时、38小时、40小时、42小时、44小时)。

在一些实施方式中，所述解吸干燥维持2-6小时(比如，3小时、4小时、 5小时)。

在一些实施方式中，所述预冻到所述升华的过渡时间为0.8-1.2小时(比如，0.9小时、1.0小时、1.1小时)。

在一些实施方式中，所述升华到所述解吸干燥的过渡时间为0.8-1.2小时 (比如，0.9小时、1.0小时、1.1小时)。

在一些实施方式中，所述制备方法还包括如下步骤：

用生理盐水、PBS或注射用水稀释所述卵黄抗体冻干粉，得到卵黄抗体注射液。

在一些实施方式中，在所述卵黄抗体注射液中，通过鸡胚中和试验法测定，针对所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的中和抗体效价≥1：512，和/或，针对所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的中和抗体效价≥1：512。

本发明第五方面提供了一种本发明第一方面所述的制备方法、本发明第二方面所述的卵黄抗体、本发明第三方面所述的卵黄抗体组合物或者本发明第四方面所述制备方法，在制备用于单独使用，用于与其他免疫制剂和/或药物联合使用，或用作与其他免疫制剂和/或药物组成的复方制剂的组分以治疗、预防、减缓和/或控制Ⅰ型鸭病毒性肝炎和/或Ⅲ型鸭病毒性肝炎的制剂中的用途。

附图说明

图1为本发明Ⅰ型鸭病毒性肝炎和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗制备的技术路线图。

图2为本发明卵黄抗体制备的技术路线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

定义：

临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株：

针对本发明所请求保护的病毒株，很明显，没有突变的传代病毒株属于实质上相同的病毒株，其临床致病性与免疫原性没有变化是指没有实质性变化，由于检测操作条件，动物品种、年龄、性别、健康状况等体现的差别以及可预期的系统误差属于没有实质性变化，属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株。另外，病毒株传代多次后不可避免引入微小的突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响病毒株致病性和免疫原性的突变(比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响致病性或免疫原性的微小突变的残基)，这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为临床致病性与免疫原性没有变化的突变病毒株。比如，本发明保藏的病毒株(比如，生物保藏号为CGMCC No.19695或CGMCC No.19696的病毒株)的禽胚(如，鸭胚)传代病毒株(或适应性病毒株)、细胞(比如DF-1细胞系)传代病毒株(或适应性病毒株)、不分顺序地经过禽胚和细胞传代的子代病毒株，以及交叉经历禽胚和细胞多次传代的子代病毒株，其临床致病性与免疫原性没有实质性变化，则属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。

本发明所指现行《中国兽药典》为《中华人民共和国兽药典》2015版三部，中国农业出版社出版。

易感鸭：鸭场未使用过鸭病毒性肝炎疫苗，且未发生过鸭病毒性肝炎；蛋黄中鸭病毒性肝炎中和抗体效价<1:4的种蛋所孵化的雏鸭及其不同日龄的鸭。

材料

DF-1细胞系，是一株鸡胚成纤维细胞系，购自ATCC公司(ATCC细胞系编号为：CRL-12203))。

检验用强毒为鸭病毒性肝炎病毒肝组织毒I型LS株和Ⅲ型QZ株，均由辽宁益康生物股份有限公司分离、鉴定、保管和供应。

白油：美国索诺邦白油。

吐温-80：由沈阳三瑞试剂有限公司供应。

司本-80：由上海丹众医药化工有限公司供应。

乳化设备：弗鲁克高剪切分散乳化机。

图1示出了本发明Ⅰ型鸭病毒性肝炎和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗制备的基本技术路线。

图2示出了本发明卵黄抗体制备的基本技术路线。

实施例1.Ⅰ型鸭病毒性肝炎疫苗毒株的获取

(1)病例

辽宁省一家鸭养殖场的鸭群发病，症状为：全身抽搐、两腿痉挛、头向后仰等神经症状，死后呈现典型的角弓反张、剖检主要典型的病变为肝脏肿大和出血。经病死鸭子尸体剖检，剖检肝脏肿大、有出血斑点，基本诊断为鸭病毒性肝炎。

