山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法及其应用

摘要

本发明公开了山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法，包括如下步骤：利用HPLC方法，测定待测山豆根中高丽槐素的成分含量，以其中高丽槐素的成分含量为内参物，以高丽槐素与红车轴草苷含量的相对校正因子、高丽槐素和环广豆根素含量的相对校正因子计算出所述山豆根中红车轴草甘、环广豆根素的成分含量，用于评价山豆根的药材质量。本发明以高丽槐素为内参物建立的一测多评法，方法简便可靠，可为山豆根的质量控制与质量评价提供新思路和参考。

说明书

技术领域

本发明属于药材质量检测技术领域，涉及山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方 法，还涉及其在山豆根质量控制中的应用。

背景技术

山豆根(Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma)为豆科植物越南槐(Sophoratonkinensis Gagnep)的干燥根及根茎，又名广豆根、越南槐等，中国植物志记载山豆根为藤状灌木， 几不分枝，茎上常生不定根，产于广东、广西、四川、湖南、江西等地。性味苦寒，归肺、 胃经。有清热解毒，消肿利咽之功效，临床常用于咽喉肿痛、齿龈肿痛及慢性肝炎。山豆 根中主要含有苦参碱型等生物碱类化合物，以及黄酮类、三萜类和多糖类等非生物碱类化 合物。生物碱是山豆根的部分活性成分，许多药理活性研究集中在生物碱方面。但近年来 的研究表明，山豆根的非生物碱类成分同样具有许多重要的药理活性，例如抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒、抗氧化等。

山豆根的非生物碱活性成分研究发现，高丽槐素、红车轴草苷和环广豆根素显现出较 好的药理活性。文献表明，高丽槐素具有较好的抗炎、抗肿瘤、抗病毒活性。Lee等人发现高丽槐素对单胺氧化酶-B有高效性、选择性和可逆性抑制作用；Mizuguchi等人在甲苯 -2,4-二异氰酸酯(TDI)致敏的鼻超敏大鼠模型中，发现高丽槐素通过抑制组胺H1受体(H1R)和白细胞介素-4基因的表达可缓解TDI致敏的过敏模型大鼠的鼻腔症状，其分子 机制为通过抑制PKCdelta酶的激活来抑制H1R基因表达；Aratanechemuge等研究发现， 在人早幼粒白血病细胞(HL-60)中，高丽槐素可将DNA裂解为寡核小体大小的片段， 诱导细胞凋亡从而抑制HL-60细胞的生长。红车轴草苷为山豆根中含量较高的非生物碱成 分，对4种癌细胞系细胞增殖具有细胞毒性，红车轴草苷通过G2/M期细胞周期阻滞和抑 制m-TOR/PI3K/AKT信号通路来抑制SNU-5胃癌细胞生长；通过激活EGFR-MAPK信号 通路，抑制MKN-45细胞的生长。Zhou等研究发现，红车轴草苷能抑制脂多糖诱导的包 括肿瘤坏死因子和白介素-6在内的促炎性细胞因子的表达，且对人A2780卵巢癌和H23 肺癌细胞的生长有抑制作用。此外，红车轴草苷还具有保肝、抗哮喘和抑制黑色素合成等 活性。环广豆根素对人早幼粒白血病细胞增殖有一定的抑制作用。由此可见，这三种非生 物碱成分在山豆根的清热解毒、消肿利咽功效中有重要作用。因此，申请人分析认为这三 种非生物碱可以做为指标成分，进行山豆根的质量评价。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供了山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法。

为此，本发明提供的技术方案为：

山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法，包括如下步骤：利用HPLC方法，测定待测山豆根中高丽槐素的成分含量，以其中高丽槐素的成分含量为内参物，以高丽槐素与红车轴草苷含量的相对校正因子、高丽槐素和环广豆根素含量的相对校正因子计算出所述山豆根中红车轴草甘、环广豆根素的成分含量，用于评价山豆根的药材质量。

优选的是，所述的山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法中，以高丽槐素为内参 物S，测定红车轴草苷(A)、环广豆根素(B)的峰面积，按公式f

优选的是，所述的山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法中，所述高丽槐素与红 车轴草甘含量的相对校正因子f

优选的是，所述的山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法中，所述高丽槐素与红 车轴草甘含量的相对校正因子f

优选的是，所述的山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法中，HPLC方法中，测定波长为205nm。

优选的是，所述的山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法中，HPLC方法中，采用75％乙醇水溶液作为山豆根样品的提取溶剂。

优选的是，所述的山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法中，HPLC方法中，色谱柱柱温为25～35℃。

所述的山豆根中三种非生物碱成分的一测多评在山豆根质量控制中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明以含量较高且廉价易得的高丽槐素为参照物，计算出高丽槐素与红车轴草苷和 环广豆根素之间的相对校正因子，建立山豆根中3个非生物碱的一测多评方法。并通过一 测多评法计算3个成分的含量，同时将其与外标法测定结果进行比较，探讨该方法用于山 豆根药材成分含有量测定的可行性，为山豆根非生物碱的研究提供参考，药材质量控制提 供依据。

