多层细胞膜片的制备方法及利用其制备的多层细胞膜片

摘要

本说明书涉及一种多层细胞膜片的制备方法，包括：(a)在0℃至30℃中任一点位的温度具有熔点或从疏水性变换为亲水性的第一基材上形成第一细胞层的步骤；(b)在由酶所分解的第二基材上形成第二细胞层的步骤；(c)使所述第一细胞层与所述第二细胞层接触的步骤；(d)提供所述第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度而选择性地去除所述第一基材的步骤；及(e)使所述第二基材接触于包含酶的溶液而选择性地去除所述第二基材的步骤。本说明书还涉及利用所述制备方法制备的多层细胞膜片。

说明书

技术领域

本说明书主张2018年7月31日向韩国特许厅提交的韩国专利申请第10-2018-0089461号的申请日的权益，其内容全部包括于本发明。

本发明涉及组织工程学及再生医学领域，更具体地，涉及一种多层细胞膜片的制备方法及利用其制备的多层细胞膜片。

背景技术

在再生医学领域，组织工程学治疗正在向以生物降解性高分子支架为基础培养细胞来重建组织后，移植到损伤的部位而使得诱导正常功能的方向发展。只是，将生物降解性高分子支架移植到体内时，存在因生成酸性物质而发生炎症反应的问题(Ronneberger Bet al.,J Biomed Mater Res,30(1)(1996),31-40)。

作为与此不同方向的接近方法，提出了将细胞与生物降解性高分子溶液掺和而注入损伤部位的方法，但这存在由于细胞外基质(ECM：Extra Cellular Matrix)的损伤而存在移植部位的细胞再生效率大幅下降的问题(Canavan H et al.,J Biomed Mater ResA.2005 Oct 1；75(1):1-13)。

为了解决如上所述的问题，作为无需生物降解性高分子而用于移植细胞的手段，开发了细胞膜片(Yang J et al.Biomaterials.2005 Nov；26(33):6415-22)。只是，即使制作了细胞膜片，为了将其进行临床应用，需要将细胞膜片层叠为多层的过程，但是现在已知的方法由于过于复杂的过程及长期的制备时间，从而存在不够经济的问题。

发明内容

技术问题

本发明旨在提供一种通过简单工序制备多层结构的细胞膜片的方法及利用其制备的多层细胞膜片。

解决问题的方案

本发明的一种实施状态提供一种多层细胞膜片的制备方法，包括：(a)在0℃至30℃中任一点位的温度具有熔点或从疏水性变换为亲水性的第一基材上形成第一细胞层的步骤；(b)在由酶所分解的第二基材上形成第二细胞层的步骤；(c)使所述第一细胞层与所述第二细胞层接触的步骤；(d)提供所述第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度而选择性地去除所述第一基材的步骤；及(e)使所述第二基材接触于包含酶的溶液而选择性地去除所述第二基材的步骤。

