一种3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物及其制备方法与应用

摘要

本发明提供一种3,4‑二氢嘧啶苯甲腈衍生物及其制备方法与应用。本发明首次公开了采用原研专利所述路线制备苯甲酸阿格列汀的过程中，产生的特定杂质(RRT＝1.22的杂质)的结构。该系列杂质具有警示结构，需要按照遗传毒性杂质的相关限度检测其在苯甲酸阿格列汀成品中的含量。本发明还提供高纯度式(A)化合物的制备及纯化方法，以及该杂质化合物在苯甲酸阿格列汀药品中含量的检测方法，从而实现对苯甲酸阿格列汀药品的质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及化药领域，具体地说，涉及一种3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

苯甲酸阿格列汀是基于DPP-4抑制剂机制的治疗II型糖尿病的药物。原研专利WO2007035629A2中保护的合成路线(图1)，具有原料廉价易得，反应步骤少，后处理简单且产物纯度高等特点。因此该路线被国内工业化大生产普遍采用。

多批次检测发现，采用该路线制备2a化合物的过程中，会不可避免地产生一个RRT＝1.22的杂质，含量在0.8％-1.2％之间。目前尚未见对该杂质的研究报道，亟需对该杂质进行全面系统地研究以期降低其在苯甲酸阿格列汀药品中的含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物及其制备方法与应用。

本发明的另一目的是提供3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物在苯甲酸阿格列汀药品中含量的检测方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物，结构如式(A)所示：

其中：R

R

优选地，3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物的结构如式(1A)所示：

优选地，3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物的结构如式(2A)所示：

优选地，3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物的结构如式(3A)所示：

第二方面，本发明提供式(A)化合物的制备方法，合成路线见图2。包括以下步骤：

(1)式(i)化合物与式(ii)化合物在碱存在条件下反应生成式(iii)化合物；

(2)式(iii)化合物与卤代试剂反应得到式(A)化合物。

其中，式(i)、式(ii)和式(iii)化合物的结构分别如下：

步骤(1)反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂可选自二氯甲烷、甲苯、乙腈、二甲苯、N’N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等中的至少一种，优选甲苯或乙腈。

所述碱可以是无机碱或有机碱；所述无机碱可选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾等中的至少一种，优选碳酸钠；所述有机碱可选自甲胺、三乙胺，三正丁胺、二异丙基乙基、N,N-二甲氨基吡啶、N,N-二甲氨基苯胺等中的至少一种，优选三乙胺。

步骤(1)反应温度为30℃-110℃，优选80℃。

实际研发过程中步骤(1)不同条件下反应的转化率(收率)见表1。

表1

注：收率为0表示该条件下无化学反应。

步骤(2)反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂选自溶剂二氯甲烷、二氯乙烷、甲苯、乙腈、二甲苯、N’N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等中的至少一种，优选二氯甲烷或甲醇。

步骤(2)反应温度为40-100℃，优选80℃。

实际研发过程中步骤(2)不同条件下反应的转化率(收率)见表2。

表2

注：收率为0表示该条件下无化学反应。

步骤(1)中式(i)化合物与式(ii)化合物的摩尔比为1:1-3。

步骤(2)中式(iii)化合物与卤代试剂的摩尔比为1:1-3。

式(1A)化合物的制备方法包括：将45ml二氯乙烷与10.9mmol化合物M1加入反应器中，搅拌下加入13.1mmol NBS和0.5mmol AIBN，将反应液升温至40-80℃保温2-6h，然后于冰水浴中降温至20-30℃(优选地，将反应液升温至80℃保温3h，然后于冰水浴中降温至20℃)；向反应体系中加入30ml水，搅拌洗涤后，收集下层有机相，然后用15ml 5％NaHCO

其中，化合物M1的结构如下：

不同浓度的PE和EA混合液分别为：PE:EA＝3:1，PE:EA＝2:1，PE:EA＝1:1。

式(2A)化合物的制备方法，包括：将14.1mmol化合物1A与40ml甲醇加入到反应器中，搅拌溶清后加入28.2mmol K

式(3A)化合物的制备方法，包括：将45ml二氯乙烷与14.7mmol化合物M2(即阿格列汀)加入到反应器中，搅拌下加入20.8mmol NBS与0.7mmol AIBN，加热至40-80℃，保温反应2-6h，然后冰水浴下降温至20-30℃(优选地，加热至80℃，保温反应4h，然后冰水浴下降温至20℃)；向反应液中加入30ml水，搅拌洗涤后，收集下层有机相，继续用15ml 5％NaHCO