(2)病原分离

将患病鸭肝组织用灭菌生理盐水冲洗3次，按1g组织：10ml生理盐水的比例将肝组织加入灭菌冷生理盐水，放入组织搅拌机中，以10000～ 12000r/min，充分捣碎肝组织，反复在-15℃以下冻融3次后，收集滤液，并以12000r/min 4℃下离心30分钟，收集上清，得到肝组织液。

取0.2ml肝组织液，经尿囊腔接种14日龄易感鸭胚，37℃条件下孵育 96小时，然后无菌收集尿囊液，以12000r/min 4℃下离心30分钟，收集上清，得到含有疑似鸭病毒性肝炎病毒的病毒液a。

(3)特异性测试

将病毒液a用生理盐水作10倍系列稀释，每个稀释度尿囊腔内接种8～ 10日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，24小时以前死亡鸭胚弃去，48～168小时死亡鸭胚随时取出，根据Reed-Muench法计算ELD

将稀释后的病毒液a与等体积Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒特异性血清(由辽宁益康生物股份有限公司针对已经鉴定的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒所制备的鸭来源的阳性血清)混合，经37℃孵育60分钟后，将混合物经尿囊腔接种8～ 10日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml；37℃培养观察168小时。孵育组鸭胚全部健活。

在平行条件下，用稀释后的病毒液a与等体积生理盐水混合物接种鸭胚，作为对照，对照组鸭胚全部死亡。死亡胚胎后肢和腹部水肿，全身和皮下出血，肝脏有针尖大小的出血点和坏死灶，胚胎发育迟缓。

由此可以确信，病毒液a中含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒。

(4)分子诊断

根据GenBank上公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列在5’UTR保守区序列附近设计一对引物，引物序列为：

F1：5’-AGCACGAGAGACCCTTACG-3’

R1：5’-CCCACAGGCTCTCACTAAAG-3’

使用引物F1和R1对病毒液a中的核酸进行RT-PCR扩增，将PCR产物送至吉林库美生物工程有限公司进行测序，并将结果用DNAStar软件进行序列分析，与NCBI中基因序列进行比较，该序列与Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒VP1 基因同源性最高的序列达到95.6％同源性，由此可以确信，病毒液a中含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒。

将病毒液a中含有的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒命名为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株(简称LSE株)。

(5)Ⅰ型鸭病毒性肝炎毒株的生物保藏

本发明将所分离得到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.19696的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病LSE株；分类命名为：Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒；保藏时间是：2020年04 月22日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该病毒株称作Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株、DHAV-1LSE株、LSE株、LSE。

实施例2.Ⅲ型鸭病毒性肝炎疫苗毒株的获取

(1)病例

辽宁省一家鸭养殖场的鸭群发病，症状为：精神萎靡，共济失调，翅膀下垂。根据症状判断，疑似患有鸭病毒性肝炎。经病死鸭子尸体剖检，剖检肝脏肿大，胆囊肿大，胆汁颜色变淡，基本诊断为鸭病毒性肝炎。

(2)病原分离

与实施例1步骤(2)相同的方法，得到含有疑似鸭病毒性肝炎病毒的病毒液b。

(3)特异性测试

以与实施例1步骤(3)相同的方法，将病毒液b稀释成200ELD

将稀释后的病毒液b与等体积Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒特异性血清(由辽宁益康生物股份有限公司针对已经鉴定的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒所制备的鸭来源的阳性血清)混合，经37℃孵育60分钟后，将混合物经尿囊腔接种8～ 10日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml；37℃培养观察168小时。孵育组鸭胚全部健活。

在平行条件下，用稀释后的病毒液b与等体积生理盐水混合物接种鸭胚，作为对照，对照组鸭胚全部死亡。死亡胚胎后肢和腹部水肿，全身和皮下出血，肝呈红黄色。

由此可以确信，病毒液b中含有Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒。

(4)分子诊断

根据GenBank上公布的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列在5’UTR保守区序列附近设计一对引物，引物序列为：

F3：5’-TGGGCTAATGGTCTTCGT-3’

R3：5’-TTGGGTCTGGTATTGTCTGT-3’

使用引物F3和R3对病毒液b中的核酸进行RT-PCR扩增，将PCR产物送至吉林库美生物工程有限公司进行测序，并将结果用DNAStar软件进行序列分析与NCBI中基因序列进行比较，该序列与Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒VP1 基因同源性最高的序列达到96％同源性，由此可以确信，病毒液b中含有Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒。

