一个参与调控番茄果实果尖果型和番茄红素合成的基因SlBSK1及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及参与番茄红素合成的基因SlBSK1及其用途，用于提高番茄果实中番茄红素和β‑胡萝卜素的含量，改善番茄果实果尖的形状；基因SlBSK1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所述。构建35S::SlBSK1::RNAi干扰载体时，干扰片段的核苷酸序列如SEQ ID No：2所述。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及番茄SlBSK1基因在番茄红素合成和调控番茄果实果尖性状中的作用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)作为一种重要的果蔬植物，在世界范围内广泛种植。因其色泽鲜艳，口味颇佳，同时具有很高的营养价值，越来越受到人们的喜爱。番茄果实色泽和形状是重要的商品性指标，培育果色鲜艳和果形周正的番茄品种，是番茄育种的一个重要研究课题。番茄果实的颜色，主要是由体内大量积累的类胡萝卜素中的番茄红素调控的。番茄红素是一种强抗氧化剂，具有天然色素功能，对许多疾病的预防具有重要功能，研究番茄红素的合成与调控对于改善果实品质具有重要意义。

BSK1是一个受体类细胞质膜蛋白激酶，在油菜素内酯信号转导过程中具有重要作用(Brassinosteroid Signaling Kinase1,BSK1)(Tang,Kim et al.2008)。有研究报道，BSK1在植物免疫系统中具有重要作用(Shi,Shen et al.2013,Yan,Zhao et al.2018,Zhao,Wu et al.2019)。在拟南芥中有12个BSK基因家族，它们在BR信号转导中具有正向调节作用(Sreeramulu,Mostizky et al.2013)。

参考文献：

1)Shi,H.,Q.Shen,Y.Qi,H.Yan,H.Nie,Y.Chen,T.Zhao,F.Katagiri and D.Tang(2013)."BR-SIGNALING KINASE1 physically associates with FLAGELLIN SENSING2and regulates plant innate immunity in Arabidopsis."Plant Cell 25(3):1143-1157。

2)Sreeramulu,S.,Y.Mostizky,S.Sunitha,E.Shani,H.Nahum,D.Salomon,L.B.Hayun,C.Gruetter,D.Rauh,N.Ori and G.Sessa(2013)."BSKs are partiallyredundant positive regulators of brassinosteroid signaling in Arabidopsis."Plant J 74(6):905-919。

3)Tang,W.,T.W.Kim,J.A.Oses-Prieto,Y.Sun,Z.Deng,S.Zhu,R.Wang,A.L.Burlingame and Z.Y.Wang(2008)."BSKs mediate signal transduction from thereceptor kinase BRI1 in Arabidopsis."Science 321(5888):557-560。

4)Yan,H.,Y.Zhao,H.Shi,J.Li,Y.Wang and D.Tang(2018)."BRASSINOSTEROID-SIGNALING KINASE1 Phosphorylates MAPKKK5 to Regulate Immunity inArabidopsis."Plant Physiol 176(4):2991-3002。

5)Zhao,Y.,G.Wu,H.Shi and D.Tang(2019)."RECEPTOR-LIKE KINASE902Associates with and Phosphorylates BRASSINOSTEROID-SIGNALING KINASE1 toRegulate Plant Immunity."Mol Plant 12(1):59-70。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一个参与番茄果实果尖形成和番茄红素合成的基因、蛋白质、以及相应的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一个参与番茄红素合成的基因SlBSK1，所述基因SlBSK1的核苷酸序列如SEQ ID No：1所述。基因编码的SlBSK1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所述。

作为本发明的参与番茄红素合成的基因SlBSK1的改进：构建35S::SlBSK1::RNAi干扰载体时，干扰片段的核苷酸序列如SEQ ID No：2所述。

本发明还同时提供了一种含有上述基因的质粒及植物干扰载体。

本发明还同时提供了上述基因SlBSK1的用途：用于提高番茄果实中番茄红素和β-胡萝卜素的含量，改善番茄果实果尖的形状。

本发明还同时提供了一种构建转基因番茄的方法：利用35S::SlBSK1::RNAi干扰载体构建转基因番茄；所述35S::SlBSK1::RNAi干扰载体的干扰片段的核苷酸序列如SEQID No：2所述，所述转基因番茄能够提高番茄红素和β-胡萝卜素的含量，改变番茄果实果尖的性状。

