心脏、骨骼肌和肌肉干细胞中的体内同源性定向修复

摘要

公开了使用通过病毒递送的靶向序列的核酸酶和供体序列对骨骼肌和心肌进行基因组修饰的方法。

说明书

相关申请

本申请要求2018年5月3日提交的美国临时申请序列号62/666,685的权益，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。

背景技术

靶向序列的核酸酶诸如CRISPR/Cas9通过参与DNA双链断裂(DSB)修复的细胞机制，提供强大的工具来编辑哺乳动物基因组。非同源末端连接(NHEJ)和同源性定向修复(HDR)是细胞修补核酸酶产生的DSB并防止基因组损伤和细胞死亡所用的主要途径。虽然NHEJ在整个细胞周期和非分裂细胞中均有活性，但由于高度不可预测的核苷酸插入和缺失，这种容易出错的途径会产生可变的序列结果。

相反，HDR提供更精确的基因编辑结果，以及引入全新序列元件的独特能力，但通常认为HDR在有丝分裂后器官中的效率低下，并且需要存在于内源染色体或外源模板上的同源DNA。虽然最近的研究已经研究了CRISPR诱导的HDR在培养的细胞、受精卵中以及局部递送到特定组织中的用途，但尚未测试在出生后的哺乳动物中实现体内多器官HDR的可行性。此外，尚待探索是否可以在再生干细胞中实现体内HDR靶向，从而提供经编辑的细胞库来支持正在进行的组织更新和修复。

发明内容

发明人惊奇且意外地发现，小鼠出生后的心肌、骨骼肌和肌肉干细胞在不同发育时间点经受模板化的同源性定向修复(HDR，也称为同源重组)。这为通过HDR在骨骼肌和心肌中进行精确、靶向的基因替换提供了意外的机会，这两种主要的有丝分裂后组织一直被广泛认为无法通过这种方法获得。据我们所知，此数据通过CRISPR/Cas9的全身性AAV递送，首次证明了在出生后的心脏中显著进行体内HDR编辑，并且代表比先前报道的通过局部、肌肉内递送在骨骼肌中可实现的HDR编辑率的实质性改善。本文所述的发明还首次证明了组织干细胞在其天然生态位内成功进行HDR编辑，这将独特地实现在治疗上和实验上定向操作干细胞基因组，而无需分离、扩增或移植这些稀有细胞。最终，在新生的哺乳动物心脏和出生后的哺乳动物骨骼肌卫星细胞中刻入不可逆且可能持久的精确基因组修饰的能力为包括杜兴氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy)(DMD)在内的许多目前难治的心脏疾病和肌肉疾病的未来治疗性干预开辟了令人兴奋的新途径。

本发明的一些方面涉及在受试者体内(例如，在肌肉前体生态位中)修饰肌肉前体细胞的基因组的方法，其包括使所述肌肉细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒在所述肌肉前体细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在所述肌肉前体细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。

在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列和供体模板的第一病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板的第二病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和一个或多个(例如，一个或两个)gRNA的第二病毒。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)或其功能片段。

在一些实施方案中，编码靶向序列的核酸酶的核酸序列使用肌肉前体细胞特异性启动子、组成型启动子或遍在型启动子来转导。在一些实施方案中，编码供体模板和任选地一个或多个gRNA的核酸序列使用U6启动子或H1启动子来转导。在一些实施方案中，所述肌肉前体细胞是肌肉干细胞。

在一些实施方案中，所述受试者中至少1％的肌肉前体细胞被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。在一些实施方案中，所述修饰是一个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述修饰是两个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述受试者(例如，人类或小鼠)不是婴儿或幼年或30岁以下。

在一些实施方案中，所述病毒是AAV血清型6、8、9、10或Anc80。在一些实施方案中，向所述受试者全身性施用所述病毒或通过肌肉内注射来施用所述病毒。

本公开的一些方面涉及包含具有通过本文公开的方法修饰的基因组的核(例如，肌核)的肌纤维。

本公开的一些方面涉及在受试者体内修饰心脏细胞的基因组的方法，其包括使所述心脏细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒在心脏细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在心脏细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入，并且其中所述心脏细胞是DNA合成的心脏细胞或复制的心脏细胞。

在一些实施方案中，所述心脏细胞选自由哺乳动物有丝分裂后心肌细胞、能进行DNA合成而无需分裂/增殖的哺乳动物有丝分裂后心肌细胞、人类有丝分裂后心肌细胞、能进行DNA合成而无需分裂/增殖的人类有丝分裂后心肌细胞、心肌细胞前体细胞、增殖的间充质心脏细胞、增殖的内皮心脏细胞和心脏祖细胞组成的组。

在一些实施方案中，所述受试者(例如，人类或小鼠)是婴儿或幼年或30岁以下的人(如果是人类)。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列和供体模板的第一病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板的第二病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和一个或多个gRNA的第二病毒。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)或其功能片段。在一些实施方案中，编码靶向序列的核酸酶的核酸序列使用心脏特异性启动子、遍在型启动子或非特异性启动子来转导。

在一些实施方案中，所述病毒是AAV血清型6、8、9、10或Anc80。在一些实施方案中，所述受试者中至少1.6％的心肌细胞被修饰。

本公开的一些方面涉及包含通过本文公开的方法修饰的心肌细胞的心脏组织。

本公开的一些方面涉及通过同源性定向修复在受试者体内靶向特定横纹肌类型进行基因组修饰的方法，其包括使用一种或多种病毒全身性施用，其中所述一种或多种病毒在横纹肌细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在横纹肌细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入，并且其中，由于所述受试者的年龄，基因组修饰优先发生在至少一种类型的横纹肌上。在一些实施方案中，肌肉细胞(例如肌肉祖细胞)的基因组被优先修饰。在一些实施方案中，心脏细胞(例如，增殖的或DNA合成的心脏细胞)的基因组被优先修饰。

参考本发明的以下详细描述，本发明的上文讨论的以及许多其他特征和伴随的优点将变得更好理解。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一张彩绘附图。根据要求并支付必需费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。

图1A-图1J示出了GFP/BFP颜色转换报告系统，其能够区分并跟踪NHEJ编辑的成肌细胞和HDR编辑的成肌细胞。(图1A)是用于区分HDR与不精确的NHEJ的蓝色/绿色颜色转换报告的示意图。不精确的NHEJ破坏GFP荧光，而HDR取代使光谱从GFP偏移到BFP，并产生用于RFLP分析的BtgI限制性位点。(图1B)示出了用于转染和病毒产生的AAV构建体。ITR，反向末端重复序列；U6，U6启动子；CMV，CMV启动子；NLS，核定位信号；pA：polyA。(图1C)提供了实验设计。从携带单一CAG-GFP等位基因的小鼠中分离出骨骼肌干细胞(卫星细胞)，并使用(图1B)中示出的质粒构建体进行转染。转染的细胞在培养物中扩增，然后基于蓝色或绿色荧光进行分选，用于肌肉内移植到受伤前的受体小鼠中。(图1D，图1E)是仅使用gRNA-BFP模板转染的成肌细胞(图1D，对照)或使用SaCas9和gRNA-BFP模板转染的成肌细胞(图1E，实验)的代表性流式细胞术分析。(图1F，图1G)示出了在对照或实验培养物中的CRISPR-HDR编辑的BFP+成肌细胞(图1F)和CRISPR-NHEJ编辑的GFP-/BFP-成肌细胞(图1G)的频率(％)。个别数据点显示与平均值±SD重叠，并代表N＝3次独立转染。**p<0.01，***p<0.001，非配对双尾t检验，DF＝4。(图1H)示出了经编辑的BFP+SMP保留成肌可能性。通过FACS分离GFP+和BFP+骨骼肌祖细胞，并且向mdx小鼠的胫骨前(TA)肌肉注射GFP+(下排)或CRISPR/Cas9-HDR-编辑的BFP+(上排)干细胞。然后通过BFP或GFP的荧光检测来检查TA。比例尺，50um。绿色，GFP；蓝色，BFP；红色，小麦胚芽凝集素(WGA)；白色，TO-PRO-3。(图1I)示出了在GFP基因座处的PCR扩增，然后是FACS分选的转染细胞的BtgI消化。发现了三个不同的群体：GFP+SMP(无编辑)、BFP+SMP(HDR)和GFP-/BFP-SMP(NHEJ)。(图1J)示出了分选的CRISPR/Cas9-HDR编辑的BFP+SMP在扩增后保留BFP表达。两周的扩增后，对BFP+SMP进行分析。