将病毒液b中含有的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒命名为Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株(简称QZE株)。

(5)Ⅲ型鸭病毒性肝炎毒株的生物保藏

本发明将所分离得到的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.19695的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病QZE株；分类命名为：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒；保藏时间是：2020年04 月22日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该病毒株称作Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株、DHAV-3QZE株、QZE株、QZE。

实施例3.Ⅰ型鸭病毒性肝炎疫苗毒株的细胞培养

(1)Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞适应株的培养

采用有限稀释法纯化技术进行选育，将实施例1所得到的病毒液a接种在DF-1细胞系中连续传代，培养液为无血清DMEM-F12培养基，选择病毒半数致死量高的子代，培养了1-10代，获得Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒DF-1细胞系适应株。

经测定，不同代次病毒含量为10

(2)建立Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的毒种种子批

将步骤1)所得Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒DF-1细胞系适应株接种DF-1细胞，培养液为：无血清DMEM-F12培养基，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第10代，对细胞培养液中病毒含量进行测定，选择各代次毒种的病毒含量≥10

(3)制备Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的细胞毒液

在体积为14L的生物反应器中利用培养基全悬浮培养DF-1细胞，培养基的组成为：无血清DMEM-F12培养基，培养条件为温度35～36℃，pH7.2～ 7.5；转速为130-150rpm，当反应器中DF-1细胞数量达到400～500万时，接种前述种子批培养的第F8～F10代毒种，毒种含量为10

实施例4.Ⅲ型鸭病毒性肝炎疫苗毒株的细胞培养

(1)Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞适应株的培养

采用实施例3步骤(1)相同的方法和判断标准，培养实施例2所得到的病毒液b，培养了1-10代，获得Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒DF-1细胞系适应株。

经测定，不同代次病毒含量为10

(2)建立Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的毒种种子批

将步骤1)所得Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒DF-1细胞系适应株接种DF-1细胞，培养液为：无血清DMEM-F12培养基，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第15代，对细胞培养液中病毒含量进行测定，选择各代次毒种的病毒含量≥10

(3)制备Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的细胞毒液

在体积为14L的生物反应器中利用培养基全悬浮培养DF-1细胞，培养基的组成为：无血清DMEM-F12培养基，培养条件为温度35～36℃，pH7.2～ 7.5；转速为130-150rpm，当反应器中的DF-1细胞数量达到400～1000万时，接种前述种子批培养的第F13～F15代毒种，毒种含量为10

实施例5.鸭病毒性肝炎疫苗的制备

(1)病毒的灭活

(i)灭活Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒：

取实施例3所得LSE株细胞毒液，反复冻融3次处理，采用多层无菌纱布过滤除菌后，加入细胞毒液总量(V/V)0.2％的灭活剂(浓度为37％的甲醛水溶液)，36℃条件下振荡灭活24小时，得到LSE株灭活病毒液。

灭活病毒的成品检验：取所得LSE株灭活病毒液，以0.2ml/胚的剂量经 CAM(绒毛尿囊膜)途径接种10枚易感鸭胚，观察168小时，无鸭病毒性肝炎特异性病变或死亡的鸭胚，判定毒液灭活完全；同时，取LSE株灭活病毒液，分别接种细菌检验用TG和TSB培养基，观察10日，均无细菌生长，判定灭活毒液无细菌污染。

(ii)灭活Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒：

取实施例4所得QZE株细胞毒液，采用实施例5步骤(1)之(i)相同的方法，得到QZE株灭活病毒液。

灭活病毒的成品检验：取所得QZE株灭活病毒液，采用实施例5步骤(1) 之(i)相同的方法，判定灭活毒液无细菌污染。

(2)油相佐剂制备：

将95体积份的白油和5体积份的司本-80混合，100℃下搅拌混匀，116℃下高压灭菌，冷却后得到油相佐剂，备用。

(3)水相制备：

(i)Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒水相的制备：

94体积份前述LSE株灭活病毒液与6体积份灭菌好的吐温-80，充分振摇混合均匀，得到LSE株水相。

(ii)Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒水相的制备：

94体积份前述QZE株灭活病毒液与6体积份灭菌好的吐温-80，充分振摇混合均匀，得到QZE株水相。

(4)疫苗的制备：

(i)Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗的制备：

将前述油相佐剂3体积份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入前述LSE株水相2份，进行充分搅拌乳化。在终止乳化前加入灭菌1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01w/v％。得到Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株疫苗(简称LSE株疫苗)。

