一种扩增鼠单抗重轻链基因序列的方法及其引物和筛选该引物的方法

摘要

本申请公开了一种扩增鼠单抗重轻链基因序列的方法及其引物，以及筛选所述引物的方法，其中，各复合引物所用的正向引物均为组合物，所述复合引物通过预先筛除可扩增非功能性基因序列的引物对而得，并且，每组正向引物均已剔除扩增Sp2/0细胞非功能轻链基因的引物，采用本申请提供的复合引物进行PCR扩增，所得引物无需做TA克隆，而是能够满足测序的纯度要求，进一步地，采用本申请提供的复合引物能够减少扩增管的数量，简化扩增操作，使PCR扩增的操作更为简单方便。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及扩增小鼠杂交瘤细胞中单克隆抗体重、轻链基因序列的方法及其引物，以及筛选所述引物的方法。

背景技术

单克隆抗体在生物医学领域应用广泛，同时在体外诊断(In Vitro Diagnosis，IVD)等领域发挥重要作用。从杂交瘤细胞中通过基因测序技术获得抗体重、轻链序列，是进行单抗资源永久保存、构建重组抗体以及进行抗体体外亲和力成熟等操作的首要步骤。

用于杂交瘤细胞融合的Sp2/0细胞中含有内源性非功能基因，这些序列不能有效翻译成蛋白质，因此，从杂交瘤细胞中扩增抗体轻链基因序列时，所述内源性非功能基因序列会产生假阳性干扰。

目前，多种策略被用于从杂交瘤细胞中扩增轻链抗体基因，其中最常用是采用限制性内切酶方法去除内源性非功能基因，但这种方法操作复杂并且效率不高；另一种方法是将扩增产物构建TA克隆，再将TA克隆后纯化所得多个克隆分别进行测序鉴定，排除内源性非功能基因，但是，这种方法同样费时费力。

发明内容

本申请提供一种扩增鼠单克隆抗体，特别是鼠单克隆抗体IgG重轻链基因的方法及所用的复合引物，所述方法使用特定复合引物，能够避免内源性非功能基因产生假阳性干扰，采用本申请提供的方法扩增所得产物较为纯净，目标扩增产物的含量较高，可直接用于测序研究。

本申请的目的在于提供鼠单抗kappa链扩增第一复合引物，所述鼠单抗kappa链扩增第一复合引物用于扩增鼠单克隆抗体kappa链，具体地，所述鼠单抗kappa链扩增第一复合引物包括第一正向扩增引物组KFA和kappa链反向扩增引物KR，其中，所述KFA来源于Antibody engineering。

在一种可实现的方式中，所述KFA包括以下引物：

KFA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

KFA2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

KFA3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

KFA4：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

KFA5：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

KFA6：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；和

KFA7：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述KFA中各引物等量组合。

进一步地，所述KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本申请的另一目的在于提供鼠单抗kappa链扩增第二复合引物，所述鼠单抗kappa链扩增第二复合引物也用于扩增鼠单克隆抗体kappa链，具体地，所述鼠单抗kappa链扩增第二复合引物包括kappa链第二正向扩增引物组KFB和kappa链反向扩增引物KR，其中，所述KFB来源于IMGT/PRIMER-DB。

在一种可实现的方式中，所述KFB包括以下以引物：

KFB1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

KFB2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

KFB3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

KFB4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

KFB5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

KFB6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

KFB7，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

KFB8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

KFB9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

KFB10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

KFB11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

KFB12，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

KFB13，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；和

KFB14，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。

在一种可实现的方式中，所述KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本申请的目的还在于提供一种鼠单抗lamda链扩增复合引物，所述鼠单抗lamda链扩增复合引物包括lamda链正向扩增引物组LFC和lamda链反向扩增引物LR，其中，所述LFC包括：

LFC1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；和

LFC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

进一步地，LFC中各引物等量组合。

在一种可实现的方式中，所述LR的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

本申请的目的还在于提供一种重链扩增复合引物，所述重链扩增复合引物包括重链正向扩增引物组HFA和重链反向扩增引物HR，所述HFA来源于Antibody engineering。

