使用孢子形成阴性芽孢杆菌菌株生产改善的乳制品的方法

摘要

本发明涉及生产发酵乳制品的方法，包括：(a)提供乳基质，(b)用乳酸菌起子培养物发酵所述乳基质，其中在存在至少一种选自由孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株、孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株的情况下进行步骤(b)，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(Veal Infusion Broth,VIB)中过夜生长的培养物，ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及iii)第二天测试孢子。

说明书

技术领域

本发明涉及生产发酵乳制品的方法，包括：

(a)提供乳基质，

(b)用乳酸菌起子培养物发酵所述乳基质。

背景技术

食品工业使用许多不同类型的细菌来制备食品。为了制备发酵乳制品，例如酸奶、奶酪或酪乳，最常使用乳酸菌(LAB)。LAB及其代谢产物通过产生大量的乳酸，极大地有助于发酵制品的味道和质地，并抑制了食品腐败。

食品工业目前用于制备发酵乳制品的LAB菌株来自不同的分类学类别，例如链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。用于发酵的菌株赋予乳制品质地的能力在某种程度上与多糖的产生有关。并非每一株发现具有特别合适的发酵特性(例如良好的酸化特性)的菌株都具有良好的质地化特征。因此，经常需要改善发酵乳制品的质地。

现有技术中已经使用了不同的方法来增加这类制品的质地。例如，可以在制品生产后将诸如明胶、果胶、藻酸盐、羧甲基纤维素、树胶、淀粉和纤维等添加剂添加到制品中[1]。然而，鉴于消费者对“清洁标签”产品的需求增加，这种添加剂通常是不希望的。

增加质地的另一种方法聚焦于优化在发酵中使用的LAB菌株。例如，发现使用半乳糖激酶活性提高的基因修饰菌株对用这种菌株生产的产品的质地具有重大影响[2]。尽管这些修饰的菌株非常有效，但许多消费者倾向于偏爱在乳制品中天然存在的菌株。

迄今为止，LAB与不属于LAB群的细菌的共发酵在乳制品工业中尚未引起太多关注。其原因之一在于这样一个事实，即LAB在发酵过程中产生大量乳酸，导致发酵过程中pH值显著降低至4-5。大多数细菌只能耐受中等程度的pH降低，这使其不适合用于制备发酵乳制品。

芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌通常不用于乳发酵。然而，有一些证据表明，过去已经将芽孢杆菌属菌株用于制备乳制品，例如酸奶。参考文献[3]描述了在没有典型LAB起子培养物的情况下使用芽孢杆菌属菌株来发酵诸如酸奶等乳制品。

参考文献[4]描述了使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株来生产可能具有治疗价值的发酵乳产品。据报道，芽孢杆菌属菌株产生的抗菌物质提供了具有长保质期和推定的治疗特性的产品。

参考文献[5]描述了使用枯草芽孢杆菌生产发酵乳的方法。该方法包括两个连续的步骤。在第一步中，将乳用枯草芽孢杆菌发酵数小时。在这一步中，乳中的蛋白质被芽孢杆菌属蛋白酶降解为氨基酸或寡肽。随后，将LAB添加到乳中，并继续发酵直到达到所需的pH。

参考文献[6]公开了使用产生果聚糖蔗糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)或枯草芽孢杆菌菌株来制备酸奶的方法。

参考文献[7]描述了使用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stereothermophilus)的组合来制备具有奶酪味的发酵乳制品以获得具有奶酪味制品。

参考文献[8]是国际专利申请，其公开了嗜热链球菌与不同的芽孢杆菌属菌株，例如枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto)共发酵来制备嗜热发酵乳制品。

最后，参考文献[9]报道了一些实验，其中分析了枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌污染对酸奶油流变性和质构性的潜在影响。

发明内容

本发明涉及生产发酵乳制品的方法，包括：

(a)提供乳基质，

(b)用乳酸菌起子培养物发酵所述乳基质，

其中在存在至少一种选自由孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株、孢子形成阴性凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株的情况下进行步骤(b)，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(Veal Infusion Broth,VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

使用芽孢杆菌属菌株生产发酵乳制品的主要障碍是许多芽孢杆菌属菌株形成孢子，这在发酵乳制品的工业生产中是非常不希望的。仅出于这个原因，到目前为止，已经避免了在发酵乳制品生产中使用芽孢杆菌属菌株。然而，本发明现在表明，可以由具有强质构化能力的孢子形成阳性芽孢杆菌属母菌株产生维持或甚至提高了母菌株的质构化能力的孢子形成阴性芽孢杆菌属菌株。

现在还令人惊奇地发现，当在存在至少一种孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株或至少一种孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株的情况下，用乳酸菌起子培养物发酵乳基质时，可以大大提高发酵乳制品的质地。已经发现，所述菌株改善了诸如酸奶等嗜热发酵乳制品以及诸如酸奶油等嗜温发酵乳制品的质地。特别是，如通过剪切应力和/或凝胶刚度测量的，所述菌株改善了质地。

这些芽孢杆菌属物种的孢子形成阴性突变体似乎改善了LAB赋予乳制品的质地。芽孢杆菌属菌株发挥这种效果的机理尚不清楚。值得注意的是，由本发明的方法制造的产品的剪切应力和凝胶刚度非常高，并且在某些情况下达到的水平是没有所述芽孢杆菌属菌株的相同LAB起子培养物获得的相应剪切应力的四倍。另外，本文已经证明，在存在芽孢杆菌属的情况下用LAB对乳基质进行发酵显著减少了达到例如4.5的目标pH所需的时间。在此程度上，本发明的方法有助于降低与生产过程有关的成本。

值得注意的是，由本发明的方法制造的产品的剪切应力和凝胶刚度非常高，并且在某些情况下高于由相应的孢子形成阳性芽孢杆菌属母菌株获得的相应剪切应力和凝胶刚度。同样，本发明方法中的酸化时间短，并且在某些情况下，比相应的孢子形成阳性芽孢杆菌属母菌株所达到的相应酸化时间短。