(ii)Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗的制备：

将前述油相佐剂3体积份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入前述QZE株水相2份，进行充分搅拌乳化。在终止乳化前加入灭菌1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01w/v％。得到Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株疫苗(简称QZE株疫苗)。

(iii)二价鸭病毒性肝炎病毒疫苗的制备：

将前述油相佐剂3体积份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入前述LSE株水相1体积份和前述QZE株水相1体积份，进行充分搅拌乳化。在终止乳化前加入灭菌1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01w/v％。得到Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株的二价灭活疫苗(简称二价苗)。

实施例6.冻干卵黄抗体制备

(1)产蛋鸡的选择

符合以下条件的商品蛋鸡。

无禽白血病和禽网状内皮增生症：按鸡群0.5％抽样采血，分别检测抗体，全部为阴性。

按NY/T536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率≤0.1％。

产蛋鸡应具有商品蛋鸡的生产性能。

鸡的饲养管理：鸡场建设符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道200米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场具备粪污处理设施。实施全进全出制。鸡场饮水应达到卫生标准。饲养人员卫生健康。

鸡群疫病防治：按科学免疫程序适时接种鸡新城疫、禽流感、鸡马立克氏病、鸡传染性支气管炎、鸡传染性鼻炎、鸡减蛋综合征(EDS-76)和鸡大肠杆菌疫苗。按常规在饲料中添加抗菌及抗球虫药物预防细菌和球虫感染。

(2)免疫程序

(a)基础接种：120日龄商品蛋鸡，每只颈部皮下注射实施例5所制备的二价苗1ml。

(b)加强接种：在基础接种后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射实施例5所制备的二价苗2ml。

(c)强化接种：第2次接种后14日进行第3次接种，每只鸡腿部肌肉注射实施例5所制备的二价苗2ml。

(d)维持接种：在强化接种后3-4个月，当鸡生产的鸡蛋的卵黄中针对Ⅰ型或Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒中和抗体效价临界1:2048时，维持接种1次，每只胸部肌肉注射实施例5所制备的二价苗2ml。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒中和试验方法：高免鸡蛋与生理盐水1:3(V/V)混合后，用等体积的三氯甲烷萃取上清液，将上清液作2倍系列稀释，取1:4、 1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048共9个稀释度分别与Ⅰ型鸭肝炎病毒LSE株病毒液(200ELD

Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒中和试验方法：病毒液为Ⅲ型鸭肝炎病毒Ⅲ型 QZE病毒液(200ELD

(3)卵黄抗体的制备

(a)采蛋：

第3次免疫后10-14日，抽样测定高免鸡所生鸡蛋的蛋黄中针对Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的中和抗体效价(方法为前述鸡胚中和试验法)。高免鸡蛋与生理盐水1:3(V/V)混合后，用等体积的三氯甲烷萃取上清液，中和抗体效价≥1：2048以上，即为合格。收集鸡蛋，置10-15℃贮存，不超过10 日。

(b)蛋壳消毒：

将前述抽样测定合格的鸡蛋浸入42℃0.lwt％新洁尔灭水溶液中消毒15 分钟。筛选出蛋壳污染严重的，用70％(v/v)的乙醇冲洗干净，再浸入42℃ 0.lwt％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟浸泡消毒1次。最后，用福尔马林密闭熏蒸30分钟消毒。

(c)打蛋分离蛋黄：

用蛋黄分离机打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。

(d)萃取：

在不锈钢罐中加入步骤(c)所得蛋黄6倍体积的酸化水(用盐酸将pH 值调为4.2的注射用水)，并降温至4℃，然后加入步骤(c)所得蛋黄，边加边搅拌，4℃静置5小时，酸化完成后，用低温连续离心机8000转/分钟离心15分钟，得上清。