在一种可实现的方式中，所述HFA包括：

HFA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；

HFA2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；

HFA3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；

HFA4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；

HFA5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；

HFA6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；

HFA7，其核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；

HFA8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；

HFA9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；

HFA10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；

HFA11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；

HFA12，其核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；

HFA13，其核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；

HFA14，其核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；和

HFA15，其核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示。

进一步地，HFA中各引物等量组合。

在一种可实现的方式中，所述HR来源于小鼠IgG1抗体、IgG2a抗体、IgG2b抗体和IgG3抗体在恒定区CH1部分的共同基因序列。

进一步地，所述HR的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示。

本申请还提供一种扩增试剂盒，所述试剂盒包含前述引物，具体地，包括kappa链扩增第一复合引物、kappa链扩增第二复合引物、lamda链扩增复合引物和重链扩增复合引物中的至少一种。

本申请还提供一种获得鼠单抗重轻链的方法，所述方法包括：以鼠cDNA为模板，利用鼠单抗轻链引物和鼠单抗重链引物分别扩增轻链基因和重链基因，其中，所述鼠单抗轻链引物如前所述KFA、KFB或者LFC，所述鼠单抗重链引物如前所述HFA。

进一步地，所述方法在扩增轻链基因和重链基因之后还包括：

利用扩增所得轻链基因样本和重链基因样本进行抗体测序；

利用数据库查找已测抗体序列在基因组位置，确定其前导肽序列。

可选地，所述这数据库为IMGT数据库。

在本申请中，确定前导肽序列的方法可以为现有技术中任意一种根据抗体序列在基因组中位置而确定前导肽序列的方法。

本申请还提供一种筛选所述复合引物的方法，所述方法包括：

使用多对候选引物对分别以sp2/0cDNA为模板进行PCR扩增；

对由各对候选引物对的PCR扩增结果进行电泳检测，剔除可扩增sp2/0cDNA非功能基因的候选引物对。

在一种可实现的方式中，根据电泳检测结果组成复合引物，所述复合引物包括筛选结果呈阴性的正向引物和反向引物，所述结果呈阴性的正向引物为不可扩增sp2/0cDNA非功能基因的候选引物对，所述结果呈阴性是指电泳检测结果中无非功能基因扩增产物条带。

在一种可实现的方式中，每对候选引物对包括一个正向引物和一个反向引物。

在一种可实现的方式中，所述多对候选引物对为同源候选引物对。

在一种可实现的方式中，同源候选引物对的反向引物相同。

更进一步地，所述候选引物对可以源自Antibody engineering或者IMGT/PRIMER-DB。

与现有技术相比，本申请提供的各复合引物所用的正向引物均为组合物，其中，每组用于扩增轻链的正向引物均已剔除可扩增sp2/0细胞非功能轻链基因的引物，采用本申请提供的轻链复合引物进行PCR扩增，所得引物无需做TA克隆，而是能够满足测序的纯度要求，进一步地，采用本申请提供的复合引物能够减少扩增管的数量，简化扩增操作，使PCR扩增的操作更为简单方便。

附图说明

图1示出使用第一组候选引物对以sp2/0cDNA为模板进行PCR后电泳的结果；

图2示出使用第二组候选引物对以sp2/0cDNA为模板进行PCR后电泳的结果；

图3示出实施例1中PCR产物的电泳结果；

图4示出VL基因部分片段测序峰形图；

图5示出VH基因部分片段测序峰形图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。

下面通过具体的实施例对本申请提供的扩增小鼠杂交瘤细胞中单克隆抗体IgG重、轻链基因的方法及其引物进行详细阐述。

在本实例中，所涉及的简并碱基包括S:G/C，R:A/G，N:A/T/C/G，M:A/C，Y:C/T，W:A/T，V:G/A/C。

在本实例中，本申请人认为来源于sp2/0的非功能基因序列如SEQ ID NO.42所示，该基因属于抗体kappa链，由于该链上存在基因突变导致阅读框移码，因此，该基因序列无法翻译出目标产物，即，轻链蛋白产物，反而能够作为PCR模板干扰目的抗体的基因扩增。

在本实例中，使用第一组候选引物对分别以sp2/0cDNA为模板进行扩增，其中，所述候选引物对源自Antibody engineering，其中，正向引物包括12条，反向引物包括1条，各正向引物的核苷酸序列具体如下：

K1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

K2的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；

K3的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示；

K4的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示；

K5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

K6的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

K7的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示；

K8的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

K9的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

K10的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示；

K11的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

K12的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述反向引物KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本实例中，根据KR引物根据kappa链恒定区序列设计而得。