图2A-图2G示出了全身性AAV-CRISPR能够在三周龄的GFP

图3A-图3D示出了卫星细胞在体内可通过CRISPR-HDR被靶向，并保留在体外融合和形成肌管的能力。(图3A)示出了来自静脉内注射仅媒介物或AAV-GFPgRNA-BFP模板(作为对照)或AAV-GFPgRNA-BFP模板和AAV-SaCas9以实现CRISPR-NHEJ和CRISPR-HDR的幼年mdx小鼠的骨骼肌卫星细胞的代表性流式细胞术分析。(图3B，图3C)示出了CRISPR-HDR编辑的BFP+卫星细胞(图3B)和CRISPR-NHEJ编辑的GFP-/BFP-卫星细胞(图3C)的频率(％)。个别数据点显示与平均值±SD重叠；N＝4只小鼠注射AAV-Cas9和AAV-gRNA-模板(实验)，N＝3只小鼠注射仅AAV-gRNA-模板(对照)，N＝3只小鼠注射媒介物。*p<0.05，n.s.，不显著，在(图3B)中，p＝0.999，在(图3C)中，p＝0.7737，使用Tukey多重比较检验的单向ANOVA，DF＝7。(图3D)示出了从FACS分选的体内AAV-HDR注射的GFP+(未编辑的)、BFP+(HDR)和GFP-/BFP-(NHEJ)卫星细胞中分化的肌管的代表性荧光检测。比例尺，100um。绿色，GFP；蓝色，BFP；红色，肌球蛋白重链(MHC)；白色，TO-PRO-3。

图4A-图4F示出了在P3小鼠中通过AAV8递送颜色转变系统展示了对体内CRISPR-HDR靶向的组织依赖性时间限制。(图4A)示出了实验设计。向携带单一CAG-GFP等位基因的P3幼崽(野生型和MDX)注射仅携带GFPgRNA-BFP模板的AAV(对照)或AAV-GFPgRNA-BFP模板加AAV-SaCas9。4周后收获器官用于荧光和基因组分析。(图4B，图4D，图4F)示出了用于检测在腹膜内注射AAV-GFPgRNA-BFP模板和AAV-SaCas9(实验)或仅AAV-GFPgRNA-BFP模板(对照)后，在GFP

图5A-图5D示出了GFP/BFP颜色转换报告系统部件的体外测试。(图5A)示出了代表性的FACS图，其示出了GFP和BFP可以通过流式细胞术区分。使用CAG-GFP或CAG-BFP的质粒转染mdx TTF(无荧光蛋白)，并在3天后通过流式细胞术来分析。(图5B)示出了颜色转换取代和GFPgRNA的设计。2个碱基取代引起光谱偏移并产生用于限制性片段长度多态性(RFLP)分析的BtgI位点。选择在取代位点附近靶向GFP的3个SaCas9兼容的gRNA。GFPgRNA2的切割最接近所需的颜色确定碱基，并且HDR取代使此gRNA无法识别，这保护了BFP模板和基因组HDR产物免受Cas9的进一步靶向。(图5C)示出了GFPgRNA对GFP的破坏。使用仅SaCas9(对照)或使用SaCas9加靶向GFP的三种gRNA中的一种(参见图5B)来转染GFP

图6A-图6C示出了离体CRISPR-NHEJ和HDR编辑的成肌细胞的分化和测序确认。(图6A)示出了从FACS分选的先前使用SaCas9和GFPgRNA-BFP模板转染的GFP+(未编辑的)、BFP+(CRISPR-HDR编辑的)和GFP-/BFP-(CRISPR-NHEJ编辑的)成肌细胞中分化的肌管的代表性荧光图像。比例尺，100um。绿色，GFP；蓝色，BFP；红色，肌球蛋白重链(MHC)。(图6B)示出了来自FACS分选的、培养扩增的成肌细胞的基因组PCR产物的限制性片段长度多态性(RFLP)分析。M，标志物。(图6C)示出了与GFP和BFP参考序列比对的基因组扩增子的Sanger测序，确认了分选的BFP+细胞中的HDR以及在分选的GFP-/BFP-细胞中的NHEJ。

图7示出了全身性AAV-CRISPR在幼年mdx动物的胫骨前肌的肌纤维中能够实现体内CRISPR-NHEJ和CRISPR-HDR编辑。用于检测在接受AAV对照(仅GFPgRNA-BFP模板)或AAV实验(gRNA-模板+SaCas9)的小鼠的胫骨前肌中的CRISPR-NHEJ编辑的(GFP-/BFP-)和CRISPR-HDR编辑的(BFP+)细胞的代表性荧光图像。每个图像由20x图像的25个组图拼接在一起。比例尺，200um。绿色，GFP；蓝色，BFP；红色，小麦胚芽凝集素(WGA)；白色，TO-PRO-3。

图8A-图8B示出了通过重新分选GFP+、GFP-/BFP-和BFP+细胞，确认体内CRISPR-NHEJ和HDR编辑的骨骼肌卫星细胞。(图8A)示出了代表性流式细胞术数据，其示出了从先前静脉内注射仅媒介物AAV-GFPgRNA-BFP模板(作为对照)或AAV-GFPgRNA-BFP模板和AAV-SaCas9的幼年mdx小鼠中分离的骨骼肌卫星细胞对GFP和BFP表达的分析。示出了用于分离GFP+(未编辑的)、GFP-/BFP-(NHEJ编辑的)和BFP+(HDR编辑的)细胞的分选门。将分选的群体分别在培养物中进行2周扩增，然后收获用于重新分析(在图8B中示出)。(图8B)示出了先前从AAV-HDR注射的小鼠中分选的培养扩增的GFP-/BFP-、GFP+和BFP+细胞中的GFP和BFP表达的代表性流式细胞术分析。

图9A-图9B示出了全身性AAV-CRISPR能够实现新生的C57BL/6J动物中的体内CRISPR-NHEJ和CRISPR-HDR编辑。用于检测在向新生的GFP

图10A-图10C示出了体内CRISPR-NHEJ和CRISPR-HDR编辑的基因组PCR和下一代测序验证。(图10A)示出了GFP/BFP基因组转基因基因座和用于基因组PCR的引物的示意图。正向引物与基因组序列上的GFP/BFP起始位点的上游结合，而不是与模板DNA结合，而反向引物与Cas9切割位点和颜色转换取代的下游结合。此引物对扩增基因组转基因基因座，而不扩增模板序列(由于模板中不存在正向引物结合序列)。(图10B)示出了来自P21 AAV-HDR注射的GFP

图11A-图11C示出了全身性AAV-CRISPR-HDR很少靶向新生骨骼肌中的卫星细胞。(图11A)示出了在腹膜内注射仅AAV-GFPgRNA-BFP模板(作为对照)或AAV-GFPgRNA-BFP模板和AAV-SaCas9以实现CRISPR-NHEJ和CRISPR-HDR 4周后，从新生的(P3)mdx小鼠和C57BL/6小鼠中分离的骨骼肌卫星细胞的代表性流式细胞术分析。(图11B，图11C)示出了CRISPR-HDR编辑的BFP+卫星细胞(图11B)和CRISPR-NHEJ编辑的GFP-/BFP-卫星细胞(图11C)的频率(％)。个别数据点显示与平均值±SD重叠；N＝2只mdx小鼠、N＝3只C57BL6小鼠注射AAV-Cas9和AAV-gRNA-模板(实验)；N＝1只mdx小鼠、N＝2只C57BL6小鼠仅注射AAV-gRNA-模板(对照)。*p<0.05，使用Tukey多重比较检验的单向方差分析(ANOVA)，DF＝4。

图12示出了CRISPR介导的编辑结果导致在3天龄(P3)或21天龄(P21)治疗的小鼠中的GFP小鼠中肝脏、心脏和胫骨前中的GFP荧光强度降低。

图13示出了CRISPR介导的编辑结果产生BFP荧光，并导致AAV-CRISPR注射的P21(在治疗时为21日龄小鼠)胫骨前中的GFP荧光强度降低。对于每个直方图，n＝1400。在ImageJ中，将个别肌肉纤维作为单独的目标区域圈起来，并使用“测量”功能测量每根纤维中的平均荧光强度。使用Prism 8生成直方图。使用Mann-Whitney U检验比较中位数。