(e)澄清：

将上清液转入另一反应罐中。在上清液中加入终浓度为0.3v/v％正辛酸，室温放置5-10小时。

本步骤的作用是：将卵黄中的粗蛋白和残渣等分离去除。

(f)过滤：

用0.5μm筒式滤芯过滤澄清，取滤液，再将滤液经孔径为0.22μm筒式滤芯过滤除菌，取滤液。

(g)浓缩：

经截留分子量为100KD的超滤膜将滤液浓缩5-10倍，得到浓缩液。

(h)半成品检验

抗体效价检测：采用前述鸡胚中和试验法，将前述步骤(g)的浓缩液2 倍系列稀释，测定Ⅰ型或Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒中和抗体，抗体效价均≥1:8192。

(i)辐照射：将浓缩液用

本步骤的作用是灭菌。

(j)抗体配制与分装：根据半成品中和抗体效价无菌混合组批，保证中和抗体效价≥1:8192。

将前述步骤(g)的浓缩液与冻干保护剂按照95ml：5g的用量比混合，充分摇匀，分装5ml/瓶。

冻干保护剂为：60wt％海藻糖、20wt％甘露醇、10wt％甘氨酸和10wt％ L-半胱氨酸的混合物，灭菌后使用。

分装后迅速进行冷冻真空干燥。冻干流程如下：

预冻：产品室温进箱，1小时将制品降至-40℃并维持6小时。

升华阶段：1小时将制品从-40℃升至-5℃并维持38小时。

解吸干燥阶段：1小时将制品从-5℃升至28℃并维持4小时，冻干全程 48小时。

所制备的卵黄抗体称作二价卵黄抗体。

实施例6.卵黄抗体成品检验

根据实施例5的方法分别独立地制备了3批二价卵黄抗体，进行下面的检验。

(a)性状：3批冻干二价卵黄抗体均呈微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加灭菌生理盐水溶解后，3批均为微黄色液体。

(b)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：用3批二价卵黄抗体分别接种TG和TSB培养基培养，均显示无细菌、霉菌污染。

(c)支原体检验：按现行《中国兽药典》附录的方法进行检验。

结果：琼脂固体平板培养3批二价卵黄抗体均无“煎蛋”状支原体菌落，液体培养基pH分别为7.48、7.45、7.47，表明无支原体污染。

(d)外源病毒检验：根据现行《中国兽药典》附录“外源病毒检验法”中“禽源细胞及其制品和其他禽源制品的检验”要求，采用鸡胚检查法和细胞检查法进行检测，均表明3批二价卵黄抗体无外源病毒污染。

实施例7.卵黄抗体安全性检验

根据实施例5的方法分别独立地制备了3批二价卵黄抗体，分别计做01 批、02批、03批。针对每批随机抽取5瓶为一个单元，每瓶用灭菌生理盐水将二价卵黄抗体稀释到80ml，保证采用前述鸡胚中和试验法测试，前述两种中和抗体效价均≥1:512，每ml为1羽份，将5瓶二价卵黄抗体注射液混合均匀后使用。进行下面的安全性检验。

试验用鸭：樱桃谷鸭。鸭场未使用过鸭病毒性肝炎疫苗，且未发生过鸭病毒性肝炎；蛋黄中鸭病毒性肝炎中和抗体效价<1:4的种蛋所孵化的雏鸭及其不同日龄的鸭。

鸭的饲养管理：对照鸭和各组试验鸭各单独饲养在一个舍，采用将试验各组鸭不同部位染色标记来加以区分。由试验人员饲养，每日进行观察。

试验用小白鼠：清洁级。

小白鼠的饲养管理：对照组和各试验组小白鼠单独饲养，并采用在笼壁贴标签标记来加以区分。由试验人员饲养，每日进行观察。

雏鸭参考健康检查标准：体重符合品种要求，群体整齐；脐部被腹绒毛覆盖，紧而干燥；腹部柔软，卵黄吸收良好，羽毛洁净而富有光泽；充满活力，精神好，反应灵敏；握在手中感触有弹性，挣扎有力，鸣声大。

种鸭参考健康检查标准：母鸭头中等大小，颈细长，眼亮有神，喙长而直，身长背阔，胸深腹圆，后躯宽大，耻骨开张，羽毛致密，两翼紧贴体躯，脚稍粗短，蹼大而厚，健康结实，体肥适中。