在番茄中，利用蛋白质组学方法发现BSK1(At4g35230)的同源基因SlBSK1(Solyc04g082260)在番茄果实发育过程中具有重要作用。通过对SlBSK1基因干扰载体构建、转基因技术获得转基因番茄，转基因植株番茄红素含量升高、果实果尖尖长，说明SlBSK1是一个参与番茄红素合成，调控果尖发育的受体激酶基因。在今后番茄育种中，提高番茄红素含量和改善果实外观性状方面，具有很好的应用前景。本发明能丰富果实成熟色素合成理论，为今后通过基因工程技术提高番茄红素含量提供理论依据。对于揭示番茄果实类胡萝卜素代谢机制以及利用分子育种技术提高番茄红素含量均具有重要意义。

综上所述，本发明首次构建了番茄SlBSK1基因沉默转基因植株，并进行功能研究。通过对转基因植株番茄果实颜色观察，发现SlBSK1基因在番茄红素生物合成过程中具有重要作用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是35S::SlBSK1::RNAi克隆载体图谱；

图2是35S::SlBSK1::RNAi干扰载体图谱；

图3是Micotom和35S::SlBSK1::RNAi-8转基因番茄果实的表型。

图4是SlBSK1基因沉默转基因植株番茄红素含量，即，35S::SlBSK1::RNAi-8转基因番茄在BR+11时期果实中番茄红素和β-胡萝卜素的含量(初提物)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

一、构建SlBSK1基因RNAi：

载体构建使用的均为Invitrogen公司pENTR

SlBSK1::RNAi-L:5’-TTTACAAGGGGAGGTTGCAG-3’

SlBSK1::RNAi-R:5’-GGGTTTGATTCTCCCAGTGA-3’

以番茄果实的cDNA为模板，通过PCR扩增得到序列片段(SEQ ID NO:2)。

PCR扩增体系为25ul：

Molecular Cloning Laboratones高保真酶Mix：12.5ul

引物SlBSK1::RNAi-L：1ul

引物SlBSK1::RNAi-R：1ul

模板番茄果实cDNA：1ul

去离子灭菌水：9.5ul；

PCR扩增程序为：95℃5分钟；35个循环：95℃，45秒钟，56℃，30秒钟，72℃，20秒钟；72℃，10分钟；

将上述所得基因特异的PCR产物(SEQ ID NO:2所述的序列片段)首先插入到克隆载体pENTR中，所得克隆载体35S::SlBSK1::RNAi的图谱见图1，载体的构建方法参照pENTR

然后通过Gateway LR反应交换重组到RNAi载体pK7GWIWG2(II)(图2)中，得35S::SlBSK1::RNAi干扰载体。Gateway LR反应交换重组法为：克隆到的质粒pENTR::SLBSK1:0.5ul，原始质粒pK7GWIWG2(II)1ul，1×TE buffer 1ul，放冰上2分钟，再加入0.5ul LR反应的酶(Proteinase K)，25℃过夜，然后在LR反应体系中加入0.3ul的蛋白酶K，于37℃，温育10分钟，终止反应，最后将所有的反应液用于转化大肠杆菌DH5α。

二、转基因番茄的构建与检测

构建好的双元载体通过番茄子叶侵染农杆菌，诱导愈伤，并进行抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗。将在抗生素-卡那霉素(50mg/L)的培养基上生长的转基因苗，进行筛选，初步选择能在含有抗生素培养基上生长的转基因苗为转基因植株，然后利用提取转基因植株叶片DNA进行PCR验证，PCR扩增所用引物为抗生素Kan LP/RP；

PCR扩增引物：

Kan-LP：AAGAACTCGTCAAGAAGGCGA；

Kan-RP：GCACGCAGGTTCTCCGGCCGC

PCR扩增体系20ul，

PCR反应的酶Mix：10ul

Kan-LP：1ul

Kan-RP：1ul

DNA模版：1ul

去离子灭菌水：7ul；

PCR扩增程序为：94℃5分钟；35个循环：94℃，45秒钟，55℃，30秒钟，72℃，1分钟；72℃，10分钟。从而得到RNAi转基因株系(35S::SlBSK1::RNAi转基因株系番茄)。上述方法可参照2017年Tan等人发表于Scientific reports，第7卷，1期，第8594页文章中的转基因番茄构建和检测方法进行。