根据以上令人惊讶的发现，枯草芽孢杆菌纳豆亚种或凝结芽胞杆菌的孢子形成阴性突变体的菌株可以用作常见嗜温和嗜热LAB起子培养物的添加剂来改善发酵乳制品的质地，例如通过增加剪切应力或凝胶刚度(复数模量)。本发明提供了使用LAB菌株和枯草芽孢杆菌纳豆亚种或凝结芽孢杆菌的孢子形成阴性突变体的菌株的新颖发酵方法，以及包含菌株各自组合的起子培养物。最后，本发明提供了枯草芽孢杆菌纳豆亚种或凝结芽孢杆菌的新颖孢子形成阴性菌株。

尚未完全了解芽孢杆菌物种如何影响乳酸菌的质构化性能。然而似乎芽孢杆菌菌株在发酵过程中不会大量繁殖。然而，本文已经表明，对LAB发酵产生积极影响并不需要芽孢杆菌属菌株的显著生长。

本发明还涉及选自枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和凝结芽孢杆菌菌株、且是孢子形成阳性母菌株的孢子形成阴性突变体的芽孢杆菌属菌株，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

本发明还涉及用于生产发酵乳制品的组合物，包含

(a)乳酸菌起子培养物，和

(b)选自由孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

本发明还涉及可通过本发明的方法获得的发酵乳制品。

本发明还涉及发酵乳制品，包含

(a)乳酸菌起子培养物，和

(b)选自由孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

本发明还涉及选自由孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株在增加嗜温发酵乳制品的剪切应力、凝胶刚度和/或凝胶硬度中的用途，并且其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

定义

本文的术语“嗜热生物(thermophile)”是指在高于35℃的温度下成长得最好的微生物。工业上最有用的嗜热细菌包括链球菌属的种和乳杆菌属的种。本文的术语“嗜热发酵”是指在高于约35℃的温度下发酵，例如在约35℃至约45℃之间。术语“嗜热发酵乳制品”是指通过嗜热起子培养物的嗜热发酵制备的发酵乳制品，并且包括诸如凝固型酸奶、搅拌型酸奶和饮用酸奶例如养乐多(Yakult)的发酵乳制品。

本文中的术语“嗜温生物(mesophile)”是指在中等温度(15℃-35℃)下成长得最好的微生物。工业上最有用的嗜温菌包括乳球菌属的种和明串珠菌属的种。本文的术语“嗜温发酵”是指在约22℃至约35℃的温度下发酵。术语“嗜温发酵乳制品”是指通过嗜温起子培养物的嗜温发酵制备的发酵乳制品，包括诸如酪乳、酸乳、培养乳、斯美塔那(smetana)、酸奶油、克非尔(Kefir)和新鲜奶酪的发酵乳制品，新鲜奶酪例如夸克奶酪(quark)、tvarog奶酪和奶油奶酪。

术语“乳”应理解为通过对诸如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼等任何哺乳动物的挤奶而获得的乳汁分泌物。在优选的实施方案中，乳是牛乳。该术语乳还包括由植物材料制成的蛋白质/脂肪溶液，例如豆浆。

术语“乳基质”可以是可根据本发明的方法进行发酵的任何未加工的和/或加工的乳材料。因此，有用的乳基质包括但不限于任何乳或包含蛋白质的乳样产品的溶液或悬浮液，例如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复配乳粉、炼乳、奶粉(dried milk)、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物或奶油。显然，乳基质可能来源于任何哺乳动物，例如，基本上纯的哺乳动物乳或复配乳粉。

在发酵之前，可以根据本领域已知的方法将乳基质均质化并进行巴氏灭菌。

如本文所用，“均质化”意指强烈混合以获得可溶性悬浮液或乳液。如果在先发酵前进行均质化，那么可以进行均质化，以便将乳脂分解成更小的尺寸，从而乳脂不再与乳分离。这可以通过使乳在高压下通过小孔来完成。

如本文所用，“巴氏灭菌”是指处理乳基质以减少或消除活生物例如微生物的存在。优选，通过将指定温度保持指定的一段时间来实现巴氏灭菌。指定温度通常通过加热获得。可以选择温度和持续时间，以杀伤或灭活某些细菌，例如有害细菌。随后可以进行快速冷却步骤。

本发明的方法中，“发酵”是指通过微生物的作用将碳水化合物转化成醇或酸。优选，本发明方法中的发酵包括将乳糖转化成乳酸。

表述“酸化时间”是指从发酵开始到达到目标pH的时间段。

具体实施方式

本发明提供了制造乳制品的新颖方法，该方法基于在存在孢子形成阴性芽孢杆菌属菌株的情况下用LAB发酵基质。

可以使用选自任何枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和任何孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株的组的任何芽孢杆菌属菌株作为母菌株来获得本发明的孢子形成阴性菌株。

在本发明的具体实施方案中，芽孢杆菌属菌株是选自由枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株组成的组的孢子形成阳性母菌株的孢子形成阴性突变体。

在本发明的具体实施方案中，芽孢杆菌属菌株是选自由DSM 32588、DSM 32589和DSM 32606组成的组的孢子形成阳性母株的孢子形成阴性突变体。

在本发明的具体实施方案中，孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株选自由DSM 32892、DSM 32893、DSM 32894、DSM 32895及其突变体组成的组。在前面的句子中，术语“突变体”是指通过例如基因工程、辐射和/或化学处理衍生自本文公开的保藏菌株之一的菌株。优选的是，突变体是功能上等效的突变体，即，与衍生它的保藏菌株相比，在质地、剪切应力、黏度、黏弹性和/或凝胶刚度方面具有基本上相同或改善的特性的突变体。尤其是，术语“突变体”是指通过使本发明的菌株经历任何常规使用的诱变处理而获得的菌株，包括用化学诱变剂例如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)、UV光处理，或是指自发发生的突变体。突变体可能已经历了几次诱变处理(单次处理应认为是一个诱变步骤，然后进行筛选/选择步骤)，但目前优选的是，进行不超过20次或不超过10次或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在本发明优选的突变体中，与母菌株相比，细菌基因组中小于1％，特别是小于0.1％、小于0.01％，更特别是小于0.001％或最特别是小于0.0001％的核苷酸已被另一核苷酸置换或缺失。