上述正向引物分别与反向引物组合，形成12对候选引物对，分别使用所得候选引物对进行PCR扩增，扩增条件如下：

step1：95℃ 3分钟，

step2：95℃ 30秒，

step3：55℃ 30秒，

step4：72℃ 30秒，

step5：72℃ 3分钟，

step6：10℃ 保持，

step 2至step4循环35次。

将扩增结果进行电泳检测，结果如图1所示，由图1可知，第2、3、4、7和10号物扩增所得产物均为非功能基因，具有假阳性干扰，而第11号引物扩增所得产物中的条带为模板不纯导致，重新进行PCR该泳道无条带，因此，筛除2、3、4、7、10号引物，其余正向引物组合为第一正向扩增引物组KFA，具体地，各正向引物的序列号依次如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7所示。

特别地，所述第一正向扩增引物组KFA中各引物等量组合。

在本实例中，使用第二组候选引物对以sp2/0cDNA为模板进行扩增，其中，所述候选引物源对自IMGT/PRIMER-DB，其中，正向引物包括19条，反向引物包括1条，各正向引物的核苷酸序列具体如下：

IMGTK1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

IMGTK2的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；

IMGTK3的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

IMGTK4的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

IMGTK5的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示；

IMGTK6的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

IMGTK7的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

IMGTK8的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

IMGTK9的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

IMGTK10的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

IMGTK11的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

IMGTK12的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示；

IMGTK13的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

IMGTK14的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

IMGTK15的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

IMGTK16的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

IMGTK17的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

IMGTK18的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示；

IMGTK19的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示。

所述反向引物KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

上述正向引物分别与反向引物组合，形成19对候选引物对，分别使用所得候选引物对进行PCR扩增，扩增条件如下：

step1：95℃ 3分钟，

step2：95℃ 30秒，

step3：55℃ 30秒，

step4：72℃ 30秒，

step5：72℃ 3分钟，

step6：10℃ 保持，

step 2至step4循环35次。

将扩增结果进行电泳检测，结果如图2所示，由图2可知，第2、5、12、18和19号引物扩增所得产物均为非功能基因，具有假阳性干扰，而第1号和第9号引物扩增所得产物中的条带为模板不纯导致，重新进行PCR所述两长泳道无条带，因此，筛除2、5、12、18和19号引物，其余引物组合为第二正向扩增引物组KFB，具体地，所述第二正向扩增引物组KFB中各引物的序列如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.22所示。

由于lamda链的PCR过程不会受到非功能基因的干扰，因此，在本实例中，lamda链正向扩增引物组LFC中各引物的序列号依次如SEQ ID NO.23至SEQ ID NO.24所示。

可选地，LFC中各引物等量组合。

进一步地，所述lamda链扩增复合引物还包括lamda链反向扩增引物LR，所述LR的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

本申请人发现，使上述lamda链引物组合物进行lamda链扩增，能够减少扩增管的数量，在单管中即可扩增出lamda链，并且，所得lamda链纯净，可直接用于测序。

与lamda链的PCR过程相似地，重链的PCR过程不会受到非功能基因的干扰，因此，在本实例中，重链正向扩增引物组HFA来源于Antibody engineering，具体地，各引物的序列号依次如SEQ ID NO.26至SEQ ID NO.40所示。

在本实例中，本申请人将小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体恒定区CH1的基因进行序列比对，选取序列高度相似的区域设计重链反向扩增引物HR，所述HR的核苷酸序列表如SEQ ID NO.41所示。

本申请人发现，使上述重链引物组合物进行重链扩增，能够减少扩增管的数量，在单管中即可扩增出重链，并且，所得重链纯净，可直接用于测序。

实施例

抗PCT单克隆抗体细胞株2D8，提取总RNA，由于Oligo dt与mRNA3'端的poly(A)尾巴能够特异性结合，仅mRNA可被反转录，因此，本实例选用Oligo dT作为引物，进行逆转录生成cDNA，再以cDNA作为模板进行PCR扩增。

按照下表1中配制PCR体系，PCR反应条件设置如下：

step1 95℃ 3分钟

step2 95℃ 30秒

step3 55℃ 30秒

step4 72℃ 30秒

step5 72℃ 3分钟

step6 10℃ 保持

step 2—step4循环35次。

表1

按照前述方法进行PCR，反应结束后加Loading buffer进行核酸电泳，结果如图3所示，由图3可知，本实例使用kappa轻链的两种组合引物以及重链的组合引物均可以成功扩增出抗体对应可变区基因。