本发明的另一实施状态提供一种利用所述制备方法制备的多层细胞膜片。

发明的效果

本发明的多层细胞膜片具有可以通过简单、经济的方法制备多层细胞膜片的优点。

附图说明

图1图示根据本发明一种实施状态的多层细胞膜片的制备方法。

图2显示根据实施例制备的普流尼克(Pluronic)水凝胶膜片的放大图像。

图3显示去除实施例中的普流尼克水凝胶膜片的面的细胞膜片的放大图像。

图4显示通过染色确认去除实施例中的普流尼克水凝胶膜片的面的细胞膜片的细胞生存与否的结果。

图5显示去除实施例中的海藻酸盐水凝胶膜片的面的细胞膜片的放大图像。

图6显示通过染色确认去除实施例中的海藻酸盐水凝胶膜片的面的细胞膜片中细胞生存与否的结果。

图7显示了拍摄根据实施例的普流尼克水凝胶膜片及海藻酸盐水凝胶膜片全部被去除的细胞膜片的情形。

具体实施方式

在本说明书中，当说某个部件位于其它部件“上”时，这意指不仅是某个部件与其它部件相接的情形，还包括在两个部件之间还存在其它部件的情形。

在本说明书中，当说某个部分“包括”某个构成要素时，这意指只要没有特别相反的记载，并不是除外其它构成要素，而且还可以包括其它构成要素。

在本说明书中，“追加的第一基材”可以全部包括关于第一基材的内容，也可以与第一基材相同。

在本说明书中，“追加的第二基材”可以全部包括关于第二基材的内容，也可以与第二基材相同。

在本说明书中，“追加的第一细胞层”可以全部包括关于第一细胞层的内容，也可以与第一细胞层相同。

在本说明书中，“追加的第二细胞层”可以全部包括关于第二细胞层的内容，也可以与第二细胞层相同。

下面对本发明进行详细说明。

本发明的一种实施状态包括：(a)在0℃至30℃中任一点位的温度具有熔点或从疏水性变换为亲水性的第一基材上形成第一细胞层的步骤；

(b)在由酶所分解的第二基材上形成第二细胞层的步骤；

(c)使所述第一细胞层与所述第二细胞层接触的步骤；

(d)提供所述第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度而选择性地去除所述第一基材的步骤；及

(e)使所述第二基材接触于包含酶的溶液而选择性地去除所述第二基材的步骤。

本发明的多层细胞膜片的制备方法具有可以以简单的方法制备由多层细胞层层叠的细胞膜片的优点。所述多层细胞膜片的制备方法可以使用在0℃至30℃中任一点位的温度具有熔点或从疏水性变换成亲水性的第一基材；及由酶所分解的第二基材而层叠细胞层后，选择性地去除任一基材。由此，可以在由选择性地去除的基材而露出的细胞层上层叠追加的细胞层。另外，具备在未去除的基材上层叠的细胞层，因而可以轻松转录，转录后可以选择性地去除剩余基材，从而进行多层细胞层的移植。

根据本发明的一种实施状态，(d)步骤及(e)步骤可以依次执行，在(d)步骤与(e)步骤之间可以还包括：(d')使露出的所述第一细胞层与在追加的第一基材上配备的追加的第一细胞层接触后，提供所述第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度而选择性地去除所述追加的第一基材的步骤。具体地，由(c)步骤形成的“第一基材/第一细胞层/第二细胞层/第二基材”的层叠结构体，由(d)步骤及(d')步骤而可以形成“追加的第一细胞层/第一细胞层/第二细胞层/第二基材”的层叠结构体。

另外，根据本发明的一种实施状态，(d')步骤可以反复执行2次以上而在所述第一细胞层上形成多个追加的第一细胞层。具体地，(d')步骤可以经多次反复执行，由此，可以形成“追加的第一细胞层/.../追加的第一细胞层/第一细胞层/第二细胞层/第二基材”的层叠结构体。根据所述多层细胞膜片的用途及目的而可以适宜地调节所述追加的第一细胞层的数量。

根据本发明的一种实施状态，(e)步骤及(d)步骤可以依次执行，在(e)步骤与(d)步骤之间，可以还包括：(e')使露出的所述第二细胞层与在追加的第二基材上配备的追加的第二细胞层接触后，使所述追加的第二基材接触于包含酶的溶液而选择性地去除所述追加的第二基材的步骤。具体地，由(c)步骤而形成的“第一基材/第一细胞层/第二细胞层/第二基材”的层叠结构体，由(e)步骤及(d')步骤而可以形成“第一基材/第一细胞层/第二细胞层/追加的第二细胞层”的层叠结构体。

另外，根据本发明的一种实施状态，(e')步骤可以反复执行2次以上而在所述第二细胞层上形成多个追加的第二细胞层。具体地，(e')步骤可以经多次反复执行，由此，可以形成“第一基材/第一细胞层/第二细胞层/追加的第二细胞层/.../追加的第二细胞层”的层叠结合体。所述追加的第二细胞层的数量可以根据所述多层细胞膜片的用途及目的而适宜地调节。