可以使用产生孢子形成阳性细菌母菌株的孢子形成阴性突变细菌菌株的任何常规方法获得本发明的孢子形成阴性菌株。

用于产生孢子形成阳性细菌母菌株的孢子形成阴性突变细菌菌株的具体方法包括以下步骤：

a)使母菌株的培养物经受诱变处理方法，

b)在孢子形成诱导培养基琼脂平板上使处理的培养物生长，并且

c)基于目视检查选择孢子形成阴性突变体的菌落。

所述诱变处理方法可以是任何常规使用的诱变处理，包括用诸如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂和UV辐射处理。突变体可能已经受几次诱变处理(单次处理应认为是一个诱变步骤，然后进行筛选/选择步骤)，但目前优选的是，进行不超过20次，或不超过10次，或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在本发明优选的突变体中，与母菌株相比，细菌基因组中小于1％、小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸已被另一核苷酸置换或缺失。

在本发明的具体实施方案中，所述诱变处理方法是UV辐射。

所述琼脂平板的孢子形成诱导培养基可以是任何常规的孢子形成诱导培养基，例如商业孢子形成诱导培养基。

进行所述基于目视检查选择孢子形成阴性突变体的菌落，以便选择与孢子形成阳性菌株的菌落相比更淡和/或更透明的菌落。

在本发明中，术语“孢子形成阴性菌株”是指在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

所述标准孢子形成诱导培养基可以是任何常规的孢子形成诱导培养基，例如商业孢子形成诱导培养基。

所述对于孢子的测试可以通过以下方法进行：

a)将1ml待测菌株培养物的等分试样在80℃下加热10min，

b)在蛋白胨盐水中进行10倍稀释，然后将100μl每种热处理样品的稀释液分散在血琼脂(BA)琼脂平板上(热处理后，只有孢子形成阳性菌株能够生长)，

c)在37℃下孵育BA琼脂平板，以及

d)在24和48小时后检查生长。

根据本发明，在存在至少一种选自孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株的芽孢杆菌属菌株的情况下，用乳酸菌起子培养物发酵乳基质。芽孢杆菌属是一类革兰氏阳性、形成孢子的细菌，最近几年在食品工业中也引起了关注。枯草芽孢杆菌纳豆亚种被称为非致病细菌，被用于制造日本传统的发酵大豆食品“纳豆”。枯草芽孢杆菌纳豆亚种已经获得了FDA的GRAS通知(``通常认为是安全的”)，可以从不同的制造商购买。凝结芽孢杆菌由于据称可支持良好的消化和免疫健康而用作益生菌。它用于一些食品，包括烘焙食品、乳制品和谷物产品。凝结芽孢杆菌也获得了FDA的GRAS通知。凝结芽孢杆菌菌株可从不同制造商商购获得。

在本发明的具体实施方案中，通过基因组测序将细菌分类为本发明的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株。

在本发明的具体实施方案中，通过基因组测序将细菌分类为本发明的凝结芽孢杆菌。

如本文所用，“发酵”是指通过微生物的作用将碳水化合物或糖转化为醇或酸。优选，就本发明而言，发酵包括将乳糖转化为乳酸。通过乳酸菌发酵碳水化合物或糖是特别优选的。

在本发明方法的步骤(a)中，提供了待进行发酵的乳基质。术语“乳基质”是指可以根据本发明的方法进行发酵的任何未加工和/或加工的乳材料。如本文所用，“乳”是指通过对诸如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼等哺乳动物挤奶而获得的乳汁分泌物。该术语乳还包括由植物材料制成的蛋白质/脂肪溶液，特别是豆浆。在本发明优选的实施方案中，本发明方法所用的乳是牛乳。

有用的乳基质包括但不限于乳或包含蛋白质的乳样产品的溶液/悬浮液，例如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复配乳粉、炼乳、奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物或奶油。显然，乳基质可能来源于任何哺乳动物，例如，基本上纯的哺乳动物乳或复配乳粉。

在本发明方法的步骤(b)中，用乳酸菌起子培养物发酵经选择用于发酵方法的乳基质。根据本发明，“乳酸菌起子培养物”或“乳酸菌起子”是包括一种或多种将用于发酵的乳酸菌菌株的组合物。通常将起子培养物作为用于批量起子繁殖的冷冻或冻干培养物或作为所谓的“直投式”(Direct Vat Set,DVS)培养物，即用于直接接种到发酵容器或发酵槽中的培养物来供应，以产生乳制品，例如发酵乳制品。

在发酵之前，可以对乳基质进行均质化或巴氏灭菌。“均质化”是指强烈混合以获得可溶性悬浮液或乳液。如果在先发酵前进行均质化，那么可以进行均质化，以便将乳脂液滴分解成尺寸更小的液滴，从而防止脂成分与乳分离。这可以通过使乳在高压下通过小孔来完成。“巴氏杀菌”是指是指处理乳基质以减少或消除活生物例如微生物的存在。优选，通过将乳基质在指定温度下保持指定的一段时间来实现巴氏灭菌。指定温度通常通过加热获得。可以选择温度和持续时间，以杀伤或灭活某些细菌，例如有害细菌。随后可以进行快速冷却步骤。

在本发明的上下文中，术语“乳酸菌”表示革兰氏阳性、微需氧或厌氧细菌，其发酵糖从而产生酸，包括乳酸、乙酸和丙酸。通常，主要产生的酸是乳酸。在“乳杆菌目(Lactobacillales)”中发现对工业目的有用的乳酸菌包括乳球菌属的种(Lactococcusspp.)、链球菌属的种(Streptococcus spp.)、乳杆菌属的种(Lactobacillus spp)、明串珠菌属的种(Leuconostoc spp.)、假明串珠菌属的种(Pseudoleuconostoc spp.)、片球菌属的种(Pediococcus spp.)、短杆菌属的种(Brevibacterium spp.)、肠球菌属的种(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属的种(Propionibacterium spp.)。乳酸菌还包括严格厌氧双歧杆菌，即双歧杆菌属的种(Bifidobacterium spp.)。它们经常单独或与其他乳酸菌一起用作食品培养物。