(1)最小使用日龄不同途径单剂量注射安全性试验

取1日龄健康樱桃谷鸭80只，随机分成8组，每组10只，雌雄各半并编号，分别称雏鸭体重并记录。每批二价卵黄抗体注射液分别肌肉和皮下注射1日龄健康易感雏鸭10只，0.5ml/只。同时设对照组1日龄雏鸭20只，皮下和肌肉各注射10只，每只注射生理盐水0.5ml。同条件下隔离饲养观察10日，记录结果。

结果：在试验观察期内，所有雏鸭精神状态良好，行为活动未见异常，采食、饮水和粪便均正常，与对照组无明显差异。在试验期间，所有试验用雏鸭均健活，无任何不良反应，与对照组无明显差异，安全性良好。平均日增重与对照组差异不显著；平均体重与对照组差异不显著；注射雏鸭按压后无局部反应，所有雏鸭在注射疫苗后，均未出现红肿、硬结和其它局部反应；系统剖检观察肝脏、脾脏、肾脏、心脏和胆囊，与对照组雏鸭相比均无明显变化。

(2)单剂量重复注射安全性试验

取4日龄健康樱桃谷鸭80只，随机分成8组，每组10只，雌雄各半并编号，分别称雏鸭体重并记录。每批二价卵黄抗体注射液分别肌肉和皮下注射4日龄健康易感雏鸭10只，0.5ml/只。在注射后48小时重复注射1 次，0.5ml/只，每次注射均不在同一部位。同时设对照组4日龄雏鸭20只，皮下和肌肉各注射10只，每只注射生理盐水0.5ml。同条件下隔离饲养观察10日，记录结果。

结果：在试验观察期内，所有雏鸭精神状态良好，行为活动未见异常，采食、饮水和粪便均正常，与对照组无明显差异。在试验期间，所有试验用雏鸭均健活，无任何不良反应，与对照组无明显差异，安全性良好。平均日增重与对照组差异不显著；平均体重与对照组差异不显著；注射雏鸭按压后无局部反应，所有雏鸭在注射疫苗后，均未出现红肿、硬结和其它局部反应；系统剖检观察肝脏、脾脏、肾脏、心脏和胆囊，与对照组雏鸭相比均无明显变化。

(3)超剂量不同途径注射安全性试验

取4日龄健康樱桃谷鸭80只，随机分成8组，每组10只，雌雄各半并编号，分别称雏鸭体重并记录。每批二价卵黄抗体注射液分别肌肉和皮下注射4日龄健康易感雏鸭10只，2.0ml/只。同时设对照组4日龄雏鸭20只，皮下和肌肉各注射10只，每只注射生理盐水2.0ml。同条件下隔离饲养观察10日，记录结果。

结果：在试验观察期内，所有雏鸭精神状态良好，行为活动未见异常，采食、饮水和粪便均正常，与对照组无明显差异。在试验期间，所有试验用雏鸭均健活，无任何不良反应，与对照组无明显差异，安全性良好。平均日增重与对照组差异不显著；平均体重与对照组差异不显著；注射雏鸭按压后无局部反应，所有雏鸭在注射疫苗后，均未出现红肿、硬结和其它局部反应；系统剖检观察肝脏、脾脏、肾脏、心脏和胆囊，与对照组雏鸭相比均无明显变化。

(4)对不同品种鸭的安全性试验

取4日龄健康樱桃谷鸭、麻鸭、北京鸭各40只，随机分成4组，每组 10只，雌雄各半并编号，分别称雏鸭体重并记录。针对每个品种的鸭，采用 01批二价卵黄抗体注射液分别肌肉和皮下注射4日龄健康易感雏鸭10只， 2ml/只。同时设对照组4日龄雏鸭20只，皮下和肌肉各注射10只，每只注射生理盐水2ml。同条件下隔离饲养观察10日，记录结果。

结果：在试验观察期内，所有雏鸭精神状态良好，行为活动未见异常，采食、饮水和粪便均正常，与对照组无明显差异。在试验期间，所有试验用雏鸭均健活，无任何不良反应，与对照组无明显差异，安全性良好。平均日增重与对照组差异不显著；平均体重与对照组差异不显著；注射雏鸭按压后无局部反应，所有雏鸭在注射疫苗后，均未出现红肿、硬结和其它局部反应；系统剖检观察肝脏、脾脏、肾脏、心脏和胆囊，与对照组雏鸭相比均无明显变化。