其中，化合物M2的结构如下：

第三方面，本发明提供所述3,4-二氢嘧啶苯甲腈衍生物在苯甲酸阿格列汀药品生产质量控制中的应用。

第四方面，本发明提供式(A)化合物在苯甲酸阿格列汀中含量的检测方法，包括：

1)将待测样品配制成溶液加到反相高效液相色谱柱(RP-HPLC)；

2)用流动相梯度洗脱所述样品；

3)用紫外检测器检测色谱柱流出液，以检测：

①对应于苯甲酸阿格列汀的信号峰；

②对应于待测样品中的一种或多种杂质的信号峰；

4)根据所检测的信号峰的峰面积来计算待测样品中的杂质含量。

步骤1)中用稀释溶剂将待测样品配制成溶液，所述稀释溶剂为：0.02-0.03mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.2-4.1)和乙腈按(80-90)：(10-20)体积比的混合液；优选地，所述稀释溶剂为：0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至4.0)和乙腈按86:14体积比的混合液。

色谱条件：

检测波长：277nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。进样量：20μl。

步骤2)中梯度洗脱使用的流动相：

A相：0.02-0.03mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.2-4.1)，优选0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至4.0)；

B相：乙腈。

梯度洗脱程序见表3。

表3

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次公开了采用原研专利所述路线制备苯甲酸阿格列汀的过程中，产生的特定杂质(RRT＝1.22的杂质)的结构。该系列杂质具有警示结构，需要按照遗传毒性杂质的相关限度检测其在苯甲酸阿格列汀成品中的含量。本发明还提供高纯度式(A)化合物的制备及纯化方法，以及该杂质化合物在苯甲酸阿格列汀药品中含量的检测方法，从而实现对苯甲酸阿格列汀药品的质量控制。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中原研专利中苯甲酸阿格列汀的合成路线。RRT1.22是中间产品1中该杂质的相对保留时间。

图2为本发明式(A)化合物的合成路线。

图3为本发明较佳实施例中式(1A)化合物的合成路线。

图4为本发明较佳实施例中式(2A)化合物的合成路线。

图5为本发明较佳实施例中式(3A)化合物的合成路线。

图6为本发明较佳实施例中式(1A)化合物的HPLC分析结果。41.889min处的峰为(1A)化合物。

图7A～图7D为本发明较佳实施例中式(1A)化合物的MS分析结果。

图8为本发明较佳实施例中式(1A)化合物的HNMR分析结果。

图9为本发明较佳实施例中式(2A)化合物的HPLC分析结果。37.634min处的峰为(2A)化合物。

图10A和图10B为本发明较佳实施例中式(2A)化合物的MS分析结果。

图11为本发明较佳实施例中式(2A)化合物的HNMR分析结果。

图12A和图12B为本发明较佳实施例中式(3A)化合物的HPLC分析结果。15.426min处的峰为(3A)化合物。

图13A～图13D为本发明较佳实施例中式(3A)化合物的MS分析结果。

图14为本发明较佳实施例中式(3A)化合物的HNMR分析结果。

具体实施方式

本发明术语：

RRT(Relative Retention Time)，相对保留时间，是某组分的校正保留时间与相应标样的校正保留时间之比。

NBS：N-溴代琥珀酰亚胺；

AIBN：偶氮二异丁腈；

PE：石油醚；

EA：乙酸乙酯；

MTBE：甲基叔丁基醚。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

柱层析法所用的层析柱为硅胶柱，购自青岛海洋化工厂，型号为GF254。

以下实施例制备的式(A)化合物见表4：

表4

实施例1式(1A)化合物的制备：2-((5-溴-6-氯-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯甲腈

式(1A)化合物的合成路线见图3。具体方法如下：

将二氯乙烷(45ml)与化合物M1(3.00,10.9mmol)投入到三口瓶中，搅拌下加入NBS(2.33g,13.1mmol)与AIBN(0.09g,0.5mmol)，开启加热，将反应液升温至80℃保温3h，关闭加热，冰水浴下降温至20℃。反应液加入30ml水，搅拌洗涤后，收集下层有机相，继续用15ml5％NaHCO

该杂质经制备液相色谱分离后(HPLC分析结果见图6)进行MS分析(MS分析结果见图7A～图7D)，确定其分子量和特征官能团，初步推断出其结构，接下来通过制备该杂质，经过HPLC定位和HNMR信息解析出该杂质的准确结构(HNMR分析结果见图8)。

实施例2式(2A)化合物的制备：2-((5-溴-6-甲氧基-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯甲腈

式(2A)化合物的合成路线见图4。具体方法如下：

将化合物1A(5g,14.1mmol)与40ml甲醇加入到三口瓶中，搅拌溶清后加入K

该杂质经制备液相色谱分离后(HPLC分析结果见图9)进行MS分析(MS分析结果见图10A和图10B)，确定其分子量和特征官能团，初步推断出其结构，接下来通过制备该杂质，经过HPLC定位和HNMR信息解析出该杂质的准确结构(HNMR分析结果见图11)。

实施例3式(3A)化合物的制备：(R)-2-((6-(3-氨基哌啶-1-基)-5-溴-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯甲腈