当在存在至少一种芽孢杆菌属菌株的情况下用嗜温乳酸菌起子培养物发酵乳基质时，不必在完全的发酵时间内存在芽孢杆菌属菌株。在大部分发酵内，例如在至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的全部发酵时间内存在至少一种芽孢杆菌属菌株是足够的。如本文所用，“发酵时间”定义了在接种乳基质与达到预定pH之间的时间段。

例如，可以用乳酸菌起子培养物对乳基质进行接种，然后将乳基质孵育数小时，例如1-5小时，例如2、3或4小时。随后，可以将一种或多种芽孢杆菌属菌株添加到乳基质中，并且发酵可以继续进行数小时，直到达到期望的pH。相反，可以首先用一种或多种芽孢杆菌属菌株接种乳基质，并孵育数小时，优选1-5小时，例如2、3或4小时，然后添加嗜温乳酸菌起子培养物。连续接种乳基质可以用作调节所需的凝胶刚度的质地的方法。

在特别优选的实施方案中，来自乳酸菌起子培养物的细菌和一种或多种芽孢杆菌属菌株在整个发酵时间内都存在于乳基质中，这意味着在发酵开始时将所述乳酸菌起子培养物和所述一种或多种芽孢杆菌菌株一起接种到乳基质中。

起子培养物可以包含冷冻保护剂和/或其他常规添加剂，例如着色剂、酵母提取物、糖和维生素，作为其他成分。

在具体实施方案中，乳酸菌起子培养物包含至少一种乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株。在下文中，该实施方案称为嗜温起子培养物。

在具体实施方案中，乳酸菌起子培养物包含至少一种嗜热链球菌菌株和至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。在下文中，该实施方案称为嗜热起子培养物。

本发明的方法旨在生产嗜温发酵乳制品。“嗜温发酵乳制品”是已经通过用嗜温微生物特别是嗜温LAB发酵而制备的乳制品。“嗜温”微生物在15℃-40℃之间的中等温度下具有最佳生长。被认为是嗜温的典型LAB包括但不限于乳球菌属的种和明串珠菌属的种。本文的“嗜温发酵”是指在15℃-35℃，优选在20℃-35℃，甚至更优选在25℃-30℃的温度下发酵。被认为是“嗜温发酵乳制品”的典型乳制品包括但不限于酪乳、酸乳、培养乳、斯美塔那、酸奶油和新鲜奶酪，例如夸克奶酪、tvarog奶酪和奶油奶酪。相反，“嗜热”微生物在高于43℃的温度下具有最佳生长。乳品加工业中使用的嗜热LAB尤其包括链球菌属的种和乳杆菌属的种。因此，用嗜热微生物进行的“嗜热发酵”通常使用高于35℃的温度。术语“嗜热乳制品”是指通过用嗜热微生物特别是嗜热LAB发酵而制备的乳制品。然而，嗜热菌株链球菌属的种也用于生产一些嗜温发酵乳制品，例如与嗜温菌株乳球菌属的种组合，在这种情况下，优选温度为25-35℃，更优选30-35℃。

乳基质的脂肪含量取决于所用的具体基质。在本发明的优选实施方案中，该方法用于制备酸奶油，这意味着该方法所用的乳基质的脂肪含量为6-45％，优选9％-35％，更优选12％-30％，更优选14％-25％，最优选16％-22％。

根据本发明，嗜温乳酸菌起子培养物包括至少一种乳酸乳球菌菌株。在一个实施方案中，乳酸乳球菌菌株是乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)菌株。在另一个实施方案中，乳酸乳球菌菌株是乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactissubsp.cremoris)菌株。

除了至少一种乳酸乳球菌菌株之外，嗜温乳酸菌起子培养物可以包括其他嗜温乳酸菌，例如乳酸乳球菌乳酸亚种或乳酸乳球菌乳脂亚种的其他菌株。在特别优选的实施方案中，嗜温乳酸菌起子培养物包括一种或多种乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮生物变型(L.lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)菌株，其产生风味化合物。可替代地，或此外，嗜温起子培养物可包括以下属的一种或多种细菌：明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属或乳杆菌属。尤其的实例包括肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、肠膜假明串珠菌(Pseudoleuconostoc mesenteroides)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。尤其优选的实例包括肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、肠膜假明串珠菌乳脂亚种(Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)。

在本发明特别优选的实施方案中，嗜温乳酸菌起子培养物不包含产生胞外多糖(EPS)的乳酸菌。特别是，嗜温乳酸菌起子培养物不包含链球菌属菌株，例如嗜热链球菌菌株。

通常，用嗜温乳酸菌起子培养物接种乳基质，例如用于制备酸奶油的奶油，以使乳基质中活乳酸菌浓度达到10

当嗜温乳酸菌起子培养物包含两种或更多种不同细菌的混合物时，优选的是，接种乳基质，例如用于制备酸奶油的奶油，以使乳基质中乳酸乳球菌菌株的浓度达到至少约10

枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株或凝结芽孢杆菌菌株将被接种到乳基质中，例如用于制备酸奶油的奶油中，使得在接种后，芽孢杆菌属菌株的浓度会与在嗜温乳酸菌起子培养的背景下的上述浓度相当。这意味着用一种或多种芽孢杆菌属菌株接种乳基质，例如用于制备酸奶油的奶油，以使乳基质中所述物种的活芽孢杆菌属细菌的浓度达到10

特别优选的是，将一种或多种芽孢杆菌属菌株以10

用嗜温乳酸菌起子培养物和一种或多种芽孢杆菌属菌株接种后，将乳基质在适合嗜温乳酸菌增殖的条件下孵育。这会优选地包括15℃至35℃，更优选20℃至35℃，并且甚至更优选25℃至35℃，例如26℃至34℃之间的温度。待在发酵过程中使用的具体温度将主要取决于应生产的嗜温发酵乳制品。例如，当将该方法用于制备酸奶油时，发酵过程中的温度应为26-34℃，优选为28-32℃。