本发明以高丽槐素为内参物，建立了红车轴草苷的相对校正因子(f

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明 的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中各成分的HPLC色谱图，A图为样品的HPLC色谱图，B图为对照品的HPLC色谱图，其中1为红车轴草苷，2为高丽槐素，3为环广豆根素；

图2A为本发明其中一个实施例中ESM聚类分析图，图2B为本发明其中一个实施例中QAMS聚类分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能 够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供山豆根中三种非生物碱成分的一测多评方法，包括如下步骤：利用HPLC 方法，测定待测山豆根中高丽槐素的成分含量，以其中高丽槐素的成分含量为内参物，以 高丽槐素与红车轴草苷含量的相对校正因子、高丽槐素和环广豆根素含量的相对校正因子 计算出所述山豆根中红车轴草甘、环广豆根素的成分含量，用于评价山豆根的药材质量。

本发明以高丽槐素为内参物，建立了一测多评定量方法，精密度、稳定性、重复性及 耐用性较好，符合分析要求。采用该方法，检测了21批山豆根中的高丽槐素、红车轴草苷和环广豆根素的含量，t检验与聚类分析结果显示，该方法与外标法测定结果基本一致，可以用于这3个非生物碱的含量测定。本文以高丽槐素为内参物建立的一测多评法，方法简便可靠，可为山豆根的质量控制与质量评价提供新思路和参考。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，以高丽槐素为内参物S，测定红车轴草苷 (A)、环广豆根素(B)的峰面积，按公式f

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述高丽槐素与红车轴草甘含量的相对校 正因子f

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述高丽槐素与红车轴草甘含量的相对校 正因子f

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，HPLC方法中，测定波长为205nm。在205nm波长检测下供试品信息量大、各色谱峰分离度较好、基线平稳。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，HPLC方法中，采用75％乙醇水溶液作为山豆根样品的提取溶剂。此时提取率最高。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，HPLC方法中，色谱柱柱温为25～35℃。柱温对各待测成分的相对校正因子无显著影响。室温范围均可以。

本发明还提供所述的山豆根中三种非生物碱成分的一测多评在山豆根质量控制中的 应用。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

1仪器与试药

1.1仪器

高效液相Waters e2695 Sparations Module，2998PDA型紫外检测器，美国Waters公司； BSA124S型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；JP-060ST型超声波清洗仪， 上海嘉鹏科技有限公司；MILIPORE超纯水机系统。

1.2试药

对照品红车轴草苷、环广豆根素、高丽槐素(均为本发明分离纯化，所测得

杨新洲,杨静,汪超,等.苦参中钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制活性成分的研究[J].云南大学学报(自然科学版), 2014,36(02):267-272.

李行诺,闫海霞,庞晓雁,等.壤笃岜中黄酮化学成分研究[J].中国中药杂志,2009,34(3):282-285.

Park J A,Kim H J,Jin C,et al.A New Pterocarpan,(-)-Maackiain Sulfate,from the Roots of Sophora subprostrata[J]. Archives of Pharmacal Res,2003,26(12):1009-1013)，经HPLC面积归一化法得出纯度≥98％。色谱纯 乙腈和甲醇购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；超纯水。

1.3药材

采集广西区7个不同产地的山豆根(广西药用植物园韦坤华研究员鉴定)，每个产地 取3株，编号S1～S21，共21批。见表1。

表1.山豆根的产地和批次

Table 1.Origin and batch of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma

2多成分一测多评法的建立及含量测定

2.1色谱条件

色谱柱为Agilent Plus-C

2.2对照品溶液的制备

对照品的制备：分别取高丽槐素、红车轴草苷、环广豆根素适量，精密称取，配制每1mL溶液中分别含0.175mg、0.140mg、0.070mg的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

取S2粉末约2.0g，置于50mL圆底烧瓶中，加入20mL75％乙醇水溶液，85℃水浴 回流提取2h。冷却至室温，过滤，上D101大孔树脂柱，依次用蒸馏水、39％乙醇水、95％ 乙醇水洗脱，收集40％-95％乙醇水部位，蒸干溶剂后用色谱甲醇溶解定容至10mL容量 瓶中，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1系统适应性及专属性考察试验

精密吸取“2.2”项下对照品溶液和“2.3”项下供试品溶液各10μL，按“2.1”项下色谱条件 测定，记录色谱图。结果表明，供试品溶液图谱中1、2、3号色谱峰的保留时间与混合对 照品溶液图谱一致。结果见图1。表明该方法具有良好的系统适应性及专属性。

2.4.2线性关系考察

按“2.1”项下色谱条件测定，取“2.2”项下对照品溶液，分别进样2μL、4μL、8μL、 10μL、15μL、20μL，记录色谱峰面积，以各对照品的峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横 坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程，见表2。各待测成分相关系数均 大于0.9990，表明线性关系良好。