图14示出了HDR编辑的肌肉中的层下单核细胞是BFP+。卫星细胞被定义为层下单核细胞。

具体实施方式

本文描述了通过HDR在骨骼肌和心肌中进行精确、靶向的基因替换的方法，这两种主要的有丝分裂后组织一直被广泛认为无法通过这种方法获得。具体地说，通过CRISPR/Cas9的全身性AAV递送，我们证明了出生后心脏中的显著体内HDR编辑，并极大提高了骨骼肌中的HDR编辑率。本文所述的方法还实现了组织干细胞在其天然生态位内的HDR编辑，从而允许在治疗上和实验上定向操作干细胞基因组，而无需分离、扩增或移植这些稀有细胞。

本公开的一些方面涉及在受试者体内修饰肌肉前体细胞的基因组的方法，其包括使所述肌肉细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒在所述肌肉前体细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在所述肌肉前体细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入(例如，通过与供体序列同源重组)。同源重组(HR)介导的修复(也称为同源性定向修复(HDR))使用同源供体DNA作为模板来修复双链DNA断裂。如果供体DNA的序列与基因组序列不同，则此过程导致序列改变引入到基因组中。

如本文所用，短语“基因组修饰”涵盖通过同源重组(即，插入与供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列)来添加调控序列或编码基因产物的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述修饰包括通过同源重组使用非病理性基因组区域来替换与疾病或病状(例如，遗传突变)相关联的基因组区域。例如，在一些实施方案中，所述修饰包括使用野生型或非突变的基因组区域来替换包含突变的基因组区域。在一些实施方案中，所述突变包括取代或缺失突变。在一些实施方案中，所述修饰包括通过同源重组在基因组中插入对应于缺失突变的缺失部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因组的修饰包括通过调节基因产物的表达、活性或稳定性的同源重组来插入和/或替换基因组序列。在一些实施方案中，所述基因组的修饰包括受试者的两个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述基因组的修饰包括受试者的一个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述基因组修饰包括与生物过程相关联的一个或多个基因的修饰。在一些实施方案中，所述生物过程包括表观遗传调控或蛋白内稳态(例如自噬、泛素-蛋白酶体、热休克反应、抗氧化反应、未折叠蛋白反应)。

如本文所用，“受试者”意指人类或动物(例如灵长类动物)。通常，所述动物是脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹弥猴(cynomologous monkey)、蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫类物种(例如家猫)、犬类物种(例如狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)、鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前述的任何子集，例如上述所有，但不包括一个或多个组或物种，诸如人类、灵长类动物或啮齿动物。在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文可互换使用。优选地，所述受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。受试者可以是雄性或雌性。在各种实施方案中，“受试者”可以是任何脊椎动物生物体。受试者可以是向其施用剂的个体，例如用于实验、诊断和/或治疗目的或从其中获取样品或在其上执行程序。在一些实施方案中，人类受试者在新生儿与6个月大之间。在一些实施方案中，人类受试者为6个月大与24个月大之间。在一些实施方案中，人类受试者在2与6岁、6与12岁或12与18岁之间。在一些实施方案中，人类受试者在18与30岁、30与50岁、50与80岁之间或大于80岁。在一些实施方案中，所述受试者为至少约5、10、20、30、40、50、60、65、70、75、80、85或90岁。在一些实施方案中，所述受试者小于约5、10、20、30、40、50、60、65、70、75、80、85或90岁。在一些实施方案中，受试者是成人。出于此目的，至少18岁的人被视为成人。在一些实施方案中，所述受试者是幼年(例如，对于人类受试者，小于约18、12或6岁)。在一些实施方案中，所述受试者不是幼年(例如，对于人类受试者，小于约18、12或6岁)。在一些实施方案中，受试者是胚胎。在一些实施方案中，受试者是胎儿。在某些实施方案中，向怀孕的女性施用剂，以便治疗或引起对子宫内的胚胎或胎儿的生物效应。

在一些实施方案中，所述受试者患有累及肌肉组织的疾病或病状。在一些实施方案中，所述受试者患有或已经被诊断患有肌营养不良症。在一些实施方案中，所述肌营养不良症选自肌强直性肌营养不良症、杜兴氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症(Beckermuscular dystrophy)、肢带肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症、眼咽肌营养不良症、远端肌营养不良症和埃默里-德赖富斯肌营养不良症(Emery-Dreifussmuscular dystrophy)。在一些实施方案中，所述肌营养不良症是贝克氏肌营养不良症或杜兴氏肌营养不良症。在一些实施方案中，本文公开的方法用于治疗受试者的疾病或病状。

如本文所用，使细胞与一种或多种病毒“接触”可包括将病毒全身性地(例如，静脉内)或局部地(例如，肌肉内注射)施用到受试者中。可替代地，可以选择其他施用途径(例如，口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌肉内和其他胃肠外途径)。接触的方法不受限制，并且可以是本领域中可用的任何合适的方法。

在一些实施方案中，病毒组合物可以剂量单位配制，以含有对于人类患者在约1.0×10

在一些实施方案中，至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的肌肉前体细胞或其子集的基因组被修饰。在一些实施方案中，至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的肌肉前体细胞或其子集的基因组通过同源重组被修饰(例如，通过同源重组替换或插入基因组序列)。在一些实施方案中，至少约40％或更多的肌肉前体细胞或其子集的基因组通过同源重组被修饰(例如，通过同源重组替换或插入基因组序列)。在一些实施方案中，所述受试者中至少1％的肌肉前体细胞被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。在一些实施方案中，所述受试者中至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的肌肉前体细胞被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。在一些实施方案中，所述修饰包括至少一个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括两个等位基因的修饰。

在整个说明书所公开的方法中使用的合适的病毒包括例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒(例如慢病毒)、痘苗病毒和其他痘病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)等。当被引入宿主细胞时，所述病毒可能含有或可能不含有用于产生感染性病毒的足够的病毒遗传信息，即病毒载体可能具有复制能力或者是复制缺陷型的。

在一些实施方案中，所述病毒是腺相关病毒。腺相关病毒(AAV)是小型(20nm)复制缺陷型非包膜病毒。AAV基因组是长约4.7千碱基的单链DNA(ssDNA)。基因组在DNA链的两端包含反向末端重复序列(ITR)，以及两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。AAV基因组最常整合到19号染色体上的特定位点中。随机掺入基因组的频率可以忽略不计。可通过从载体中去除至少部分rep ORF来消除整合能力，从而产生保持游离状态并至少在非分裂细胞中提供持续表达的载体。为了将AAV用作基因转移载体，在AAV基因组的反向末端重复序列(ITR)之间插入包含可操作地连接到启动子的编码所需蛋白质或RNA(例如编码抑制ATPIF1的多肽或RNA)的核酸序列的核酸。在Snyder,RO和Moullier,P.,Adeno-Associated VirusMethods and Protocols,Methods in Molecular Biology,第807卷.Humana Press,2011中也讨论了腺相关病毒(AAV)及其作为载体的用途，例如用于基因疗法。

在一些实施方案中，AAV是AAV血清型6、8、9、10或Anc80(其在以引用的方式并入本文的WO2015054653中公开)。在一些实施方案中，AAV血清型是AAV血清型2。任何AAV血清型或修饰的AAV血清型都可以适当地使用并且不受限制。

另一种合适的AAV可以是例如rhlO[参见例如，WO 2003/042397]。还可包括其他AAV来源，例如AAV9[参见例如，US 7,906,111；US 2011-0236353-A1]和/或hu37[参见例如，US 7,906,111；US 2011-0236353-A1]、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8[参见例如，美国专利7790449；美国专利7282199]等。这些和其他合适的AAV的序列以及用于产生AAV载体的方法参见例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；美国专利7790449；美国专利7282199；以及US 7588772B2。还可选择其他AAV，任选地考虑所选择的AAV衣壳的组织偏好。重组AAV载体(AAV病毒颗粒)可包含包装在AAV衣壳内的核酸分子，所述核酸分子含有5'AAV ITR、本文所述的表达盒和3'AAV ITR。如本文所述，表达盒可含有用于每个表达盒内的开放阅读框的调控元件，并且所述核酸分子可任选地含有另外的调控元件。

AAV载体可含有全长的AAV 5'反向末端重复序列(ITR)和全长的3'ITR。已经描述了称为AITR的5'ITR的缩短版本，其中缺失了D序列和末端解析位点(trs)。缩写“sc”是指自我互补。“自我互补的AAV”是指其中由重组AAV核酸序列携带的编码区已被设计以形成分子内双链DNA模板的构建体。感染后，不是等待细胞介导的第二条链的合成，而是scAAV的两个互补半部分将缔合以形成准备立即复制和转录的双链DNA(dsDNA)单元。参见例如DMMcCarty等,"Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis",GeneTherapy,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。在例如美国专利号6,596,535；7,125,717；和7,456,683中描述了自我互补的AAV，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。