通常，通过本发明的方法生产的发酵乳制品可以是通常通过嗜温发酵生产的任何类型的乳制品。然而，在优选的实施方案中，嗜温发酵乳制品选自由以下组成的组：酸奶油、酸乳、酪乳、培养乳、斯美塔那、夸克、tvarog、新鲜奶酪和奶油奶酪。在优选的实施方案中，嗜温发酵乳制品是酸奶油。

进行发酵直到乳基质达到所需的pH，该pH通常为pH 4.0-5.0，优选pH 4.5-4.8。因此，在发酵过程中会监测pH，并且当在发酵容器中测得预定pH时，应停止发酵。取决于起子培养物的浓度和待生产的产品，发酵可能需要进行5-24小时，优选5-20小时，更优选5-16之间，更优选5-14小时，更优选6-12小时，更优选7-11小时，最优选8-10小时。

发酵后，可将发酵乳制品冷却并进一步处理。例如，取决于发酵乳产品的类型，该处理可以包括例如将从发酵获得的产品与诸如凝乳酶和胃蛋白酶等酶一起孵育。当发酵的乳制品是奶酪时，该处理还可以包括将凝结物切成奶酪凝乳颗粒。产品的处理还可以包括包装发酵乳制品。合适的包装可以是容积为例如50ml至1000ml的瓶子、纸箱或类似物。

本发明的方法具有特别的优点，即当使用嗜温乳酸菌起子培养物以及选自由枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和凝结芽胞杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株制备诸如酸奶油等嗜温发酵乳制品时，可以显著改善所得乳制品的质地特性，特别是黏度、剪切应力和凝胶刚度。

优选，通过使用本文所定义的方法，相对于在相同条件下，在不存在任何芽孢杆菌属菌株的情况下相同乳基质的发酵，可以获得的发酵乳制品的剪切应力、凝胶刚度和/或凝胶硬度的增加是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％或至少500％。

在一个优选的实施方案中，相对于在相同条件下，在不存在任何芽孢杆菌属菌株的情况下，通过发酵相同乳基质获得的相应发酵乳制品，发酵乳制品剪切应力的增加为至少5Pa、至少10Pa、至少15Pa、至少20Pa、至少25Pa或至少30Pa。

在另一个优选的实施方案中，相对于在相同条件下，在不存在任何芽孢杆菌属菌株的情况下，通过发酵相同乳基质获得的相应发酵乳制品，发酵乳制品凝胶硬度的增加为至少25Pa、至少50Pa、至少100Pa、至少150Pa、至少200Pa、至少250Pa或至少300Pa。

在又一个优选的实施方案中，发酵乳制品的凝胶硬度的增加为至少50(g x sec)、至少75(g x sec)、至少100(g x sec)、至少125(g x sec)、至少150(g x sec)、至少175(gx sec)或至少200(g x sec)。

在本发明的具体实施方案中，通过实施例2中定义的方法测量剪切应力。

在本发明的具体实施方案中，使用实施例2中定义的方法将凝胶刚度确定为复数模量。

在本发明的特别优选的实施方案中，上述方法涉及制造酸奶油。因此，在特别优选的实施方案中，提供了生产酸奶油的方法，所述方法包括：

(a)提供脂肪含量为至少6％的奶油，

(b)用包含至少一种乳酸乳球菌菌株和任选的其他嗜温乳酸菌的嗜温乳酸菌起子培养物接种所述奶油，

(c)用至少一种选自由枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和凝结芽孢杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株接种所述奶油，

(d)将所述奶油发酵，直至pH达到4.0-5.0，更优选4.5-4.6，

(e)获得酸奶油。

在上述方法的第一步中，提供奶油作为乳基质。用于制造酸奶油的方法的奶油优选地从牛乳中获得。奶油的脂肪含量将为至少为6％，这是用于生产酸奶油的奶油中常见脂肪含量。通常，在发酵之前将脂肪含量标准化以符合食品法规。在标准化过程中，可以将乳清或酪蛋白等干成分添加到奶油中。如果要添加稳定剂，则它们也可以在制备过程的此阶段添加。合适的稳定剂包括例如多糖、淀粉和明胶。

随后，优选使奶油进行均质化，以将较大的脂肪液滴分解成较小的液滴，从而在防止乳清分离方面提供均匀的悬浮液。奶油的均质化可以在乳品加工业常规使用的标准均质机中进行。均质化条件可以包括100至200bar、优选130至150bar的压力和50-80℃、优选65℃-75℃的温度。在具体的实施方案中，均质化以两个步骤进行，在第一步中在150-200巴和65℃-75℃下进行，并且在第二步在30-60巴和65℃-75℃下进行。

均质化后，奶油可以经历巴氏灭菌以杀伤潜在的有害细菌。优选，巴氏灭菌以高温短时间(HTST)巴氏灭菌进行，这通常意味着将奶油加热至80-90℃并在该温度下孵育约2-10分钟，特别是2-5分钟。巴氏灭菌后，将奶油冷却至选定的发酵温度，以接种嗜温乳酸菌起子培养物。

然后用如上所定义的嗜温乳酸菌起子培养物接种奶油，该嗜温乳酸菌起子培养物包含至少一种乳酸乳球菌菌株和任选地其他嗜温乳酸菌。通常，用0.01-0.02％的起子培养物接种奶油。然后通常将接种的奶油孵育约12-18小时，直到达到4.5-4.6的pH。一旦达到预定的pH，就将发酵的酸奶油产品冷却并包装。