三、转基因番茄中番茄红素和β-类胡萝卜素含量分析

野生型(Microtom)和35S::SlBSK1::RNAi转基因株系番茄植株待果实长到破色期(Break，BR)，开始取果实样品(外果皮)，每隔两天取一次，取BR，BR+3，BR+5，BR+7，BR+9和BR+11(图3)，一共6个时期的样品，取一定量果实组织进行研磨，利用丙酮/正己烷提取1h，利用分光光度计法测定初提物中各色素的含量(NAGATA and YAMASHITA,1992)。

根据35S::SlBSK1::RNAi转基因番茄中番茄红素及β-胡萝卜素的含量变化，分析其在番茄红素(或类胡萝卜素)生物合成中的作用。

35S::SlBSK1::RNAi-8转基因番茄在BR+11时期果实中番茄红素和β-胡萝卜素的含量增加(初提物)如图4所示；根据图3和图4，可获得以下总结性结论：SlBSK1基因参与调控番茄果实果尖果型发育，参与番茄红素生物合成过程，该基因沉默，可导致番茄红素和β-胡萝卜素含量增加。

因此，基因SlBSK1参与番茄红素合成，35S::SlBSK1::RNAi转基因番茄果实果尖性状变尖，果实变红，导致番茄红素含量增加。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一个参与调控番茄果实果尖果型和番茄红素合成的基因SlBSK1及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1497

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atgggttgtt gtcaatcttc aatcttgaag gagttgagct cagagaaaga tcagcgtcat 60