在要产生假型AAV的情况下，ITR从与衣壳的AAV来源不同的来源中选择。例如，可以选择AAV2 ITR与对于所选择的细胞受体、靶组织或病毒靶具有特定的效率的AAV衣壳一起使用。在一个实施方案中，为了方便和加速监管批准，使用来自AAV2的ITR序列或其缺失型式(AITR)。然而，可以选择其他AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2，而AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，所得载体可称为假型。然而，可以利用其他AAV ITR的来源。

可以使用单链AAV病毒载体。用于产生和分离适用于递送给受试者的AAV病毒载体的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利7790449；美国专利7282199；WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；以及US 7588772B2。在一个系统中，使用编码与ITR侧接的转基因的构建体以及编码rep和cap的构建体来瞬时转染生产细胞系。在第二系统中，使用编码与ITR侧接的转基因的构建体来转染(瞬时地或稳定地)稳定地提供rep和cap的包装细胞系。在这些系统的每一个中，AAV病毒粒子响应于辅助腺病毒或疱疹病毒的感染而产生，需要将rAAV与污染病毒分离。最近，已经开发出不需要感染辅助病毒来恢复AAV的系统，所需的辅助功能(即腺病毒El、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29以及疱疹病毒聚合酶)也由所述系统反式提供。在这些较新的系统中，可以通过使用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可以将细胞工程化以稳定地含有编码辅助功能的基因，所述基因的表达可以在转录或转录后水平进行控制。而在又一系统中，通过使用基于杆状病毒的载体感染，将与ITR侧接的转基因和rep/cap基因导入昆虫细胞中。关于这些生产系统的综述，通常参见例如，Zhang等,2009,"Adenovirus-adeno-associated virushybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,"HumanGene Therapy 20:922-929，所述参考各自的内容以引用的方式整体并入本文。在以下美国专利中也描述了制备和使用这些和其他AAV生产系统的方法，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。

在另一个实施方案中，可以使用其他病毒载体，包括整合病毒，例如疱疹病毒或慢病毒，虽然可以选择其他病毒。适当地，在产生这些其他载体中的一种的情况下，将其生产为复制缺陷型病毒载体。“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有目标基因的表达盒被包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也被包装在所述病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列都是复制缺陷型的；即它们不能产生后代病毒粒子，但保留感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，病毒载体的基因组不包括编码复制所需的酶的基因(基因组可以被工程化为“完全缺失的”，仅含有与人工基因组扩增和包装所需的信号侧接的目标转基因)，但这些基因可在生产过程中提供。

一种或多种病毒可含有在哺乳动物细胞中能够指导表达(例如，靶向序列的核酸酶、供体模板和/或一种或多种gRNA的表达)的启动子，诸如例如来自巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒、猿猴病毒(例如SV40)、乳头瘤病毒、疱疹病毒或其他感染哺乳动物细胞的病毒的合适的病毒启动子，或来自例如，诸如EF1α、泛素(例如泛素B或泛素C)、球蛋白、肌动蛋白、磷酸甘油酸激酶(PGK)等的基因的哺乳动物启动子，或复合型启动子，诸如CAG启动子(CMV早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子的组合)。在一些实施方案中，可使用人类启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自CMV启动子、U6启动子、H1启动子、组成型启动子和遍在型启动子。在一些实施方案中，所述启动子指导特定细胞类型中的表达。例如，肌肉前体细胞特异性启动子。

在本文公开的每种方法的一些实施方案中，本领域普通技术人员可从“TiProD：组织特异性启动子数据库”中列出的组织特异性启动子获得合适的组织特异性启动子，所述数据库可在万维网tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de/上获得。

可在本文公开的方法中使用的靶向序列的核酸酶不受限制，并且可以是本文公开的任何靶向序列的核酸酶。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)或其功能片段或功能变体。

目前有四种主要类型的靶向序列的核酸酶(即可靶向核酸酶、位点特异性核酸酶)在使用：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和RNA指导的核酸酶(RGN)(诸如CRISPR/Cas II型系统的Cas蛋白)以及工程化的大范围核酸酶。ZFN和TALEN包含融合到位点特异性DNA结合结构域(DBD)的限制酶FokI(或其工程化变体)的核酸酶结构域，所述位点特异性DNA结合结构域被适当地设计以将蛋白质靶向所选择的DNA序列。对于ZFN而言，DNA结合结构域(DBD)包括锌指DBD。对于TALEN而言，位点特异性DBD是基于转录激活子样效应物(TALE)所使用的DNA识别代码设计的，所述转录激活子样效应物是在植物病原菌(诸如黄单胞菌属物种)中发现的位点特异性DNA结合蛋白的家族。

簇状规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)II型系统是一种细菌适应性免疫系统，其已被修饰以用作用于基因组工程化的RNA指导的核酸内切酶技术。细菌系统包含称为crRNA和tracrRNA的两种内源细菌RNA，以及CRISPR相关(Cas)核酸酶，例如Cas9。tracrRNA与crRNA具有部分互补性，并与其形成复合物。Cas蛋白由crRNA/tracrRNA复合物指导至靶序列，所述复合物在crRNA序列与靶中的互补序列之间形成RNA/DNA杂合。为了用于基因组修饰，常常将crRNA和tracrRNA组分组合成单一的嵌合指导RNA(sgRNA或gRNA)，其中crRNA的靶向特异性和tracrRNA的特性被组合成单一转录本，所述转录本将Cas蛋白定位于靶序列，使得Cas蛋白可裂解DNA。sgRNA常常包含与所需靶序列互补或同源的约20个核苷酸的指导序列，然后是约80nt的杂合crRNA/tracrRNA。本领域的普通技术人员理解的是，指导RNA不必与靶序列完全互补或同源。例如，在一些实施方案中，其可以具有一个或两个错配。gRNA杂交的基因组序列通常在一侧与前间隔序列临近基序(PAM)序列侧接，但本领域的普通技术人员理解某些Cas蛋白可能对PAM序列有宽松的要求。PAM序列存在于基因组DNA中，但不存在于sgRNA序列中。Cas蛋白将针对具有正确靶序列和PAM序列的任何DNA序列。PAM序列根据衍生Cas蛋白的细菌的物种而变化。Cas蛋白的具体实例包括Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9和Cas10。在一些实施方案中，位点特异性核酸酶包含Cas9蛋白。例如，可使用来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(Sp)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的Cas9。这些Cas9蛋白的PAM序列分别为NGG、NNNNGATT、NNAGAA、NAAAAC。在一些实施方案中，Cas9来自金黄色葡萄球菌(saCas9)。

已经开发了许多位点特异性核酸酶的工程化变体，并且可以在某些实施方案中使用。例如，Cas9和Fok1的工程化变体是本领域中已知的。此外，应理解的是，可使用生物活性片段或变体。其他变化包括使用杂合位点特异性核酸酶。例如，在CRISPR RNA指导的FokI核酸酶(RFN)中，FokI核酸酶结构域融合到催化失活的Cas9蛋白(dCas9)蛋白的氨基末端。RFN充当二聚体并利用两个指导RNA(Tsai,QS等,Nat Biotechnol.2014；32(6):569–576)。产生单链DNA断裂的位点特异性核酸酶也用于基因组编辑。此类核酸酶，有时被称为"切口酶"，可通过在包含两个核酸酶结构域的位点特异性核酸酶(诸如ZFN、TALEN和Cas蛋白)的两个核酸酶结构域中的一个中的关键催化残基处引入突变(例如丙氨酸取代)来产生。此类突变的实例包括SpCas9中的D10A、N863A和H840A或在其他Cas9蛋白中的同源位置处。在一些细胞类型中，切口可以低效率刺激HDR。靶向彼此靠近且在相反链上的一对序列的两个切口酶可在每条链上产生单链断裂(“双切口”)，从而有效地产生DSB，其可任选地使用供体DNA模板通过HDR来进行修复(Ran,F.A.等Cell 154,1380-1389(2013))。在一些实施方案中，Cas蛋白是SpCas9变体。在一些实施方案中，SpCas9变体是R661A/Q695A/Q926A三重变体或N497A/R661A/Q695A/Q926A四重变体。参见Kleinstiver等,“High-fidelity CRISPR–Cas9nucleases with no detectable genome-wide off-target effects,”Nature,第529卷,第490-495页(以及补充材料)(2016)；其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，Cas蛋白是C2c1，一种2类V-B型CRISPR-Cas蛋白。参见Yang等,“PAM-Dependent Target DNARecognition and Cleavage by C2c1 CRISPR-Cas Endonuclease,”Cell,第167卷,第1814–1828页(2016)；其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，Cas蛋白是US20160319260“Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with Altered PAM Specificity”中描述的一种，其以引用的方式并入本文。