本发明的具体实施方案涉及用于生产中嗜发酵乳制品的组合物，其包含

(a)包含至少一种乳酸乳球菌菌株的乳酸菌起子培养物，和

(b)选自由孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

可以将组合物配制成适于在发酵之前直接接种乳基质或另一种培养基。

本发明的具体实施方案涉及可通过本发明的方法获得的嗜温发酵乳制品。

本发明的具体实施方案涉及嗜温发酵乳制品，其包含：

(a)包含乳酸乳球菌菌株的乳酸菌起子培养物，和

(b)选自由孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

存在于本发明的嗜温组合物中或本发明的嗜温发酵乳制品中的乳酸乳球菌菌株优选选自由乳酸乳球菌乳酸亚种或乳酸乳球菌乳脂亚种组成的组。

除了至少一种乳酸乳球菌菌株之外，本发明的组合物或本发明的嗜温发酵乳制品可以包括其他嗜温乳酸菌，例如乳酸乳杆菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮生物变型或乳酸乳球菌乳脂亚种的其他菌株。可替代的是，本发明的组合物或本发明的嗜温发酵乳制品可以包括明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属或乳杆菌属的嗜温细菌。尤其优选的实例包括肠膜明串珠菌、肠膜假明串珠菌、戊糖片球菌、干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌。尤其优选的实例包括肠膜明串珠菌乳脂亚种、肠膜假明串珠菌乳脂亚种、戊糖片球菌、干酪乳杆菌干酪亚种和副干酪乳杆菌副干酪亚种。

本发明的嗜温发酵乳制品优选选自由以下组成的组：酸奶油、酸乳、酪乳、培养乳、斯美塔那、夸克、tvarog、新鲜奶酪和奶油奶酪，并且更优选为酸奶油。

“嗜热”微生物在高于43℃的温度下具有最佳生长。乳品加工业中使用的嗜热LAB尤其包括链球菌属的种和乳杆菌属的种。因此，用嗜热微生物进行的“嗜热发酵”通常使用高于35℃的温度。术语“嗜热乳制品”是指通过用嗜热微生物特别是嗜热LAB发酵而制备的乳制品。

用于生产各种类型的发酵乳制品的大多数常规起子培养物适用于本发明的方法。优选的起子培养物是产生具有高质地和/或质地的发酵乳制品的那些起子培养物。同样，优选的是，所生产的发酵乳制品对随后的热处理具有抵抗力。

在本发明的优选实施方案中，起子培养物包含选自由来自“乳杆菌目”的乳酸菌菌株组成的组的一种或多种乳酸菌(LAB)菌株。优选，起子培养物包含选自由以下组成的组的一种或多种乳酸菌(LAB)菌株：乳球菌属的种、链球菌属的种、乳杆菌属的种、明串珠菌属的种、假明串珠菌属的种、片球菌属的种、短杆菌属的种、肠球菌属的种和丙酸杆菌属的种。

通常，用嗜温乳酸菌起子培养物接种乳基质，以使乳基质中活乳酸菌的浓度达到10

当嗜热乳酸菌起子培养物包含两种或更多种不同细菌的混合物时，优选接种乳基质以使乳基质中嗜热链球菌菌株的浓度达到至少10

枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株或凝结芽孢杆菌菌株将被接种到乳基质中，使得接种后，芽孢杆菌属菌株的浓度会与在嗜热乳酸菌起子培养的背景下的上述浓度相当。这意味着用一种或多种芽孢杆菌属菌株接种乳基质，以使乳基质中所述物种的活芽孢杆菌属细菌的浓度达到10

特别优选的是，将一种或多种芽孢杆菌属菌株以10

在本发明的方法中，优选的是，起子培养物具有酸化能力，使得发酵乳产品的pH在小于12小时，优选小于10小时，更优选小于9小时，更优选小于8小时，最优选小于7小时内达到4.3。

在本发明方法的优选实施方案中，目标pH为3.80-4.39，优选3.80-4.38，更优选3.80-4.37，更优选3.80-4.36，更优选3.80-4.35，更优选3.80-4.34，更优选3.80-4.33，更优选3.80-4.32，更优选3.80-4.31，更优选3.80-4.30，更优选3.90-4.30，最优选4.00-4.30。

在本发明的优选实施方案中，用于起子培养物发酵的乳基质的蛋白质含量为1重量％(w/w)至8.0重量％(w/w)，优选1.2重量％(w/w)至7.0重量％(w/w)，更优选1.4重量％(w/w)至6.0重量％(w/w)，优选1.6重量％(w/w)至5.0重量％(w/w)，优选1.8重量％(w/w)至4.5重量％(w/w)，最优选2.0重量％(w/w)至4.0重量％(w/w)。

在本发明的优选实施方案中，用于由起子培养物发酵的乳基质的脂肪含量为1重量％(w/w)至8.0重量％(w/w)，优选1.2重量％(w/w)至7.0重量％(w/w)，更优选1.4重量％(w/w)至6.0重量％(w/w)，优选1.6重量％(w/w)至5.0重量％(w/w)，优选1.8重量％(w/w)至4.5重量％(w/w)，最优选2.0重量％(w/w)至4.0重量％(w/w)。

在优选的实施方案中，接种的嗜热链球菌细胞的浓度是每毫升乳基质10

优选，通过使用本文所定义的方法，相对于在相同条件下，在不存在任何芽孢杆菌属菌株的情况下相同乳基质的发酵，可以获得的发酵乳制品剪切应力、凝胶刚度和/或凝胶硬度的增加为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％或至少500％。

在一个优选的实施方案中，相对于在相同条件下，在不存在任何芽孢杆菌属菌株的情况下通过发酵相同乳基质所获得的相应发酵乳制品，发酵乳制品的剪切应力的增加为至少5Pa、至少10Pa、至少15Pa、至少20Pa、至少25Pa或至少30Pa。

在另一个优选的实施方案中，相对于在相同条件下，在不存在任何芽孢杆菌属菌株的情况下通过发酵相同乳基质所获得的相应发酵乳制品，发酵乳制品的凝胶刚度的增加为至少25Pa、至少50Pa、至少100Pa、至少150Pa、至少200Pa、至少250Pa或至少300Pa。

在又一个优选的实施方案中，发酵乳制品的凝胶硬度的增加为至少50(g x sec)、至少75(g x sec)、至少100(g x sec)、至少125(g x sec)、至少150(g x sec)、至少175(gx sec)或至少200(g x sec)。

在本发明的具体实施方案中，通过实施例2定义的方法测量剪切应力。

在本发明的具体实施方案中，使用实施例2定义的方法将凝胶刚度确定为复数模量。

用于生产嗜热发酵乳制品的组合物，其包含

(a)乳酸菌起子培养物，其包含至少一种嗜热链球菌菌株和至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，和