再将各PCR产物送测序公司进行基因测序，1#PCR管产物和2#PCR管产物为VL，使用引物KR作为测序引物；3#PCR管产物为VH，使用引物HR作为测序引物，测序结果如图和图5所示，其中，图4示出VL基因部分片段测序峰形图，图5示出VH基因部分片段测序峰形图。

由图4和图5可知，本实例所用组合引物扩增出的可变区基因PCR产物，经过简单的电泳胶回收后进行基因测序，测序峰形图清晰单一，不存在重叠峰干扰序列的判读，说明本方法成功消除了sp2/0细胞的非功能基因对测序的干扰影响。

由于PCR引物存在兼并碱基，并且测序不能测到基因末端，VL的部分核苷酸序列表如SEQ ID NO.43所示。

进一步地，利用IMGT数据库进行序列比对，确定前导肽和部分FR1区序列，其中，前导肽的核苷酸序列表如SEQ ID NO.44所示，进而确定完整VL核苷酸序列表如SEQ ID NO.45所示。

同样地，由于PCR引物存在兼并碱基，并且测序不能测到基因末端，VH的部分核苷酸序列表如SEQ ID NO.46所示。

进一步地，利用IMGT数据库进行序列比对，确定前导肽的核苷酸序列表如SEQ IDNO.47所示，进而确定完整VH核苷酸序列表如SEQ ID NO.48所示。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 37

caggcttatc tgcagcagtc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 38

caggttcacc tacaacagtc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 39

caggtgcagc ttgtagagac 20

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 40

gargtgmagc tgktggaga 19

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 41

ttggggggaa gatgaagac 19

<210> 42

<211> 713

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 42

atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 180

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 360

tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct 420

tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca 480

acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg 540

gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca gcaaagacag cacctacagc atgagcagca 600

ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac gacataacag ctatacctgt gaggccactc 660

acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga gcttcaacag gaatgagtgt tag 713

<210> 43

<211> 320

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 43

ctccactctc cctgcctgtc agtcttggag atcaagcctc cttctcttgc agatctagtc 60

agagccttgt ccacagtaat cgaatcacct atttacattg gtacctgcag aagccaggcc 120

agtctccaaa gctcctgatc tacacagttt ccagccgctt ttctggggtc ccagacaggt 180

tcagtggcag tggatcaggg acagatttca cactcaagat cagcagagtg gaggctgagg 240

atctgggagt ttatttctgc tctcaaagta cacatgttcc gtggacgttc ggtggaggca 300

ccaagctgga aatcaaacgg 320

<210> 44

<211> 57

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 44

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagt 57

<210> 45

<211> 339

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 45

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

ttctcttgca gatctagtca gagccttgtc cacagtaatc gaatcaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acacagtttc cagccgcttt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339

<210> 46

<211> 354

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 46

tctggacctg agctggtgaa gcctggggct tcactgaaga tatcctgcaa gacttctgga 60

tacacattca ctgaatacac catgcactgg gtgaagcaga gccatggaaa gagccttgaa 120

tggattggag gtattattcc tgacagtggt ggtactagct acaaccagaa gttcaagggc 180

aaggccacat tgactgtaga caagtcctcc accacagcct acatggagct ccgcagcctg 240

acatctgagg attctgcagt ctattactgt gcaagatatt attactacgg tagtagccct 300

tgttactatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354

<210> 47

<211> 57

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 47

atggaatgga gctgggtctt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctct 57

<210> 48

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<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 48

gaggtccggc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc actgaagata 60

tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgaatg gattggaggt attattcctg acagtggtgg tactagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300

tactacggta gtagcccttg ttactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360

accgtctcct ca 372

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<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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gacatccaga tgacacagwc 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

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<400> 50

gatrttgtga tgacccagwc 20

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<211> 20

<212> DNA

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gacattstgm tgacccagtc 20

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gayattktgc tgactcagtc 20

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<212> DNA

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gacattgtga tgwcacagtc 20

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<211> 21

<212> DNA

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ybwgctsacy cartctccwr c 21

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<211> 20

<212> DNA

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ctgcmtctcy dggggagaag 20

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trtctctrgg gcagagrgc 19

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<212> DNA

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<400> 57

cccagtctcc atcttatctt g 21

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 58

gacattcagc tgacccagtc tcca 24