编码靶向序列的核酸酶的核酸应足够短，以被包含在病毒(例如AAV)中。在一些实施方案中，编码靶向序列的核酸酶的核酸小于4.4kb。

在一些实施方案中，靶向序列的核酸酶与天然存在的可靶向核酸酶具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的多肽序列同一性。

在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列和供体模板的第一病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括第一病毒，所述第一病毒转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列、供体模板和一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个等)gRNA。在本文所述的方法的实施方案中，其中单个病毒转导靶向序列的核酸酶、供体模板以及任选地一个或多个gRNA，本领域普通技术人员可以选择能够包装所需核苷酸序列的合适病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板的第二病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个等)gRNA的第二病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和两个gRNA的第二病毒。在一些实施方案中，第一病毒与第二病毒的比率为约1:3至约1:100，包括中间比率。例如，第一病毒与第二病毒的比率可以是约1:5至约1:50，或约1:10，或约1:20。虽然不作为优选的，但所述比率可以是1:1，或者可以有更多第二病毒。

在一些实施方案中，所述方法包括由非病毒构建体(例如“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA)介导的一种或多种组分(例如，编码靶向序列的核酸酶的核酸、供体模板、一个或多个gRNA(例如两个gRNA))的递送；与各种递送组合物和纳米颗粒结合，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、聚聚糖组合物和其他聚合物、基于脂质和/或胆固醇的核酸缀合物以及其他构建体，诸如本文所述的构建体。参见例如，X.Su等,Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),第774-787页；网络出版物:2011年3月21日；WO2013/182683,WO 2010/053572和WO 2012/170930，所有参考以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，通过本文公开的方法修饰其基因组的所述肌肉前体细胞是肌肉干细胞(例如，成人肌肉干细胞)。然而，所述肌肉前体细胞不受限制。在一些实施方案中，所述受试者中至少1％的肌肉前体细胞(例如肌肉干细胞)被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。在本发明的其他实施方案中，本文公开的方法包括肌纤维细胞的修饰。在一些实施方案中，肌肉前体细胞和肌纤维细胞的基因组均被修饰。在一些实施方案中，肌纤维细胞的基因组未被修饰或基本上未被修饰。

本发明的一些方面涉及通过用本文公开的方法修饰肌肉前体细胞(例如卫星细胞)的基因组来制备具有修饰的基因组的肌纤维的方法。修饰的肌纤维包括一个或多个修饰的肌肉前体细胞核。在一些实施方案中，所述肌纤维包括至少一个、两个、三个、四个、五个、十个、二十个、五十个、七十五个、一百个、两百个、两百五十个、三百个、四百个或更多个修饰的核。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、51％、60％、70％、90％、95％或99％的肌纤维的核具有通过本文公开的方法修饰的基因组。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、51％、60％、70％、90％、95％或99％的受试者的肌纤维具有通过本文公开的方法修饰的基因组。在一些实施方案中，具有通过本文公开的方法修饰的肌纤维的受试者已经被诊断患有肌营养不良症。在一些实施方案中，所述受试者患有肌营养不良症。在一些实施方案中，所述肌营养不良症选自肌强直性肌营养不良症、杜兴氏肌营养不良症(DMD)、贝克氏肌营养不良症、肢带肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症、眼咽肌营养不良症、远端肌营养不良症和埃默里-德赖富斯肌营养不良症。在一些实施方案中，所述肌营养不良症是贝克氏肌营养不良症或杜兴氏肌营养不良症。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括评估具有通过本文公开的方法修饰的基因组的肌肉祖细胞或肌纤维的命运或功能。

本公开的一些方面涉及在受试者体内修饰心脏细胞的基因组的方法，其包括使所述心脏细胞与一种或多种病毒接触，其中所述一种或多种病毒在心脏细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在心脏细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入(例如同源重组)，并且其中所述心脏细胞是DNA合成的心脏细胞或复制的心脏细胞。

所述受试者不受限制，并且可以是如本文所述的任何受试者。在一些实施方案中，所述受试者患有心脏疾病或病状。在一些实施方案中，所述心脏疾病或病状与遗传突变相关联。在一些实施方案中，可以通过纠正遗传突变来减轻或治疗心脏疾病或病状。在一些实施方案中，可以通过将遗传序列插入到心脏细胞的基因组中来减轻或治疗心脏疾病或病状。在一些实施方案中，可以通过纠正遗传突变来降低或预防心脏疾病或病状的可能性。在一些实施方案中，可以通过将遗传序列插入心脏细胞的基因组中来降低或预防心脏疾病或病状的可能性。在一些实施方案中，所述受试者是婴儿或幼年或30岁以下。在一些实施方案中，所述受试者不是婴儿或幼年或30岁以下。

在一些实施方案中，所述心脏细胞选自由哺乳动物有丝分裂后心肌细胞、能进行DNA合成而无需分裂/增殖的哺乳动物有丝分裂后心肌细胞、人类有丝分裂后心肌细胞、能进行DNA合成而无需分裂/增殖的人类有丝分裂后心肌细胞、心肌细胞前体细胞、增殖的间充质心脏细胞、增殖的内皮心脏细胞和心脏祖细胞组成的组。

靶向序列的核酸酶不受限制，并且可以是本文所述的任何靶向序列的核酸酶。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是Cas9或其功能片段或功能变体。

在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列和供体模板的第一病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括第一病毒，所述第一病毒转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列、供体模板和一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个等)gRNA。在本文所述的方法的实施方案中，其中单个病毒转导靶向序列的核酸酶、供体模板以及任选地一个或多个gRNA，本领域普通技术人员可以选择能够包装所需核苷酸序列的合适病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板的第二病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个等)gRNA的第二病毒。在一些实施方案中，第一病毒与第二病毒的比率为约1:3至约1:100，包括中间比率。例如，第一病毒与第二病毒的比率可以是约1:5至约1:50，或约1:10，或约1:20。虽然不作为优选的，但所述比率可以是1:1，或者可以有更多第二病毒。

在一些实施方案中，所述方法包括由非病毒构建体(例如“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA)介导的一种或多种组分(例如，编码靶向序列的核酸酶的核酸、供体模板、一个或多个gRNA)的递送；与各种递送组合物和纳米颗粒结合，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、聚聚糖组合物和其他聚合物、基于脂质和/或胆固醇的核酸缀合物以及其他构建体，诸如本文所述的构建体。参见例如，X.Su等,Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),第774-787页；网络出版物:2011年3月21日；WO2013/182683,WO 2010/053572和WO 2012/170930，所有参考以引用的方式并入本文。

所述一种或多种病毒可含有能够指导哺乳动物细胞中的表达(例如，靶向序列的核酸酶、供体模板、一个或多个gRNA的表达)的启动子，诸如本文所述的合适的病毒启动子。在一些实施方案中，可使用人类启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自CMV启动子、U6启动子、H1启动子、组成型启动子和遍在型启动子。在一些实施方案中，所述启动子指导特定细胞类型中的表达。例如，在一些实施方案中，所述启动子是心脏特异性启动子(例如，哺乳动物有丝分裂后心肌细胞特异性启动子、能进行DNA合成而无需分裂/增殖的哺乳动物有丝分裂后心肌细胞特异性启动子、人类有丝分裂后心肌细胞特异性启动子、能进行DNA合成而无需分裂/增殖的人类有丝分裂后心肌细胞特异性启动子、心肌细胞前体细胞特异性启动子、增殖的间充质心脏细胞特异性启动子、增殖的内皮心脏细胞特异性启动子或心脏祖细胞特异性启动子或对这些所列亚型中的一种或多种具有特异性的启动子)。在一些实施方案中，编码靶向序列的核酸酶的核酸序列使用心脏特异性启动子、遍在型启动子或非特异性启动子来转导。