(b)选自由孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株组成的组的芽孢杆菌属菌株，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，所述培养物是在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长的培养物，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

本发明的嗜热发酵乳制品是指通过对嗜热起子培养物的嗜热发酵而制备的发酵乳制品，并且其选自包括例如凝固型酸奶、搅拌型酸奶和饮用酸奶例如养乐多的组。

本发明的具体实施方案涉及嗜热发酵乳制品，其包含：

(a)乳酸菌起子培养物，其包含至少一种嗜热链球菌菌株和至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，和

(b)选自孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株和孢子形成阴性凝结芽孢杆菌菌株的芽孢杆菌菌株，其中孢子形成阴性菌株是在经受以下方法时不形成孢子的菌株：

i)将1％的待测菌株培养物接种到500ml带挡板摇瓶中含有的50ml标准孢子形成诱导培养基中，使该培养物在37℃、180rpm下在小牛肉浸液肉汤(VIB)中过夜生长，

ii)使接种的培养基在37℃下过夜生长，同时使其以200rpm振荡，以及

iii)第二天测试孢子。

实施例

实施例1:获得枯草芽孢杆菌纳豆亚种DSM 32589的孢子形成阴性突变体

枯草芽孢杆菌纳豆亚种DSM 32589用作母菌株。通过UV诱变获得母菌株的孢子形成阴性突变体，然后选择孢子形成阴性表型，并进行稳定性测试。

材料:

用双蒸馏水将体积调节至1升。调节pH至7.6。如果要立即使用，进行高压灭菌并冷却至50℃。在使用前，添加以下无菌过滤溶液：

1M Ca(NO3)2 1ml(23.62g/100ml,取决于MW)

0.01M MnCl2 1ml(0.31g/100ml，具有4H2O)

1mM FeSO4 1ml(0.051g/100ml，具有7H2O)

选择:

将4x4ml未稀释的母菌株培养物置于开放的皮氏培养皿中，放入UV交联剂(Amersham Life Science)中，并且以四种不同的时间表，暴露于可能的最高效果70mJ/cm

紫外线辐射后，立即将2x1ml细胞接种到2x5ml的小牛肉浸液肉汤(VIB)Difco234420中。通过将10倍稀释液一式两份接种在Blood Agar(BA)板上，测定UV辐射后的细胞活力。将平板和试管均在黑暗中于37℃孵育过夜(试管为175rpm)。

表1

四个样品中的每一个都存放在内部菌种保藏中心。

将两个UV突变池样品即2x5min和4x5min铺展在孢子形成诱导琼脂(Difco孢子形成培养基，DSM)上并在37℃下孵育3天。孢子形成阴性表型被鉴定为裂解菌落或看起来比孢子形成阳性菌落颜色更浅/更透明的菌落。从2x5min样品获得了四个孢子形成阴性菌落，并且从4x5min样品获得了23个孢子形成阴性菌落。将选择的菌落铺展在DSM琼脂上以纯化，并通过显微术检查孢子。

从4x5min样品选择5个菌落，随后保藏为DSM 32892、DSM 32893、DSM 32894、DSM32895和DSM 33182。

稳定性测试：

对获得的所有菌株进行稳定性测试。

在方孔的96个深孔微量培养板中进行稳定性测试。

四次每天转移到新鲜的孢子形成诱导肉汤中，每孔500μl(Difco孢子形成培养基，DSM)，在37℃下孵育，200rpm振荡。最后一次转移后进行孢子测试。

另外，用DSM培养基在37℃、200rpm下跨周末运行(生长3天)。

孢子测试：

将每个菌株75μl的两等分试样在90℃加热15min，并在PCR机中在80℃下加热10min。对于每一菌株和每次热处理，将10μl点在BA琼脂上，并在37℃下24和48小时后检查生长情况–只有孢子形成阳性菌株会生长。当也通过显微镜检查时，所有菌株均始终是孢子形成阴性的。

测序:

对两个菌株DSM 32892和DSM 32893进行了基因组测序。

DSM 32892的结果：在不知与孢子形成有关的基因中有2个突变。

DSM 32893的结果：在spo0F基因有1个突变，已知是孢子形成所必需的。在不知与孢子形成有关的2个基因之间的区域中有1个突变。

实施例2：在酸奶油制备过程中孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种减少了酸化时间并改善了流变性

在与嗜温起子培养物(以下称为MO-1)共培养的情况下，测试了实施例1生产的15个孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株在低脂酸乳中的质构化性能。四个菌株来自实施例1的2x5min样品，11个菌株来自实施例的4×5min样品。测试了实施例1的样品。测试了所有五个作为DSM 32892、DSM 32893、DSM 32894、DSM 32895和DSM 33182保藏的菌株。

菌株

嗜温起子(MO-1)：包含许多乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和许多乳酸乳球菌乳脂亚种菌株的乳球菌起子培养物。

乳基质

表2

发酵

发酵在200ml低脂酸奶油乳基质中于30℃的温度进行，直到达到目标pH 4.55。用pH电极测量pH。将MO-1培养物以0.01％的浓度添加到乳基质中。将芽孢杆菌属菌株添加到乳基质中，以达到每毫升10exp08个细胞的最终细胞计数。

测量

复数模量和剪切应力

生产后两天，将发酵的乳制品升至13℃，并用勺子(5次)手动轻轻搅拌，直至样品均质。在流变仪(带ASC(自动换样器)的Anton Paar Physica流变仪，

保持时间(重建到某些原始结构)

5分钟，不对样品施加任何物理应力(振荡或旋转)。

振荡步骤(分别测量弹性模量和黏性模量，即G'和G”，因此计算复数模量G*)

恒定应变＝0.3％，频率(f)＝[0.5...8]Hz

60s(秒内)6个测量点(每10s一个)

旋转步骤(以300 1/s测量剪切应力)