根据本发明的一种实施状态，所述第一基材可以在超过30℃的温度氛围下具有固态或疏水性。具体地，所述第一基材可以在30℃以下温度转换成液态或亲水性，由此，可以从第一细胞层进行选择性地去除。

根据本发明的一种实施状态，(a)步骤及(c)步骤可以在35℃至40℃的氛围下执行，具体地，可以在36℃至38℃的氛围下执行，更具体地，可以在36℃至37℃的氛围下执行。这是为了由于所述第一基材在0℃至30℃中任一点位的温度具有熔点或具有从疏水性变换成亲水性的性质，因而在所述温度范围(即，35℃至40℃)的氛围下，使得第一基材维持固态形态或疏水性，并使得细胞活跃地活动，从而促进细胞层的形成。同样地，(d')步骤的追加的第一基材也具有与第一基材相同的性质，因而形成追加的第一细胞层及层叠追加的第一细胞层的过程，可以在35℃至40℃的氛围下执行。进而，(b)步骤为了促进细胞层的形成，也可以在35℃至40℃的氛围下执行，具体地，可以在36℃至38℃的氛围下执行，更具体地，可以在36℃至37℃的氛围下执行。

根据本发明的一种实施状态，(c)步骤可以是进行加压而使所述第一细胞层与所述第二细胞层接触。此时，加压条件可以以所接触的细胞层不被损坏且能够进行物质交换的贴紧的方式适宜地调节。同样地，可以对(d')步骤及(e')步骤的追加的第一细胞层及追加的第二细胞层进行加压而层叠于细胞层上。

根据本发明的一种实施状态，所述第一基材、所述第二基材、追加的第一基材及追加的第二基材可以分别为包含水凝胶作为主成分的水凝胶基材。

所述“水凝胶”作为包含大量的水的物质，可以意指能够使诸如氧、水、水溶性营养物、酶及细胞因子等多肽等的细胞生存所需的物质、代谢物等轻松转运的材料或形态。所述水凝胶可以是将含有胶质颗粒的水溶液进行固态化而形成的水凝胶颗粒。所述水凝胶可以例如聚丙烯酰胺(poly(acrylamide))、聚丙烯酸(poly(aerylie acid))、聚甲基丙烯酸羟乙酯(poly(hydroxyethyl methacrylate))、聚乙烯醇(poly(vinyl alcohol))、聚乳酸(poly(lactic acid))、聚乙醇酸(poly(glycolic acid))等水溶性、亲水性或吸水性合成高分子，以及由将多糖类、蛋白质及核酸等进行化学交联的水凝胶构成的颗粒。所述多糖类可以例如透明质酸(hyaluronic acid)及硫酸软骨素(chondroitin sulfate)等糖胺聚糖(glycosaminoglycan)、淀粉、糖原、琼脂、果胶、纤维素等，但不限于此。另外，蛋白质可以例如胶原及作为其水解物的明胶、蛋白聚糖(proteoglycan)、纤连蛋白(fibronectin)、玻连蛋白(vitronectin)、层粘连蛋白(laminin)、巢蛋白(entactin)、腱生蛋白(tenascin)、血小板反应蛋白(thrombospondin)、血管假性血友病因子(von Willebrand factor)、骨桥蛋白(osteopontin)、纤维蛋白原(fibrinogen)等，但不限于此。

根据本发明的一种实施状态，所述第一基材可以包含聚磷腈(polyphosphazene)类水凝胶、普流尼克(Pluronic)类水凝胶及聚N-异丙基丙烯酰胺中至少一种。