所使用的一种或多种病毒不受限制，并且可以是任何合适的病毒或本文公开的病毒。在一些实施方案中，所述病毒是AAV血清型6、8、9、10或Anc80。

在一些实施方案中，病毒组合物可以剂量单位配制，以含有对于人类患者在约1.0×10

在一些实施方案中，至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的受试者的心脏细胞的基因组被修饰。在一些实施方案中，至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的心脏细胞的基因组通过同源重组来修饰(例如，通过同源重组替换或插入基因组序列)。在一些实施方案中，所述受试者中至少1％、1.6％、2％的心脏细胞被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。在一些实施方案中，所述修饰包括至少一个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括两个等位基因的修饰。

本公开的一些方面涉及包含具有通过本文公开的方法修饰的基因组的心脏细胞的心脏组织。在一些实施方案中，所述心脏组织包括通过本文公开的方法修饰的心脏细胞的后代细胞。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、51％、60％、70％、90％、95％、99％的心脏组织的肌肉细胞已被修饰，或者是已通过本文公开的方法修饰的细胞的后代。在一些实施方案中，具有通过本文公开的方法修饰的心脏组织的受试者已经被诊断患有心脏疾病或病状。在一些实施方案中，所述心脏病状是心肌损伤(例如心肌梗塞后的心肌损伤)。在一些实施方案中，所述心脏疾病是心肌梗塞、缺血性心脏病、扩张型心肌病、心力衰竭(例如充血性心力衰竭)、缺血性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、酒精性心肌病、病毒性心肌病、心动过速介导的心肌病、应激性心肌病、淀粉样心肌病、致心律失常性右心室发育不良、左心室肌致密化不全(left ventricularnoncompaction)、心内膜弹力纤维增生症(endocardial fibroelastosis)、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣返流、二尖瓣狭窄、二尖瓣返流、二尖瓣脱垂、肺动脉狭窄、肺动脉狭窄、肺动脉返流、三尖瓣狭窄、三尖瓣返流、先天性病症、遗传性病症或其组合。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于促进有需要的受试者的心肌再生。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括评估具有基因组修饰的心脏细胞的命运或功能。

本公开的一些方面涉及通过同源性定向修复在受试者体内靶向特定横纹肌类型进行基因组修饰的方法，其包括使用一种或多种病毒全身性施用，其中所述一种或多种病毒在横纹肌细胞中转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列，并在横纹肌细胞中转导供体模板，其中所述修饰包括与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入，并且其中，由于所述受试者的年龄，基因组修饰优先发生在至少一种类型的横纹肌上。

在一些实施方案中，肌肉前体细胞的基因组被优先修饰。在一些实施方案中，心脏细胞的基因组被优先修饰。

所述受试者不受限制，并且可以是如本文所述的任何受试者。在一些实施方案中，所述受试者患有肌肉或心脏疾病或病状。

靶向序列的核酸酶不受限制，并且可以是本文所述的任何靶向序列的核酸酶。在一些实施方案中，所述靶向序列的核酸酶是Cas9或其功能片段或功能变体。

在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列和供体模板的第一病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括第一病毒，所述第一病毒转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列、供体模板和一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个等)gRNA。在本文所述的方法的实施方案中，其中单个病毒转导靶向序列的核酸酶、供体模板以及任选地一个或多个gRNA，本领域普通技术人员可以选择能够包装所需核苷酸序列的合适病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板的第二病毒。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒包括转导编码靶向序列的核酸酶的核酸序列的第一病毒以及转导供体模板和一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个等)gRNA的第二病毒。在一些实施方案中，第一病毒与第二病毒的比率为约1:3至约1:100，包括中间比率。例如，第一病毒与第二病毒的比率可以是约1:5至约1:50，或约1:10，或约1:20。虽然不作为优选的，但所述比率可以是1:1，或者可以有更多第二病毒。

在一些实施方案中，所述方法包括由非病毒构建体(例如“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA)介导的一种或多种组分(例如，编码靶向序列的核酸酶的核酸、供体模板、一个或多个gRNA)的递送；与各种递送组合物和纳米颗粒结合，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、聚聚糖组合物和其他聚合物、基于脂质和/或胆固醇的核酸缀合物以及其他构建体，诸如本文所述的构建体。参见例如，X.Su等,Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),第774-787页；网络出版物:2011年3月21日；WO2013/182683,WO 2010/053572和WO 2012/170930，所有参考以引用的方式并入本文。

所述一种或多种病毒可含有能够指导哺乳动物细胞中的表达(例如，靶向序列的核酸酶、供体模板、一个或多个gRNA的表达)的启动子，诸如本文所述的合适的病毒启动子。在一些实施方案中，可使用人类启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自CMV启动子、U6启动子、H1启动子、组成型启动子和遍在型启动子。在一些实施方案中，所述启动子指导特定细胞类型中的表达。在一些实施方案中，编码靶向序列的核酸酶的核酸序列使用遍在型启动子或非特异性启动子来转导。

所使用的一种或多种病毒不受限制，并且可以是任何合适的病毒或本文公开的病毒。在一些实施方案中，所述病毒是AAV血清型6、8、9、10或Anc80。

在一些实施方案中，病毒组合物可以剂量单位配制，以含有对于人类患者在约1.0×10

在一些实施方案中，至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的受试者的横纹肌细胞类型(例如心肌、肌肉祖细胞、肌纤维)的基因组被修饰。在一些实施方案中，至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的横纹肌细胞类型(例如心肌、肌肉祖细胞、肌纤维)的基因组通过同源重组来修饰(例如，通过同源重组替换或插入基因组序列)。在一些实施方案中，所述受试者中至少1％、1.6％或2％的横纹肌细胞类型(例如心肌、肌肉祖细胞、肌纤维等)被修饰以包含与所述供体模板的核苷酸序列相对应的核苷酸序列的插入。在一些实施方案中，所述修饰包括至少一个等位基因的修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括两个等位基因的修饰。

在一些实施方案中，人类受试者为6个月大与24个月大之间。在一些实施方案中，人类受试者在2与6岁、6与12岁或12与18岁之间。在一些实施方案中，人类受试者在18与30岁、30与50岁、50与80岁之间或大于80岁。在一些实施方案中，所述受试者为至少约5、10、20、30、40、50、60、65、70、75、80、85或90岁。在一些实施方案中，所述受试者小于约5、10、20、30、40、50、60、65、70、75、80、85或90岁。在一些实施方案中，受试者是成人。出于此目的，至少18岁的人被视为成人。在一些实施方案中，所述受试者是幼年(例如，对于人类受试者，小于约18、12或6岁)。在一些实施方案中，所述受试者不是幼年(例如，对于人类受试者，小于约18、12或6岁)。在一些实施方案中，所述受试者小于1岁。在一些实施方案中，所述受试者大于1岁且小于6岁。在一些实施方案中，所述受试者大于6岁且小于12岁。在一些实施方案中，所述受试者大于12岁且小于18岁。在一些实施方案中，所述受试者大于18岁且小于24岁。在一些实施方案中，所述受试者大于18岁。在一些实施方案中，所述受试者处于青春期后。在一些实施方案中，所述受试者处于青春期前。在一些实施方案中，所述受试者正经历青春期。在一些实施方案中，受试者是胚胎。在一些实施方案中，受试者是胎儿。在某些实施方案中，向怀孕的女性施用剂，以便治疗或引起对子宫内的胚胎或胎儿的生物效应。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括评估具有基因组修饰的横纹肌细胞的命运或功能。

术语“减少(decrease)”、“降低(reduce)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”、“减少(decrease)”和“抑制(inhibit)”在本文中通常都用来意指相对于参考减少统计上显著的量。然而，为了避免疑问，“降低”或“减少”或“抑制”通常意指与参考水平相比至少10％的减少，并且可包括例如至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％。至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％的减少，高达并包括例如给定的实体或参数与参考水平相比完全不存在，或者与不存在给定治疗相比，在10％-99％之间的任何减少。

术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“激活(activate)”在本文中通常都用来意指增加统计上显著的量；为了避免任何疑问，术语“增加”或“增强”或“激活”意指与参考水平相比至少10％的增加，例如至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加，或高达并包括100％的增加或与参考水平相比在10％-100％之间的任何增加，或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或与参考水平相比在2倍与10倍或更多倍之间的任何增加。

如本文所用，术语“包含/包括(comprising/comprises)”用于指对所述方法或组合物是必要的组合物、方法及其相应组分，但对无论是否必要的未指定要素的包含是开放性的。

术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应组分，其不包括在所述实施方案的描述中未列举的任何要素。