式(3A)化合物的合成路线见图5。具体方法如下：

将二氯乙烷(45ml)与化合物M2(5.00,14.7mmol)投入到三口瓶中，搅拌下加入NBS(3.70g,20.8mmol)与AIBN(0.09g,0.7mmol)，开启加热，将反应液升温至80℃保温4h，关闭加热，冰水浴下降温至20℃。反应液加入30ml水，搅拌洗涤后，收集下层有机相，继续用15ml5％NaHCO

化合物M2(即阿格列汀)的结构如下：

该杂质经制备液相色谱分离后(HPLC分析结果见图12A和图12B)进行MS分析(MS分析结果见图13A～图13D)，确定其分子量和特征官能团，初步推断出其结构，接下来通过制备该杂质，经过HPLC定位和HNMR信息解析出该杂质的准确结构(HNMR分析结果见图14)。

实施例4杂质2-((5-溴-6-氯-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯甲腈(1A)在苯甲酸阿格列汀中的定量检测

1.试药与试剂：乙腈、纯化水、磷酸二氢钾、磷酸。

2.仪器与设备：电子分析天平、Thermo Hypersil GOLD C18(4.6×250mm，5μm)、高效液相色谱仪(UV检测器)等。

3.色谱条件

1、HPLC法，外标法计算结果。

2、色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(4.6mm×250mm，5μm)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

色谱条件如下：

检测波长：277nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：30℃。

3、流动相：A相：0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至4.0)；B相：乙腈。梯度洗脱程序见表3。

4.溶液配制

取实施例1制备的式(1A)化合物纯品适量，精密称定，加适量乙腈溶解后再用稀释溶剂稀释制成每1ml中约含式(1A)杂质0.2μg的溶液，作为对照品溶液。另取苯甲酸格列汀适量，精密称定，加稀释溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含苯甲酸阿格列汀5mg的溶液，作为供试品溶液。

稀释溶剂：0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至4.0)和乙腈按86:14体积比的混合液。

5.测定方法(外标法)

精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质1A峰，按外标法以峰面积计算，式(1A)杂质含量不应超过40ppm。

6.计算公式

其中，S

将结果带入公式，杂质1A在苯甲酸阿格列汀中的检出量最大为6.2ppm，低于限度阈值的30％(12ppm)。

实施例5杂质2-((5-溴-6-甲氧基-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯甲腈(2A)在苯甲酸阿格列汀中的定量检测

1.试药与试剂：乙腈、纯化水、磷酸二氢钾、磷酸。

2.仪器与设备：电子分析天平、Thermo Hypersil GOLD C18(4.6×250mm，5μm)、高效液相色谱仪(UV检测器)等。

3.色谱条件

1、HPLC法，主成分对照法计算结果。

2、色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(4.6mm×250mm，5μm)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

色谱条件如下：

检测波长：277nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：30℃。

3、流动相：A相：0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至4.0)；B相：乙腈。梯度洗脱程序见表3。

4.溶液配制

取苯甲酸阿格列汀适量，精密称定，加稀释溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含苯甲酸阿格列汀0.4mg的溶液，作为供试品溶液；另取苯甲酸阿格列汀对照品适量，精密称定，加稀释溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含苯甲酸阿格列汀0.4μg的溶液，作为对照品溶液。

稀释溶剂：0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至4.0)和乙腈按86:14体积比的混合液。

5.测定方法(外标法)

精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质2A峰，按主成分(苯甲酸阿格列汀)外标法以峰面积计算，式(2A)杂质含量不应超过0.10％。

6.计算公式

其中S

将结果带入公式，表明杂质2A在苯甲酸阿格列汀中的含量均未检出。

实施例6杂质(R)-2-((6-(3-氨基哌啶-1-基)-5-溴-3-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)甲基)苯甲腈(3A)在苯甲酸阿格列汀中的定量检测

1.试药与试剂：乙腈、纯化水、磷酸二氢钾、磷酸。

2.仪器与设备：电子分析天平、Thermo Hypersil GOLD C18(4.6×250mm，5μm)、高效液相色谱仪(UV检测器)等。

3.色谱条件

1、HPLC法，主成分对照法计算结果。

2、色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(4.6mm×250mm，5μm)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

色谱条件如下：

检测波长：277nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：30℃。

3、流动相：A相：0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至4.0)；B相：乙腈。梯度洗脱程序见表3。

4.溶液配制

取苯甲酸阿格列汀适量，精密称定，加稀释溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含苯甲酸阿格列汀0.4mg的溶液，作为供试品溶液；另取苯甲酸阿格列汀对照品适量，精密称定，加稀释溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含苯甲酸阿格列汀0.4μg的溶液，作为对照品溶液。

稀释溶剂：0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至4.0)和乙腈按86:14体积比的混合液。

5.测定方法(外标法)

精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质3A峰，按主成分(苯甲酸阿格列汀)外标法以峰面积计算，式(3A)杂质含量不应超过0.10％。

6.计算公式

其中S

将结果带入公式，表明杂质3A在苯甲酸阿格列汀中的含量均未检出。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。