具体地，所述第一基材及所述追加的第一基材可以分别为聚磷腈类水凝胶基材、普流尼克类水凝胶基材或聚N-异丙基丙烯酰胺基材。另外，所述追加的第一基材可以与所述第一基材的内容相同。

根据本发明的一种实施状态，所述聚磷腈类水凝胶可以包含温度敏感性的聚磷腈类化合物，熔点可以调节为约4℃至约10℃。例如，本发明的聚磷腈类水凝胶可以包括韩国公开公报第10-2017-0061530号公开的温度敏感性及交联性磷腈类水凝胶、韩国公开公报第10-2014-0016521号公开的具有能调节分解速度的离子基的磷腈类高分子、韩国公开公报第10-2007-0076386号公开的生物降解性温度敏感性聚磷腈类水凝胶。

根据本发明的一种实施状态，所述普流尼克类水凝胶可以利用普流尼克高分子，将熔点的温度调节为约0℃至30℃。所述普流尼克高分子，只要是具有聚氧化乙烯(PEO)-聚环氧丙烯(PPO)-聚氧化乙烯(PEO)结构(PEO-PPO-PEO)的高分子，则均可使用。例如，可以包括以F开始的F38、F68、F77、F77、F98、F108、F127衍生物等，以L开始的L31、L42、L43、L44、L62、L72、L101衍生物等，且以P开始的P75、P103、P104衍生物等(均为商品名)。更具体地，在所述普流尼克高分子中，可以使用获得美国食品和药物管理局(FDA)许可的分子量约8700道尔顿的F68和分子量约12600道尔顿的F127。

只是，所述第一基材并非限于聚磷腈类水凝胶、普流尼克类水凝胶，只要是在30℃以下温度下具有熔点的水凝胶，均可用作所述第一基材及/或追加的第一基材。

另外，根据本发明的一种实施状态，所述第一基材可以为聚N-异丙基丙烯酰胺基材。另外，所述第一基材及/或所述追加的第一基材可以是用聚N-异丙基丙烯酰胺进行表面处理的基材。具体地，所述第一基材及/或所述追加的第一基材可以是在表面工艺(crafting)结合有聚N-异丙基丙烯酰胺或表面涂覆有聚N-异丙基丙烯酰胺。所述聚N-异丙基丙烯酰胺在30℃以下的氛围下，具体地，在约20℃至约30℃氛围下从疏水性转换成亲水性，因而在所述第一基材为聚N-异丙基丙烯酰胺基材或由此进行表面处理的基材时，可以利用约20℃至约30℃的生理盐水轻松地选择性地去除第一基材。另外，通过所述聚N-异丙基丙烯酰胺，可以在所述第一基材及/或所述追加的第一基材上更良好地形成细胞层，且去除所述第一基材及/或所述追加的第一基材时，所述聚N-异丙基丙烯酰胺也会一同轻松地从细胞层分离。只是，本发明并非限定于此，只要是具有在30℃以下温度下从疏水性变换成亲水性的特性的物质，则可以与所述聚N-异丙基丙烯酰胺一样应用。

根据本发明的一种实施状态，(d)步骤可以是使所述第一基材接触于具有所述第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度的溶液，或者将周边温度降低到所述第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度。具体地，(d)步骤的选择性地去除第一基材的过程可以是，将由(c)步骤形成的“第一基材/第一细胞层/第二细胞层/第二基材”的层叠结构体浸渍于具有第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度的溶液而选择性地去除第一基材的过程。另外，(d)步骤的选择性地去除第一基材的过程，可以是将由(c)步骤而形成的“第一基材/第一细胞层/第二细胞层/第二基材”的层叠结构体的周边温度(大气温度)降低到第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度而选择性地去除第一基材的过程。此时，具有所述第一基材的熔点以下温度的溶液可以是具有约4℃至约30℃温度的生理盐水。另外，所述周边温度(大气温度)可以为约4℃至约30℃。同样地，(d')步骤的选择性地去除追加的第一基材的过程可以是，将层叠结合体浸渍于具有约4℃至约30℃温度的生理盐水而选择性地去除追加的第一基材或者将周边温度(大气温度)降低到第一基材的熔点以下温度或所述第一基材变换成亲水性的温度的过程。当在具有所述第一基材或追加的第一基材的熔点以下温度的溶液，或在周边温度不足20℃时，层叠结构物的细胞层存在损伤可能性时，可以利用聚N-异丙基丙烯酰胺基材或聚N-异丙基丙烯酰胺进行表面处理的基材，在20℃至30℃下选择性地去除所述第一基材。