如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。所述术语允许存在不实质上影响所述实施方案的基本特征和新颖特征或功能特征的要素。

术语“统计上显著的”或“显著地”是指统计显著性，并且通常意指大于0.05的“p”值(通过相关统计检验计算)。本领域技术人员将容易理解的是，任何特定实验的相关统计检验取决于正在分析的数据的类型。下文各节的正文中提供了另外的定义。

细胞生物学和分子生物学中常用术语的定义可在Merck Research Laboratories在2006年出版的第19版“The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”(ISBN 0-911910-19-0)；RobertS.Porter等(编)，Blackwell Science Ltd.在1994年出版的TheEncyclopedia of Molecular Biology(ISBN 0-632-02182-9)；Crowther J.R.的ELISAguidebook(Methods in molecular biology 149)(2000)；Elsevier在2006年出版的Werner Luttmann的Immunology中找到。分子生物学中常用术语的定义也可以在Jones&Bartlett Publishing在2009年出版的Benjamin Lewin的Genes X(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等(编)，VCH Publishers,Inc.在1995年出版的Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference(ISBN 1-56081-569-8)和Coligan等编的Cun-ent Protocols in Protein Sciences 2009,Wiley Intersciences中找到。

除非另外说明，否则本发明使用标准程序进行，如例如在Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,USA(2001)和Davis等,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1995)中所描述，所述参考均以引用的方式整体并入本文。

如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用以指定通过相邻残基的α-氨基与羧基之间的肽键彼此相连的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指蛋白质氨基酸的聚合物，包括修饰的氨基酸(例如磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物，不管其大小或功能如何。“蛋白质”和“多肽”常常用于指相对较大的多肽，而术语“肽”常常用于指较小的多肽，但这些术语在本领域中的使用是重叠的。当指基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。

因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述的其他等效物、变体、片段和类似物。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”是指掺入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子，优选聚合物分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可以是变性双链DNA的一条链的核酸。可替代地，它可以是不衍生自任何双链DNA的单链核酸。在一方面，模板核酸是DNA。在另一个方面，模板是RNA。合适的核酸分子是DNA，包括基因组DNA或cDNA。其他合适的核酸分子是RNA，包括mRNA。核酸分子可以是天然存在的，如在基因组DNA中，或者其可以是合成的，即基于人类活动制备的，或者可以是两者的组合。核酸分子也可以具有某些修饰，诸如如美国专利申请20070213292中所述的2'-脱氧、2'-脱氧-2'氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O--N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)、胆固醇添加和硫代磷酸酯骨架；以及如美国专利号6,268,490中所述的通过亚甲基单元连接在2'-氧与4'-碳原子之间的某些核糖核苷，其中专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文。

如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“减轻(amelioration)”当用于指疾病、病症或医学病状时，是指病状的治疗性治疗，其中目的是逆转、缓解、减轻、抑制、减缓或停止症状或病状的进展或严重性。术语“治疗(treating)”包括减少或缓解病状的至少一种不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果病状的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括在缺乏治疗的情况下预期中止或至少减缓症状的进展或恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于与在缺乏治疗的情况下所预期的相比一种或多种症状的缓解、缺陷程度减弱、稳定的(即不恶化)状态。

用于病症或疾病的给定治疗的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，如本文所使用的术语，如果以有益的方式改变病症的任何一种或全部的体征或症状，其他临床可接受的症状得到改善或减轻，例如使用本文所述的剂或组合物治疗后至少改善或减轻10％，则治疗被认为是“有效治疗”。功效还可以通过个体没有恶化而进行测量，如通过住院或需要医疗干预(例如，疾病进展停止)所评估的。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或本文所述的。

***

本公开的实施方案的描述并非旨在详尽或将本公开限制为所公开的精确形式。虽然本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但替代实施方案可以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导内容可以适当地应用于其他过程或方法。本文所述的各种实施方案可以组合以提供另外的实施方案。如有需要，可以修改本公开的各方面以使用上文参考文献和申请的组成、功能和概念来提供本公开的其他实施方案。可以根据具体实施方式对本公开作出这些和其他改变。

任何前述实施方案的具体要素可以被组合或取代其他实施方案中的要素。此外，虽然已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但其他实施方案也可以表现出此类优点，并且并非所有实施方案都必须表现出此类优点以落入本公开的范围内。

出于描述和公开的目的，所有确定的专利和其他出版物均明确地以引用的方式并入本文，例如，可与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法。提供这些出版物仅是出于其公开内容先于本申请的提交日期。在这方面的任何内容都不应被解释为承认发明者由于先前的发明或先前的出版物或任何其他原因而无权早于此类公开。所有关于这些文件的日期的说明或内容的陈述均是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

本领域的技术人员很容易理解的是，本发明很好地适合于进行所述目的，并获得所提及的结果和优点以及本发明固有的那些结果和优点。本文的描述和实施例的细节代表某些实施方案，是示例性的，并且不旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到其中的修改和其他用途。这些修改涵盖在本发明的精神内。本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的范围和精神的情况下对本文公开的发明作出各种取代和修改。

除非明确相反地指出，否则在说明书和权利要求书中如本文所用的冠词“一个/一种(a/an)”应理解为包括复数个指示物。如果一个、一个以上或所有的组成员存在于、用于给定的产物或过程或以其他方式与之相关，则在组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或描述被认为是满意的，除非相反地指出或以其他方式从上下文中明显看出。本发明包括其中组的恰好一个成员存在于、用于给定的产物或过程或以其他方式与之相关的实施方案。本发明还包括其中一个以上或所有的组成员存在于、用于给定的产物或过程或以其他方式与之相关的实施方案。此外，应理解的是，本发明提供了所有变化、组合和排列，其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等引入到取决于同一基本权利要求(或相关的任何其他权利要求)的另一权利要求中，除非另外指出或除非出现矛盾或不一致对于本领域的普通技术人员而言显而易见。预期的是，在适当的情况下，本文所述的所有实施方案可应用于本发明的所有不同方面。还预期的是，只要适当，任何实施方案或方面都可以与一个或多个其他此类实施方案或方面自由地组合。在要素以列表例如以马库什(Markush)组或类似形式呈现的情况下，应理解的是，还公开了要素的每个子组，并且可以从所述组中去除任何要素。应理解的是，一般而言，在本发明或本发明的各方面被称为包括特定要素、特征等的情况下，本发明的某些实施方案或本发明的各方面由此类要素、特征等组成或基本上由此类要素、特征等组成。出于简单的目的，本文未在每一种情况下都以如此多的文字来具体阐述那些实施方案。还应理解的是，本发明的任何实施方案或方面都可从权利要求书中明确地排除，而不管说明书中是否列举了具体的排除。例如，可以排除任何一种或多种活性剂、添加剂、成分、任选剂、生物体类型、病症、受试者或其组合。

在权利要求书或说明书涉及物质组合物的情况下，应理解的是，根据本文公开的任何方法制备或使用物质组合物的方法，以及出于本文公开的任何目的使用物质组合物的方法都是本发明的方面，除非另外指出或除非出现矛盾或不一致对本领域的普通技术人员而言显而易见。在权利要求书或说明书涉及方法的情况下，例如，应理解的是，制备用于执行方法的组合物的方法以及根据所述方法产生的产物都是本发明的方面，除非另外指出或除非出现矛盾或不一致对本领域的普通技术人员而言显而易见。

在本文给定范围的情况下，本发明包括其中包括端点的实施方案、其中排除两个端点的实施方案以及其中包括一个端点而排除另一个端点的实施方案。除非另外指出，否则应假定包括两个端点。此外，应理解的是，除非另外指出或以其他方式从上下文和本领域普通技术人员的理解中明显看出，否则以范围表示的值可以假定本发明不同实施方案中的所述范围内的任何特定值或子范围，直到范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。还应理解的是，在本文中陈述一系列数值的情况下，本发明包括与由所述系列中的任何两个值限定的任何中间值或范围类似地相关的实施方案，并且最小值可以取最小量，并且最大值可以取最大量。如本文所用，数值包括以百分比表示的值。对于其中数值以“约(about)”或“大约(approximately)”开头的本发明的任何实施方案，本发明包括其中列举了准确值的实施方案。对于其中数值不以“约”或“大约”开头的本发明的任何实施方案，本发明包括其中值以“约”或“大约”开头的实施方案。