表2. 3个非生物碱类成分线性关系考察结果

Table 2.Results of linear relationship between three non-alkaloids

2.4.2精密度试验

取对照品溶液，连续进样6次，记录各化合物的峰面积，计算其RSD值，结果见表3，表明该方法精密度良好。

2.4.3稳定性试验

取S2供试品溶液，分别于制备后0、3、6、14、24h进样分析，计算各成分峰面积 RSD值，结果见表3，表明供试品溶液在24h内测量，稳定性良好。

2.4.4重复性试验

称取S2样品粉末6份，每份约2.0g，精密称定，分别按照“2.3”项供试品的制备方法制备供试品溶液6份，按照“2.1”项的色谱条件，各精密吸取10μL测定，记录峰面积， 以建立的标准曲线方程计算各待测成分的含量及RSD值，结果见表3，表明该方法的重复 性良好。

2.4.5加样回收率试验

称取S2样品粉末6份，每份约1.0g，精密称定，分别加入与待测成分含量相近的各对照品，按“2.3”项供试品的制备方法制备供试品溶液，按照“2.1”项的色谱条件，分 别精密吸取10μL，测定并计算6个待测成分的加样回收率及RSD，结果见表3，表明回 收率均符合要求。

表3.含量测定精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验结果

Table 3.Precision,stability,repeatability and sample recovery ratetest results of Content determination

2.5相对校正因子(f

2.5.1f

按“2.1”项下色谱条件测定，对照品溶液进行一系列不同的进样量，分别为2μL、4μL、8μL、10μL、15μL、20μL，以高丽槐素为内参物S，测定红车轴草苷(A)、环广 豆根素(B)的峰面积，按公式f

表4. 3个非生物碱成分的相对校正因子

Table 4.Relative correction factors for three non-alkaloid components

2.5.2f

(1)不同液相色谱仪器及色谱柱对f

表5.不同液相色谱仪器及色谱柱对相对校正因子的影响

Table 5.Effect of different LC instruments and columns on relativecorrection factors

(2)不同柱温对f

表6.不同柱温对相对校正因子的影响

Table 6.Effect of different column temperatures on relativecorrection factors

2.5.3f

根据上述试验结果，最终确定了红车轴草苷的相对校正因子f

2.5.4一测多评法对21个山豆根样品的检测

分别取21批山豆根各2.0g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色 谱条件进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算山豆根样品中3个成分的含量。结果 见表7。

表7.一测多评法与外标法测定结果的比较

Table 7.Comparison of content determination results obtained by ESMand QAMS methods

4结果和讨论

4.1检测波长的选择

分别取高丽槐素、红车轴草苷、环广豆根素对照品溶液，采用PAD检测器在190～600 nm波长范围进行波长扫描。结果显示，高丽槐素在205nm与280nm波长处有最大 吸收、红车轴草苷在280nm与310nm波长处有最大吸收、环广豆根素在290nm与 360nm波长处有最大吸收。对205nm、280nm、310nm、360nm波长下山豆根供试品 溶液HPLC色谱图进行比较，结果在205nm波长检测下供试品信息量大、各色谱峰分离 度较好、基线平稳。故选择205nm为测定波长。

4.2提取溶剂的选择

分别称取山豆根药材5.0g，置于50mL圆底烧瓶，加入不同浓度的溶剂(75％乙醇水， 80％乙醇水，85％乙醇水)各20mL，80℃水浴加热回流1h，过滤，滤液用三氯甲烷萃取，萃取液浓缩后称重，通过比较不同浓度溶剂的提取率来选择提取溶剂，结果表明当溶剂为75％乙醇水、80％乙醇水和85％乙醇水时，提取率分别为4.50％、4.19和4.36％。故选用75％乙醇水作为提取溶剂。

4.3一测多评法与外标法含量测定结果的t检验

采用SPSS 25软件，对21批山豆根中红车轴草苷ESM与QAMS的含量测定结果进 行成对样品t检验，计算统计量t＝1.776＜t

分别以ESM及QAMS测定21批山豆根中高丽槐素、红车轴草苷、环广豆根素的含 量，并以此含量为变量，导入SPSS 25软件，选用平均组间连接聚类方法，以平均欧式距 离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析。结果见图2。聚类分析结果表明，分别 以QAMS与ESM方法测定的含量聚类分析的一致，当分类距离为20时，21批山豆根可 以分为两类。S9、S16、S5样品聚为一类，其余样品聚为一类。

本发明研究发现，山豆根非生物碱部位有较好的活性。非生物碱部位主要含高丽槐素、 红车轴草苷和环广豆根素，这三个成分在山豆根中的总含量约为0.8％。在75％乙醇水提 取物中平均含量约为11.0％。本发明以含量较高且廉价易得的高丽槐素为参照物，计算出 高丽槐素与红车轴草苷和环广豆根素之间的相对校正因子，建立山豆根中3个非生物碱的 一测多评方法。并通过一测多评法计算3个成分的含量，同时将其与外标法测定结果进行 比较，探讨该方法用于山豆根药材成分含有量测定的可行性，为山豆根非生物碱的研究提 供参考，药材质量控制提供依据。

本发明以高丽槐素为内参物，建立了红车轴草苷的相对校正因子(f

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的山豆根中三 种非生物碱成分的一测多评方法及其应用的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是 显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运 用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。