根据本发明的一种实施状态，所述第二基材可以为包含酶敏感性肽(enzyme-susceptible peptide)的水凝胶基材。例如，所述第二基材可以为包含酶敏感性肽与聚乙二醇(PEG)凝胶的水凝胶基材。另外，所述第二基材可以是可以被MMPs(matrix metalloproteinases：基质金属蛋白酶)、弹性蛋白酶及/或纤溶酶而分解的，附着有氨基酸序列的水凝胶基材。具体地，所述第二基材可以为附着有氨基酸序列的PEG-琥珀酰亚胺丙酸酯水凝胶(PEG-succinimidyl propionate hydrogel)基材，例如可以为可以由合成四肽Ala-Pro-Gly-Leu(4armPEG10k-LGPA)进行功能化的，附着有PEG-胺的PEG-琥珀酰亚胺丙酸酯水凝胶基材。或者，所述第二基材可以为附着有胺反应性PEG-单丙烯酸酯和胶原酶敏感性肽(collagenase sensitive peptide)(Gly-Gly-Leu'Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Lys)，或整联蛋白结合区域肽(integrin-binding domain peptide)(Tyr-Ile-Shy-Ser-Arg)的PEG-水凝胶基材。

根据本发明的一种实施状态，所述第二基材可以为包括羧甲基纤维素(CMC)或海藻酸盐(A1)的水凝胶基材。

具体地，根据本发明的一种实施状态，所述羧甲基纤维素或海藻酸盐可以是用酪胺接合的。即，所述第二基材及/或所述追加的第二基材可以是包括用酪胺接合的羧甲基纤维素(CMC-ty)的水凝胶基材。另外，所述第二基材及/或所述追加的第二基材可以是包括用酪胺接合的海藻酸盐(Al-ty)的水凝胶基材。

所述第二基材及/或所述追加的第二基材可以是包含至少0.5％的CMC-ty或Al-ty的水凝胶基材。具体地，所述第二基材及/或所述追加的第二基材可以是包含0.5％至4％的CMC-ty或Al-ty的水凝胶基材。所述％可以为wt％或vol％。

根据本发明的一种实施状态，所述酶可以为羧甲基纤维素分解酶或海藻酸盐分解酶。具体地，当所述第二基材及/或所述追加的第二基材为羧甲基纤维素基材时，所述酶可以为羧甲基纤维素分解酶。另外，所述第二基材及/或所述追加的第二基材为海藻酸盐基材时，所述酶可以为海藻酸盐分解酶。

所述酶在(e)步骤及/或(e')步骤中，可以选择性地分解去除所述第二基材及/或所述追加的第二基材。另外，所述酶可以不会分解除所述第二基材及所述追加的第二基材之外的其余构成(例如第一基材、第一细胞层及第二细胞层等)。具体地，所述酶可以不会分解所述第一细胞层及所述第二细胞层的细胞及细胞外基质。

根据本发明的一种实施状态，所述第一基材及所述第二基材可以分别具有适合体现第一细胞层及第二细胞层的特性的规定的图案(pattern)。具体地，根据构成所述各个细胞层的细胞种类，所要求的基材图案会不同，在具备适合于细胞的图案的基材上，可以良好地体现细胞的培养及特性。例如，当利用肌细胞形成细胞层时，在具有与肌肉组织类似图案的基材上可以更迅速形成肌细胞层，肌细胞的特性也可以更容易地表达。