(5)对鸭生产性能的影响

取210日龄健康番鸭40只，随机分成4组，每组10只雌鸭并编号，分别观察种鸭采食并记录产蛋数。每批二价卵黄抗体注射液分别肌肉注射 210日龄健康易感雏鸭10只，2.0ml/只。同时设对照组210日龄雏鸭10只，每只肌肉注射生理盐水0.5ml。同条件下隔离饲养观察10日，记录结果。

结果：在试验观察期内，所有种鸭精神状态良好，行为活动未见异常，采食、饮水和粪便均正常，与对照组无明显差异。在试验期间，所有试验用种鸭均健活，无任何不良反应，与对照组无明显差异，安全性良好。平均日产蛋数与对照组差异不显著；注射种鸭按压后无局部反应，所有种鸭在注射疫苗后，均未出现红肿、硬结和其它局部反应。

(6)对非靶动物小白鼠安全性试验

每批二价卵黄抗体注射液分别皮下注射18～22g清洁级小白鼠10只，每只0.5ml。同时设健康对照10只，每只注射生理盐水0.5ml。同条件下隔离饲养观察10日。

结果：在试验观察期内，所有小白鼠精神状态良好，行为活动未见异常，采食、饮水和粪便均正常，与对照组无明显差异。在试验期间，所有试验用小白鼠均健活，无任何不良反应，与对照组无明显差异，安全性良好。注射小白鼠按压后无局部反应，所有小白鼠在注射疫苗后，均未出现红肿、硬结和其它可见局部反应；剖检观察肝脏、脾脏、肾脏、小肠和胆囊，与对照组小白鼠相比均无明显变化。

实施例8.卵黄抗体保护效力测试

使用的卵黄抗体注射液与实施例7的01批相同。

(1)鸭病毒性肝炎冻干卵黄抗体不同使用途径攻毒保护试验测试

取1日龄健康樱桃谷鸭90只，随机分成9组，每组10只，雌雄各半并编号，分别称雏鸭体重并记录。各取1组肌肉注射1.0ml二价卵黄抗体注射液，24h后肌肉注射鸭病毒性肝炎病毒Ⅰ型LS株强毒0.5ml(含100LD

表1.鸭病毒性肝炎冻干卵黄抗体不同使用途径攻毒保护试验测试及其结果

由此可见，本发明的二价卵黄抗体对Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒能够起到良好的预防效果，可用于临床。

(2)鸭病毒性肝炎冻干卵黄抗体最小预防剂量测试

取不同日龄北京鸭，每组10只，分别注射不同剂量的前述01批二价卵黄抗体注射液或生理盐水，24h后皮下注射鸭病毒性肝炎病毒Ⅰ型LS株强毒(含量200LD

表2.鸭病毒性肝炎冻干卵黄抗体最小预防剂量测试及其结果

由此可见，本发明的二价卵黄抗体对Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒能够起到良好的预防效果，可用于临床。

(3)鸭病毒性肝炎冻干卵黄抗体最小剂量治疗测试

取1日龄樱桃谷鸭120只，每只皮下注射0.5ml鸭病毒性肝炎病毒Ⅰ型 LS株强毒(含量200LD

取1日龄樱桃谷鸭120只，每只皮下注射0.5ml鸭病毒性肝炎病毒Ⅲ型 QZ株强毒(含量200LD50/ml)。在攻毒后48小时后，有98只鸭的症状为：精神萎靡，行动呆滞，翅膀下垂。将其中80只分为4组，每组20只，分别以前述01批二价卵黄抗体注射液做0.3ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml皮下注射。其余18只鸭作为空白对照组，不作任何治疗，同条件下隔离饲养观察10 日，记录鸭发病及死亡结果。

具体结果参见表3。

表3.鸭病毒性肝炎冻干卵黄抗体最小剂量治疗及其结果

由此可见，本发明的二价卵黄抗体对Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒患病呀能够起到良好的治疗效果，可用于临床。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。