设计了两个步骤：

1)剪切速率＝[0.3-300]1/s和2)剪切速率＝[275-0.3]1/s。

每个步骤在210s内包含21个测量点(每10s)。

选择在流动曲线峰值点处的剪切应力用于进一步分析。

复数模量G*是表示凝胶刚度的参数。

结果-酸化

表3

Spo(-)：孢子形成阴性

从表3中可以看出，与没有芽孢杆菌属菌株的起子培养物相比，所有15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物的酸化时间均显著减少。此外，与具有孢子形成阳性母菌株DSM 32589的起子培养物相比，15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物中有14个的酸化时间显著更低。

结果–质构化能力

表4

Spo(-)：孢子形成阴性

从表4可以看出，与没有芽孢杆菌属菌株的起子培养物相比，所有15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物的剪切应力和复数模量(凝胶刚度)均显著增加。此外，对于30.2Hz下的剪切应力，与具有孢子形成阳性母菌株DSM32589的起子培养物相比，15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物中有13个的剪切应力明显更高。此外，对于300Hz下的剪切应力，与具有孢子形成阳性母菌株DSM 32589的起子培养物相比，所有15个包含孢子形成阳性母菌株DSM32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物的剪切应力处于相同水平。此外,与具有孢子形成阳性母菌株DSM 32589的起子培养物相比，15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物中有6个的复数模量显著更高。

总体而言，孢子形成阳性母菌株DSM 32589的15个孢子形成阴性突变体的质构化能力与孢子形成阳性母菌株DSM 32589的高水平处于相同的水平。

实施例3：在酸奶制备过程中孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种减少的酸化时间并改善了流变性

在与商业嗜热起子培养物Yoflex Premium 1.0(以下称为Premium)共培养的情况下，测试了实施例1生产的15个孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆菌株(实施例2中测试的15个相同菌株)在酸奶乳基质中的质构化性能。

菌株

嗜热酸奶起子培养物：商业Yoflex Premium 1.0，含有许多嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

乳基质

表5

发酵

发酵在43℃的温度下进行，直到达到目标pH 4.55。用pH电极测量pH。将芽孢杆菌属菌株添加到乳基质中，以达到每毫升10exp08细胞的最终细胞计数。

测量

复数模量和剪切应力

以与实施例2相同的方式测量复数模量和剪切应力。

结果-酸化

表6

Spo(-)：孢子形成阴性

从表6中可以看出，与没有芽孢杆菌属菌株的起子培养物相比，15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物中有13个的酸化时间都显著减少。此外，与具有孢子形成阳性母菌株DSM 32589的起子培养物相比，15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物的酸化时间略高。

结果–质构化能力

表7

Spo(-)：孢子形成阴性

从表7中可以看出，与没有芽孢杆菌属菌株的起子培养物相比，所有15个包含芽孢形成阳性母菌株DSM 32589的芽孢形成阴性突变体的培养共混物在30.2Hz和300Hz下的剪切应力均显著增加。而且，与没有芽孢杆菌属菌株的起子培养物相比，所有11个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物的复数模量均增加。

此外，与具有孢子形成阳性母菌株DSM 32589的起子培养物相比，所有15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物在30.2Hz和300Hz下的剪切应力均显著增加。此外，与具有孢子形成阳性母菌株DSM 32589的起子培养物相比，15个包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的孢子形成阴性突变体的培养共混物中有10个的复数模量显著更高。

总体而言，孢子形成阳性母菌株DSM 32589的15个孢子形成阴性突变体的质构化能力处于比孢子形成阳性母菌株DSM 32589的高水平甚至更高的水平。

实施例4：在酸奶制备过程中孢子形成阴性枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株DSM 33181减少了酸化时间并改善了流变性

保藏为DSM 33181的菌株是实施例1生产的23+4个菌株之一。1)在与生产酸奶油的嗜温起子培养物共培养的情况下，和2)在与生产酸奶的酸奶起子培养物共培养的情况下，在酸化时间和剪切应力方面测试了该菌株。为了比较，使用没有任何芽孢杆菌属菌株和具有孢子形成阳性芽孢杆菌属母菌株的相应的起子培养物。

对于酸奶油的生产，嗜温起子培养物、乳基质、发酵程序和测量方法与实施例2所述相同。对于酸奶的生产，酸奶起子培养物、乳基质、发酵程序和测量与实施例3所述相同。

结果-酸化

表8

从表8可以看出，与没有芽孢杆菌属菌株的起子培养物相比，包含DSM 33181的培养共混物和包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的培养共混物的酸化时间均显著减少。

结果–质构化能力

表9

从表9可以看出，与没有芽孢杆菌属的起子培养物相比，包含DSM 33181的培养共混物和包含孢子形成阳性母菌株DSM 32589的培养共混物在75.2Hz和300Hz下的剪切应力均显著增加。

保藏和专家解决方案

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2017-08-16日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(Leibniz Institute DSMZ-GermanCollection of Microorganisms and Cell Culture(DSMZ),Inhoffenstr.7B,38124Braunschweig,Germany)，保藏编号为DSM 32588。

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2017-08-23日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ)，保藏编号为DSM 32606.

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2017-08-16日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ)，保藏编号为DSM 32589.

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2018-08-08日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ),保藏编号为DSM 32892.

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2018-08-08日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ),保藏编号为DSM 32893.

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2018-08-08日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ),保藏编号为DSM 32894.

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2018-08-08日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ),保藏编号为DSM 32895.

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2019-06-19日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ),保藏编号为DSM 33181.

菌株枯草芽孢杆菌纳豆亚种于2019-06-19日保藏在德国布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124的莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ),保藏编号为DSM 33182.

保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》进行的。

申请人要求保藏的微生物样品应仅提供给申请人批准的专家使用。

参考文献

[1]Tasneem et al.(2013)Crit Rev Food Sci Nutr.,54(7):869-79.

[2]WO 2011/026863

[3]US 2009/0011081 A1

[4]US 5077063

[5]CN 103300147 A

[6]CN 103190478 A

[7]US 3,674,508

[8]WO 2017/005601 A

[9]Mehta et al.(2016),Journal of Animal Science,vol.94No.supplement5,p.264-265

本专利文件中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。