因此，所述第一基材及所述第二基材可以包括规定图案，以便更好的体现培养的细胞层的特性。所述第一基材及所述第二基材具有规定图案时，可以在一面上包括凸凹图案，或者可以在整个基材上，具有根据规定图案的多样厚度。所述第一基材及/或所述第二基材的图案化方法可以利用本行业熟知的方法。例如，可以利用软刻蚀、自组装、气相沉积、光刻等进行图案化。

根据本发明的一种实施状态，所述第一基材及所述第二基材可以分别具有适合体现第一细胞层及第二细胞层特性的规定强度。具体地，根据构成所述各个细胞层的细胞种类，所要求的基材强度(模数)会不同，且在具有适合于细胞的强度的基材上，可以良好地体现细胞的培养及特性。

根据本发明的一种实施状态，所述第一细胞层及所述第二细胞层可以分别在所述第一基材及所述第二基材上培养形成。同样地，所述追加的第一细胞层可以在追加的第一基材上培养形成，所述追加的第二细胞层可以在追加的第二基材上培养形成。

根据本发明的一种实施状态，所述第一细胞层及所述第二细胞层分别可以包括选自由间充质干细胞(MSCs；mesenchymal stem cells)、肌细胞前体细胞(myocyteprecursor cells)、肌细胞(myocytes)、成纤维细胞(fibroblasts)、软骨细胞(chondrocytes)、内皮细胞(endothelial cells)、上皮细胞(epithelial cells)、胚胎干细胞(ESCs；embryonic stem cells)、造血干细胞(hematopoietic stem cells)、依赖性贴壁细胞前体(anchorage-dependent cell precursors)、诱导多能性干细胞(iPSCs；induced pluripotent stem cells)及心肌细胞(cardiomyocytes)构成的组的细胞。具体地，所述第一细胞层、所述第二细胞层、所述追加的第一细胞层及所述追加的第二细胞层可以是由培养所述细胞中至少一种形成的。另外，所述第一细胞层及所述第二细胞层可以是由彼此相同的细胞培养的，或者可以是由彼此不同的细胞培养的。

本发明的另一实施状态提供一种利用所述制备方法制备的多层细胞膜片。所述多层细胞膜片可以体现与移植对象部位类似的三维结构。具体地，所述多层细胞膜片可以层叠使用具有规定图案的基材形成的细胞层而制备，因而可以具有与目标组织类似形态的三维结构。由此，所述多层细胞膜片移植后，具有细胞生存率高，进而对组织再生有效的优点。

另外，所述多层细胞膜片可以体现与人体组织类似的结构及特性，因而可以用于药物检查。具体地，为了检查对新药的组织反应，可以利用所述多层细胞膜片。

图1图示了根据本发明一种实施状态的多层细胞膜片的制备方法。具体地，图1图示了将形成有第一细胞层的第一基材(A)与形成有第二细胞层的第二基材(B)的各细胞层彼此相接后(C)，降低温度，去除第一基材，制备了具有2层细胞层的细胞膜片。作为图1的后续步骤，既可以还层叠追加的细胞层，并且可以去除第二基材而获得由2层细胞层构成的细胞膜片。只是，本发明不限于图1，可以还包括追加的构成及/或步骤。

下面为了具体说明本说明书而举出实施例进行详细说明。但是，本说明书的实施例可以变形为多种形态，不得解释为本说明书的范围限定于以下记述的实施例。本说明书的实施例是为了向本行业的技术人员更完整地说明本说明书而提供的。