ggggtggtaa acgcacgagc ttctaacggc accggcgccg gagctgctgt cggagatggt 120

ggggttccgg tgttttctga gttttcgctt tctgagctca aagcagctac gaataacttc 180

agttcagaat ttattgtttc tgaaagtgga gaaaaggctc cgaatatggt ttacaagggg 240

aggttgcaga atcggcggtg gatcgctgtt aagaagttta ctaaatcggc atggcctgat 300

cctaaacagt ttgcggatga agcatcaggt gttggaaatt tgaggcataa aaggctggct 360

aatttaattg ggtactgctc tgatggggat gagaggttgc ttgtagctga gtacatgcca 420

aatgatacac ttgcaaagca tctatttcac tgggagaatc aaacccttga gtgggctatg 480

cgtttaagag tggctctata tattgctgaa gcattggact actgtagcag tgaaggtcga 540

ccactatacc atgacttgaa tgcatataga gttctctttg atgagagtgg cgatccccgt 600

ctttcttgtt ttgggctgat gaaaaatagc agggatggta aaagttatag cacgaacctt 660

gcgtatacac ctcctgagta tttaagaaat ggaagagtca ctcaagaaag tgttgttttc 720

agctatggaa ctgtcctttt ggacttgcta agtggaaaac atattcctcc tggtcatgca 780

ctcgatatga tacggggaaa aaacattctt ctattaatgg attcacattt ggagggaaat 840

ttctctacag aagaggcaac tgttgtattt gatctggctt cacgatgctt acagtatgaa 900

cccagggagc gaccaaatac caaagacctc gtttcaacac ttggtccatt gcaaagcaaa 960

cctgatgttg catctcatgt aatgttgggt attcccaaga gtgaggaagc tccaccaact 1020

ccacagcacc ctctttctgc aatgggtgat gcttgttcga gaatggatct cacagctatt 1080

catcagattt tggtaatgac acattataaa gacgatgaac tgacaaatga gttgtctttc 1140

caagagtgga ctcaacaaat gagggatatg ttagaggcaa gaaagcgtgg tgacttggca 1200

tttcgggaca aggactttaa aactgccata gattgctatt ctcagtttgt agatgtggga 1260

acgatggtgt ctccaactgt ttatgcacga agaagccttt gttatctcat gtgtgatcaa 1320

ccagatgctg cccttagaga tgcaatgcaa gcacaatgtg ttcacccaga ctggtcaact 1380

gcattttaca tgcaggcagt tgccctgtcg aagctagaca tgcacaaaga tgcagctgac 1440

atgttgaatg aggctgcaat tctagaagag aaaagacgcg gagggcgtgc atcttga 1497

<210> 2

<211> 237

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

tttacaaggg gaggttgcag aatcggcggt ggatcgctgt taagaagttt actaaatcgg 60

catggcctga tcctaaacag tttgcggatg aagcatcagg tgttggaaat ttgaggcata 120

aaaggctggc taatttaatt gggtactgct ctgatgggga tgagaggttg cttgtagctg 180

agtacatgcc aaatgataca cttgcaaagc atctatttca ctgggagaat caaaccc 237

<210> 3

<211> 498

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

Met Gly Cys Cys Gln Ser Ser Ile Leu Lys Glu Leu Ser Ser Glu Lys

1 5 10 15

Asp Gln Arg His Gly Val Val Asn Ala Arg Ala Ser Asn Gly Thr Gly

20 25 30

Ala Gly Ala Ala Val Gly Asp Gly Gly Val Pro Val Phe Ser Glu Phe

35 40 45

Ser Leu Ser Glu Leu Lys Ala Ala Thr Asn Asn Phe Ser Ser Glu Phe

50 55 60

Ile Val Ser Glu Ser Gly Glu Lys Ala Pro Asn Met Val Tyr Lys Gly

65 70 75 80

Arg Leu Gln Asn Arg Arg Trp Ile Ala Val Lys Lys Phe Thr Lys Ser

85 90 95

Ala Trp Pro Asp Pro Lys Gln Phe Ala Asp Glu Ala Ser Gly Val Gly

100 105 110

Asn Leu Arg His Lys Arg Leu Ala Asn Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Asp

115 120 125

Gly Asp Glu Arg Leu Leu Val Ala Glu Tyr Met Pro Asn Asp Thr Leu

130 135 140

Ala Lys His Leu Phe His Trp Glu Asn Gln Thr Leu Glu Trp Ala Met

145 150 155 160

Arg Leu Arg Val Ala Leu Tyr Ile Ala Glu Ala Leu Asp Tyr Cys Ser

165 170 175

Ser Glu Gly Arg Pro Leu Tyr His Asp Leu Asn Ala Tyr Arg Val Leu

180 185 190

Phe Asp Glu Ser Gly Asp Pro Arg Leu Ser Cys Phe Gly Leu Met Lys

195 200 205

Asn Ser Arg Asp Gly Lys Ser Tyr Ser Thr Asn Leu Ala Tyr Thr Pro

210 215 220

Pro Glu Tyr Leu Arg Asn Gly Arg Val Thr Gln Glu Ser Val Val Phe

225 230 235 240

Ser Tyr Gly Thr Val Leu Leu Asp Leu Leu Ser Gly Lys His Ile Pro

245 250 255

Pro Gly His Ala Leu Asp Met Ile Arg Gly Lys Asn Ile Leu Leu Leu

260 265 270

Met Asp Ser His Leu Glu Gly Asn Phe Ser Thr Glu Glu Ala Thr Val

275 280 285

Val Phe Asp Leu Ala Ser Arg Cys Leu Gln Tyr Glu Pro Arg Glu Arg

290 295 300

Pro Asn Thr Lys Asp Leu Val Ser Thr Leu Gly Pro Leu Gln Ser Lys

305 310 315 320

Pro Asp Val Ala Ser His Val Met Leu Gly Ile Pro Lys Ser Glu Glu

325 330 335

Ala Pro Pro Thr Pro Gln His Pro Leu Ser Ala Met Gly Asp Ala Cys

340 345 350

Ser Arg Met Asp Leu Thr Ala Ile His Gln Ile Leu Val Met Thr His

355 360 365

Tyr Lys Asp Asp Glu Leu Thr Asn Glu Leu Ser Phe Gln Glu Trp Thr

370 375 380

Gln Gln Met Arg Asp Met Leu Glu Ala Arg Lys Arg Gly Asp Leu Ala

385 390 395 400

Phe Arg Asp Lys Asp Phe Lys Thr Ala Ile Asp Cys Tyr Ser Gln Phe

405 410 415

Val Asp Val Gly Thr Met Val Ser Pro Thr Val Tyr Ala Arg Arg Ser

420 425 430

Leu Cys Tyr Leu Met Cys Asp Gln Pro Asp Ala Ala Leu Arg Asp Ala

435 440 445

Met Gln Ala Gln Cys Val His Pro Asp Trp Ser Thr Ala Phe Tyr Met

450 455 460

Gln Ala Val Ala Leu Ser Lys Leu Asp Met His Lys Asp Ala Ala Asp

465 470 475 480

Met Leu Asn Glu Ala Ala Ile Leu Glu Glu Lys Arg Arg Gly Gly Arg

485 490 495

Ala Ser