“大约”或“约”通常包括落入1％的范围内或在一些实施方案中落入一个数字的5％的范围内或在一些实施方案中在任一方向上(大于或小于所述数字)落入数字的10％的范围内的数字，除非另有说明或以其他方式从上下文中明显看出(除了在此类数字不允许超过可能值的100％的情况下)。应理解的是，除非明确相反地指出，否则在包括一个以上动作的本文要求保护的任何方法中，所述方法的动作的顺序不必限于其中列举所述方法的动作的顺序，但本发明包括其中顺序被限制的实施方案。还应理解的是，除非另外指出或从上下文中明显看出，否则本文所述的任何产物或组合物都可以视为“分离的”。

实施例：

为了灵敏地检测通过CRISPR/Cas9的体内基因编辑事件，开发了使用遍在表达强烈增强型绿色荧光蛋白(GFP)信号

这种颜色转换系统用于测试CRISPR/Cas9在再生干细胞群体中发起HDR的能力。将来自GFP

评估了我们的报告系统用于跟踪体内CRISPR介导的基因编辑事件的效用。使用上述载体产生AAV，并与血清型8一起包装，所述血清型8具有高的肝脏、心脏和骨骼肌嗜性

骨骼肌是主要的有丝分裂后组织，主要由卫星细胞衍生的成肌前体的融合形成的多核肌肉纤维组成。我们和其他人已在肌肉中使用AAV-CRISPR介导的NHEJ来纠正Dmd阅读框，并通过删除或跳过Dmd外显子23来恢复营养不良的mdx小鼠中的抗肌萎缩蛋白的表达和功能

鉴于与先前报道的使用肌肉纤维限制性启动子的AAV-CRISPR介导的HDR的低效率相比

与骨骼肌类似，心肌与可从体内治疗性基因编辑中受益的广泛的遗传疾病有关；然而，出生后心脏表现出有限的增殖活性和明显很差的再生能力

我们假设P21后在小鼠中缺乏增殖性心肌细胞，并且内源心脏祖细胞在体内平衡中的贡献可忽略不计，这可能是观察到的心肌(与骨骼肌相反)中的HDR率低的原因

我们还评估了在P3新生儿中全身性施用AAV-CRISPR后在心肌和骨骼肌中的HDR率。BFP+细胞占心肌细胞的平均3.5％(范围，1.6％-4.6％)，这一频率显著高于P21注射的小鼠心脏中的BFP+细胞的频率(图4D-图4E和图2D-图2E)。在两个实验之间，检测到GFP-/BFP-心肌细胞的类似率(>60％)(图2E和图4E)，这表明观察到的HDR中的年龄依赖性差异不太可能反映AAV转导效率的差异。相反，我们在mdx或C57BL/6J背景中的骨骼肌切片中均未观察到BFP信号的大量增加(图4F)，这与这些肌肉中不常见的BFP+骨骼肌卫星细胞一致(0.05-0.17％BFP+，图11)。如上所述，由于肌纤维多核化的混杂影响，无法评估GFP信号的损失。总之，这些数据揭示了对横纹肌中的体内CRISPR-HDR基因编辑的离散的、发育定时的限制，从而提供了通过调整AAV-CRISPR施用的定时来靶向(或脱靶)目标特定组织的可能性。对于其他细胞类型，是否存在类似的CRISPR-HDR可访问的发育控制窗口，将成为未来研究的一个诱人途径。

上文所讨论的结果进一步由图13中示出的数据验证，其示出在双重AAV治疗的动物(P3和P21)的肝脏、心脏和肌肉(TA)中的GFP损失，以及在P21肌肉组织和P3心脏组织中的BFP信号(指示HDR)的优先增加。

发明人使用能够在单细胞水平上跟踪体内基因组编辑结果的GFP-BFP颜色转换报告系统惊人地且意外地发现，小鼠出生后的心肌、骨骼肌和肌肉干细胞在不同发育时间点经受模板化HDR。通过腺相关病毒(AAV-CRISPR)来全身性递送CRISPR-Cas9编辑组分确认了在肝脏中高效的NHEJ和HDR，这与先前的报道(Yang,Y.等Nat Biotechnol 34,334-338(2016)；Yin,H.等Nat Biotechnol 34,328-333(2016))一致。此外，在出生后第21天(P21)注射AAV-CRISPR的小鼠中检测到HDR编辑的肌肉干细胞和肌纤维，但在P3中未检测到，而在P3注射的动物中检测到HDR编辑的心脏细胞，但在P21注射的动物中很少检测到。我们的结果揭示了在离散的出生后时间点在横纹肌和肌肉干细胞中进行序列定向的、全身性传播的、体内AAV-CRISPR介导的HDR的可能性，从而为治疗剂开发提供了新的机会。

总之，我们的研究报告了一个简单而强大的工具来使用单细胞分辨率跟踪体内NHEJ和HDR基因编辑结果。此外，通过AAV全身性递送gRNA程序化的Cas9，我们揭示了通过HDR在骨骼肌和心肌中进行精确、靶向的基因替换的意外的机会，这两种主要的有丝分裂后组织一直被广泛认为无法通过这种方法获得。据我们所知，我们的数据通过CRISPR/Cas9的全身性AAV递送，首次证明了在出生后的心脏中显著进行体内HDR编辑，并且代表比先前报道的通过局部、肌肉内递送在骨骼肌中可实现的HDR编辑率的实质性改善

通过将CAG-GFP小鼠

AAV由在斯格本斯眼科学研究所(Schepens Eye Research Institute)和马萨诸塞州眼耳医院(Massachusetts Eye and Ear Infirmary，SERI/MEEI)的格罗斯贝克基因治疗中心(Grousbeck Gene Therapy Center)的基因转移载体核心(Gene Transfer VectorCore，GTVC)生产并滴定，如先前所述与血清型8一起包装

先前描述了AAV-SaCas9质粒

如先前所述

将从雄性mdx；GFP

为了测试mdx；GFP

为了筛选靶向GFP的gRNA，按照制造商的说明使用Lipofectamine 3000用仅SaCas9(对照)或用SaCas9加靶向GFP的三个gRNA中的一个来转染mdx；GFP

成肌细胞移植前一天，将25μL莫桑比克射毒眼镜蛇莫桑比克心脏毒素(Najamossambica mossambica cardiotoxin)(0.03mg/mL，Sigma)注射到麻醉的雄性mdx受体小鼠的胫骨前(TA)肌肉中。将800,000个GFP

按照制造方案，使用QuickExtract DNA提取液(Epicentre/Lucigen)从组织、卫星细胞和扩增的成肌细胞中提取基因组DNA。通过Q5热启动聚合酶(NEB)，每25μL PCR反应使用1-2μL QuickExtracted溶液。正向引物GTGCTGTCTCATCATTTTGGC(SEQ ID NO:21)(与GFP/BFP起始位点的上游结合)和反向引物TCGTGCTGCTTCATGTGGTC(SEQ ID NO:22)(与Cas9切割位点和颜色转换取代的下游结合)用于扩增基因组转基因基因座，而不是模板序列。对于RFLP分析，将PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并使用BtgI(NEB)消化，或使用水模拟消化，之后在E-Gel EX 2％琼脂糖凝胶(Invitrogen)上进行凝胶电泳。

使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)将纯化的基因组PCR产物克隆到TOPO骨架中，并转化到TOP10感受态细胞(Invitrogen)中。通过细菌菌落Sanger测序来分析离散克隆，所述测序由Genewiz在马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA)进行。使用Geneious程序将测序迹线与GFP转基因进行比对。对于下一代测序，将8个碱基对(bp)条形码附加到基因组PCR引物中。汇集4-10个独特条形码的PCR产物，并进行PCR纯化，之后在MGH DNA核心通过CRISPR测序(可在万维网上获得，位于//dnacore.mgh.harvard.edu/)进行分析。解复用后，使用CRISPResso程序分析NGS结果。示出了代表性NGS序列。

在室温下，将组织解剖并立即在4％PFA中固定90分钟，然后使用PBS洗涤，并转移至30％蔗糖中，用于在4℃下孵育过夜。然后将浸没的组织包埋在O.C.T.化合物(Tissue-Tek)中，并在液氮浴中的异戊烷中冷冻。根据制造商的说明，使用Microm HM550(ThermoScientific)将组织切片，并使用Alexa Fluor 555-小麦胚芽凝集素和TO-PRO-3碘化物(Life Technologies)染色。BFP

使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。对图1F-图1G进行非配对双尾t检验。对图3B-图3C和图11B-图11C进行使用Tukey多重比较检验的单向ANOVA。准确的p值和自由度(DF)可以在对应的图例中找到。

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