【实施例】

为了制备水凝胶膜片，准备明胶模具，模具底面形成微图案。在约25℃氛围下，在所述明胶模具内放入约10wt％的普流尼克f-127(西格玛(Simga)公司)水溶液。接着，为了使所制备的水凝胶膜片上面平坦，覆盖硝化纤维膜，且层叠用于将其进行固定的塑料网及玻璃板。然后，将温度上升到约37℃，仅固化模具内普流尼克f-127(西格玛(Simga)公司)水溶液而进行水凝胶化。然后，以利用约37℃的清洗缓冲液(Saline,PBS,ddH

图2显示了根据实施例制备的普流尼克水凝胶膜片的放大图像。所述普流尼克水凝胶膜片由于透明，因而如图2所示，可以通过利用电子显微镜的明场像(bright fieldimage)确认形成的图案。如图2所示，可以确认所制备的普流尼克水凝胶膜片按规定间隔形成有条带图案。

为了制备水凝胶膜片，准备明胶模具，模具底面形成微图案。在约25℃氛围下，将在pH 6-7的MES缓冲液中以约2wt％含量包含海藻酸盐的海藻酸盐溶液放入所述明胶模具内。而且，为了使所制备的水凝胶膜片的上面平坦，覆盖硝化纤维膜，且层叠用于将其进行固定的塑料网及玻璃板。然后，滴加海藻酸盐交联水溶液，将模具内的海藻酸盐溶液进行水凝胶化。然后，以利用约37℃的清洗缓冲液(Saline,PBS,ddH

在约37℃氛围下，在形成有所制备的所述普流尼克水凝胶膜片的图案的面上，培养C2C12骨骼肌细胞而形成细胞层，且在海藻酸盐水凝胶膜片的一面上培养C2C12骨骼肌细胞而形成细胞层。然后，使细胞层相接后，将温度降低为约10℃，以溶解的方式去除普流尼克水凝胶膜片，制备了2-叠的细胞膜片。然后，为了细胞层的活性，重新上升温度至约37℃。

图3显示实施例中去除了普流尼克水凝胶膜片的面的细胞膜片的放大图像。具体地，图3是利用电子显微镜拍摄去除普流尼克水凝胶膜片的面的明场像的图。

图4显示通过染色确认去除实施例中的普流尼克水凝胶膜片的面的细胞膜片的细胞生存与否的结果。具体地，图4中的染色利用了赛默飞世尔(Thermofisher)公司的哺乳动物细胞存活/死亡试剂盒(Live/Dead mammalian cell kit)，活细胞被钙黄绿素(calcein)AM染色显示成绿色，死细胞被胡米胺同质二聚体(ethidium homodimer-1)染色显示成红色。如图4所示，可以确认即使去除普流尼克水凝胶膜片，仍存活有99％以上的细胞。

进而，利用包含海藻酸盐分解酶的溶液，去除了海藻酸盐水凝胶膜片。

图5显示去除实施例中的海藻酸盐水凝胶膜片的面的细胞膜片的放大图像。具体地，图5是利用电子显微镜拍摄了去除海藻酸盐水凝胶膜片的面的明场像的图。在图5中，一部分凹陷区域被确认为海藻酸盐水凝胶膜片与细胞膜片分离的情形下，细胞膜片的一部分区域被收缩的现象。

图6显示通过染色确认去除实施例中的海藻酸盐水凝胶膜片的面的细胞膜片中细胞生存与否的结果。具体地，图6中的染色利用了赛默飞世尔公司的哺乳动物细胞存活/死亡试剂盒(Live/Dead mammalian cell kit)，活细胞被钙黄绿素(calcein)AM染色显示成绿色，死细胞被胡米胺同质二聚体(ethidium homodimer-1)染色显示成红色。如图6所示，可以确认即使去除海藻酸盐水凝胶膜片，仍存活有99％以上的细胞。

图7显示了拍摄根据实施例的普流尼克水凝胶膜片及海藻酸盐水凝胶膜片全部被去除的细胞膜片的情形。在图4、6及7中可以确认，可以以由完整形态表现出高生存率的方式制备如实施例所示制备的细胞膜片。